AVALIAÇÃO DA REAÇÃO POLIMERASE EM CADEIA (PCR) DIRIGIDA PARA O GENE gD DE AMOSTRAS DO VÍRUS DA DOENÇA DE AUJESZIKY ISOLADAS NAS REGIÕES SUL E SUDESTE DO BRASILRESUMO
Uma reação pela polimerase em cadeia (PCR), baseada no gene que codifica a glicoproteína gD do vírus da doença de Aujeszky (VOA), foi avaliada para o diagnóstico direto do VOA. A aplicação da reação em um painel de 30 amostras do VOA isoladas no período de 1982 a 1996 nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, revelou que um fragmento de DNA de 217 pares de bases foi amplificado a partir do genoma de todas as amostras virais. A especificidade do produto amplificado foi verificada pela análise do seu perfil de restrição com a endonuclease Sal I.
PALAVRAS-CHAVE:
Vírus da doença de Aujeszky; diagnóstico direto; reação em cadeia pela polimerase (PCR); glicoproteina gD.
ABSTRACT
A polymerase chain reaction (PCR) assay, based on the gene that encodes gD glycoprotein of Aujesky's disease virus (ADV), was evaluated for the direct diagnosis of ADV. When applied to a panei of 30 ADV strains isolated in the South and Southeast of Brazil from 1982 to 1996, the reaction was able to amplify a 217 bp DNA fragment from ali ADV strains studied. The specificity of PCR product was confirmed by its restriction endonuclease pattern with Sal I.
KEY WORD:
Aujeszky; virus; direct diagnosis; polimerase chain reaction (PCR); gD glycoprotein.
INTRODUÇÃO
O vírus da doença de Aujeszky (VOA), ou Herpesvirus suíno-l, pertence à família Herpesviridae, Subfamília Alphaherpesvirinae e ao gênero Varicellovirus (Murphy et al.,1995). O VOA infecta inúmeras espécies de mamíferos, determinando elevada letalidade (Wittmann & Rziha, 1989).
Na espécie suína, considerada hospedeiro natural e principal reservatório do vírus, a letalidade da doença de Aujeszky (DA) é dependente da faixa etária dos animais acometidos. A DA em animais jovens caracteriza-se por sintomatologia nervosa e elevada letalidade, ao passo que em ani mais adultos está associada a problemas respiratórios e reprodutivos (Akkermans,1976; Wittmann & Rziha, 1989).
À semelhança de outros herpesvirus, após uma infecção primária o genoma do VOA persiste de forma latente no tecido nervoso do hospedeiro, independentemente do grau de imunidade do animal. Após uma imunossupressão, o vírus pode ser reativado e infectar animais suscetíveis (Klein, 1982; Rziha et al., 1986, Roizmann & Sears,1991 ).
A DA encontra-se presente em praticamente todos os países com suinocultura industrial e é considerada uma das principais patologias infecciosas do suíno devido aos elevados prejuízos econômicos que acarreta (Eloit et al.,1988; Wittmann & Rziha, 1989). O diagnóstico laboratorial direto da infecção pelo VOA tem sido feito pelo seu isolamento em cultivo de células sensíveis (McFerran et al.,1972), ou pela detecção dos antígenos virais em tecidos pelo teste de imunofluorescência (Sabá & Rajcani, 1970). A introdução de técnicas de hibridização permitiu a detecção do genoma do VOA em células hospedeiras infectadas de forma ativa ou latente (Lokensgard et al., 1990).
Mais recentemente, a reação de PCR (Saiki et al.,1985; Saiki et al., 1988) tem sido aplicada como um método direto sensível, rápido e alternativo na detecção de infecções virais, pois permite detectar pequenas concentrações de DNA virai (Gingeras et al., 1990). Vários protocolos de PCR têm sido descritos para detectar seqüências específicas de DNA do VOA (Belak et al. 1989, Jestin et al.,1990; Maes et al., 1990, Hasebe et al., 1993).
Objetivando detectar infecções latentes do VOA em suínos experimentalmente infectados, Galeota-Wheeler & Osorio (1991) desenvolveram uma reação de PCR baseada em uma seqüência conservada do gene que codifica a glicoproteína essencial gD do VOA. A especificidade do fragmento amplificado de DNA, de 217 pares de bases, foi comprovada pela pesquisa de um sítio de restrição de Sal I.
