Bases moleculares da glomerulopatia diabética

Lagranha, Claudia J.; Fiorino, Patricia; Casarini, Dulce Elena; Schaan, Beatriz D’Agord; Irigoyen, Maria Claudia

doi:10.1590/S0004-27302007000600003

Resumos

O principal determinante da nefropatia diabética é a hiperglicemia, mas hipertensão e fatores genéticos também estão envolvidos. O glomérulo é o foco de lesão, onde proliferação celular mesangial e produção excessiva de matriz extracelular decorrem do aumento da glicose intracelular, por excesso de glicose extracelular e hiperexpressão de GLUT1. Seguem-se aumento do fluxo pela via dos polióis, estresse oxidativo intracelular, produção intracelular aumentada de produtos avançados da glicação não enzimática (AGEs), ativação da via da PKC, aumento da atividade da via das hexosaminas e ativação de TGF-beta1. Altas concentrações de glicose também aumentam angiotensina II (AII) nas células mesangiais por aumento intracelular da atividade da renina (ações intrácrinas, mediando efeitos proliferativos e inflamatórios diretamente). Portanto, glicose e AII exercem efeitos proliferativos celulares e de matriz extracelular nas células mesangiais, utilizando vias de transdução de sinais semelhantes, que levam a aumento de TGF-beta1. Nesse estudo são revisadas as vias que sinalizam os efeitos da glicose e AII nas células mesangiais em causar os eventos-chaves relacionados à gênese da glomerulopatia diabética. As alterações das vias de sinalização implicadas na glomerulopatia, aqui revisadas, suportam dados de estudos observacionais/ensaios clínicos, onde controle metabólico e anti-hipertensivo, especificamente com inibidores do sistema renina-angiotensina, têm-se mostrado importantes - e aditivos - na prevenção do início e progressão da nefropatia. Novas estratégias terapêuticas dirigidas aos eventos intracelulares descritos deverão futuramente promover benefício adicional.

Nefropatias diabéticas; Patogênese; Mecanismos moleculares de ação

The determinant of the diabetic nephropathy is hyperglycemia, but hypertension and other genetic factors are also involved. Glomerulus is the focus of the injury, where mesangial cell proliferation and extracellular matrix occur because of the increase of the intra- and extracellular glucose concentration and overexpression of GLUT1. Sequentially, there are increases in the flow by the poliol pathway, oxidative stress, increased intracellular production of advanced glycation end products (AGEs), activation of the PKC pathway, increase of the activity of the hexosamine pathway, and activation of TGF-beta1. High glucose concentrations also increase angiotensin II (AII) levels. Therefore, glucose and AII exert similar effects in inducing extracellular matrix formation in the mesangial cells, using similar transductional signal, which increases TGF-beta1 levels. In this review we focus in the effect of glucose and AII in the mesangial cells in causing the events related to the genesis of diabetic nephropathy. The alterations in the signal pathways discussed in this review give support to the observational studies and clinical assays, where metabolic and antihypertensive controls obtained with angiotensin-converting inhibitors have shown important and additive effect in the prevention of the beginning and progression of diabetic nephropathy. New therapeutic strategies directed to the described intracellular events may give future additional benefits.

Diabetic nephropathy; Pathogenesis; Molecular mechanisms of action

REVISÃO

Bases moleculares da glomerulopatia diabética

Molecular bases of diabetic nephropathy

Claudia J. Lagranha^I; Patricia Fiorino^I; Dulce Elena Casarini^II; Beatriz DAgord Schaan^III; Maria Claudia Irigoyen^I

^ILaboratório de Hipertensão Experimental, Unidade de Hipertensão, Instituto do Coração, HC-FMUSP

^IILaboratório de Nefrologia, Disciplina de Nefrologia, Escola Paulista de Medicina-UNIFESP, São Paulo, SP

^IIILaboratório de Cardiologia Molecular e Celular do Instituto de Cardiologia, Fundação Universitária de Cardiologia, Porto Alegre, RS

^{Endereço para correspondência} Endereço para correspondência: Maria Claudia Irigoyen Laboratório de Hipertensão Experimental Instituto do Coração-FMUSP Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar 44 05403-000 São Paulo, SP Fax: (11) 3085-7887

RESUMO

O principal determinante da nefropatia diabética é a hiperglicemia, mas hipertensão e fatores genéticos também estão envolvidos. O glomérulo é o foco de lesão, onde proliferação celular mesangial e produção excessiva de matriz extracelular decorrem do aumento da glicose intracelular, por excesso de glicose extracelular e hiperexpressão de GLUT1. Seguem-se aumento do fluxo pela via dos polióis, estresse oxidativo intracelular, produção intracelular