Harding et al. (1997) avaliaram a reação de PCR desenvolvida por Galeota-Wheeler & Osorio (1991) no diagnóstico direto do VOA. Utilizando um painel de 9 amostras do VOA e 13 amostras de herpesvírus relacionados, estes autores verificaram que a reação de PCR detectou todas as amostras de VOA estudadas, não detectando os outros herpesvirus relacionados. Emborà tenha sido confirmada no fragmento amplificado a presença do sítio de restrição para a endonuclease Sal I, estes autores puderam constatar variabilidade nos sítios de restrição de Avall e Sau96I.
Considerando a existência de variabilidade no fragmento de DNA amplificado pela reação de PCR desenvolvida por Galeota-Wheeler & Osorio (1991), o objetivo do presente trabalho foi avaliar esta reação no diagnóstico direto de 30 amostras do VOA isoladas nas regiões Sul e Sudeste do Brasil no período de 1982 a 1996.
MATERIAL E MÉTODOS
Amostras do VOA
Foram utilizadas 30 amostras do VOA de São Paulo, Paraná e Santa Catarina,- To,<las as amostras foram isoladas a partir de tecido cerebral, sendo que 27 foram de origem suína, 1 de origem bovina, 1 de origem canina e 1 de origem felina. As diferentes amostras foram isoladas no período de 1982 a 1996. A amostra Bartha do VOA gentilmente cedida pelos Laboratórios Solvay, foi empregada como amostra padrão do vírus.
Cultivo das amostras do VOA
As amostras do VOA foram isoladas em células da linhagem PK-l 5. Os vírus foram inoculados em garrafas rolantes, com uma área de 1.500 cm2 , contendo 3x109 células em meio mínimo essencial (MEM) acrescido de 10% de soro fetal bovino. Quando as células estavam confluentes, o meio MEM foi retirado e as células foram infectadas com a suspensão virai. Após l hora de adsorção foram adicionados 80 mL de meio MEM e as garrafas foram incubadas a 37ºC, em aparelho roller. Após 24 horas de incubação, quando as células apresentavam 80% de efeito citopático, a suspensão virai foi colhida e congelada em freezer a -70°C.
Cálculo do título infeccioso em cultura de células
O título infeccioso do vírus foi determinado em microplacas, utilizando-se células PK-15 na conc ntração de 3x105 células/cavidade. Foram inoculados em triplicata 10OµL da suspensão virai nas diluições de 10-1 a 10-9 e incubadas por 48 horas a 37ºC. A dose infectante cultura de tecidos (DICT 50) foi estimada pelo metodo do Reed & Muench (1938).
Identificação sorológica das amostras virais pela reação de soroneutralização
A reação de soroneutralização (SN) foi realizada em microplacas, utilizando-se antisoro policlonal de suíno específico para o VOA. Como controle negativo utilizou-se soro normal de suíno. A um volume de 50µL de diluições seriadas do soro foram adicionados 50µL de cada uma das amostras isoladas do vírus de Aujeszky contendo 100 DICT 50• A mistura foi incubada por 1 hora a 37ºC em estufa de CO2 a 5%. A seguir foram adicionados 1 00µL de uma suspensão de 3x105 células PK-15, e a preparação foi incubada por 48 horas a 37ºC. Os títulos dos vírus foram avaliados pelo método de Reed & Muench (1938).
Purificação do vírus
As suspensões virais foram descongeladas e o sobrenadante centrifugado a 16.000 x g por 10 minutos e novamente centrifugado por l hora a 100.000 x g a 4"C, sob um colchão de 3 mL de sacarose 40% em PBS pH 7.2, em rotor Beckman 60 Ti.
Extração do DNA genômico
O sedimento resultante da purificação do virus foi ressuspenso em 1 mL de tampão TNE (Tris 0,01M, EDTA 0,001M, NaCI 0,lM), pH 8,0 contendo 0,5% de SOS e 0,2mg de proteinase K/ mL e incubado em banho maria por 1 hora a 56ºC. À suspensão foram acrescentados 500µL de fenol e, após agitação, a mistura foi centrifugada a 12.000 x g por 3 min. Da fase aquosa foram colhidos 300µL aos quais foram adicionados 100µL de uma solução de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e, após agitação, a mistura foi centrifugada a 12.000 x g por 3 mio. A seguir, 1 00µL da fase aquosa foram precipitados com 10µL de acetato de sódio 3M e 50µL de etanol absoluto a - 20ºC por 12 h. Após centrifugação a 12.000 x g por 30 min. a 4ºC, o sedimento foi seco por 15 min. em rotoevaporador, ressuspenso em 50µL de tampão TE (Tris 0,0lM, EDTA 0,001M) pH 8,0 e estocado a -20ºC.
PCR
A reação de PCR foi realizada em um volume de 10OµL, contendo 10 mM de Tris HCI pH 9.0; 1,5mM de MgC2l, 50mM de KCI, 200µM de cada nucleotídeo, 10µL do DNA extraído; 2,5U da enzima Taq DNA polimerase e 50 pmol de cada um dos primers sense e anti sense descritos por Galeota-Wheeler & Osorio (1 991), respectivamente: 5'CACGGAGGACGAGCTGGGGCT3' e 5'GTCCACGCCCCGCTTGAAGCT3'. As amostras foram inicialmente desnaturadas a 94"C por 5 minutos. A reação de amplificação foi feita por 40 ciclos repetitivos de desnaturação (94ºC por 1 min), anelamento (65°C por 2 min) e extensão (72ºC por 2 min), com uma extensão final de 1 O min a 72ºC para complementação da reação.
Sobrenadantes de células PK-15 não infectadas e a mistura dos reagentes sem o DNA serviram como controles negativo da reação.
A detecção do produto amplificado foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 2%, utilizando uma diferença de potencial de 100 volts por 1 hora. O gel foi corado com brometo de etídio, visualizado em transiluminador U.V. e fotografado em câmara digital (Kodak Digital Science DC-40 Camera).
Especificidade do produto de PCR
A especificidade do DNA amplificado foi verificada pela pesquisa de um sítio de restrição para a endonuclease Sal I. Para tanto, o fragmento amplificado foi digerido com a endonuclease Sall, seguindo as instruções do fabricante (Gibco BRL - EUA). A revelação dos fragmentos de restrição foi feita em eletroforese em gel de agarose, como descrito acima.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da identificação sorológica das amostras de campo do VDA utilizadas neste estudo, pela prova de SN, estão apresentados na Tabela 1. Os títulos de SN observados com soro padrão específico variaram de 32 a 128, sendo portanto considerados altamente específicos (Bitsch & Eskildsen, 1976; Wittmann & Rziha, 1989).
A reação de PCR, baseada em uma sequência conservada do gene que codifica a glicoproteína essencial gD do VDA (Galeota-Wheeler & Osorio, 1991), foi capaz de amplificar um fragmento específico de 217 pares de bases em todas as 30 amostras de campo do VOA estudadas e na amostra padrão Bartha (Fig.1). Não foram observadas amplificações em todos os controles da reação.
Detecção por eletroforese em gel de agarose do fragmento de 217 pb amplificado pela reação de PCR a partir das 30 amostras do VOA estudadas. M = marcador de peso molecular (DNA do fago x 174 digerido com Haeill - Pharmacia); P = amostra de VOA padrão (Bartha); 1 a 30 = amostras do VOA
Detecção por eletroforese em gel de agarose dos fragmentos obtidos pela restrição do produto amplificado pela reação de PCR com a enzima SalI. M = marcador de peso molecular (100 bp ladder - Pharmacia Biotech); 1 = fragmento íntegro; 2 = fragmentos resultantes da digestão com Sal I.
A especificidade de todos os produtos de PCR foi confirmada pela análise do perfil de restrição com a endonuclease Sal I, revelando 2 fragmentos, um de 140 e outro de 77 pares de bases (Galeota-Wheeler & Osorio, 1991). O perfil típico encontra-se na Figura 2.
Os resultados do presente estudo corroboram aqueles obtidos por Harding et al., (1997), os quais também observaram a aplicabilidade da reação de PCR descrito por Galeota-Wheeler & Osorio (1991) na detecção de 9 diferentes amostras de campo do VOA
Embora Harding et al. (1997) tenham demonstrado variabilidade no fragmento amplificado, através da pesquisa de sítios de restrição para Sau96I e Avall, as 30 amostras de campo do VDA utilizadas neste estudo e a amostra padrão Bartha foram detectadas pela reação de PCR empregada.
CONCLUSÃO
A reação de PCR proposta por Galeota-Wheeler & Osorio (1991) demonstrou sua aplicabilidade no diagnóstico direto do VDA, visto ter sido capaz de detectar as 30 amostras do VDA isoladas nas regiões Sul e Sudeste do Brasil no período de 1982 a 1996.
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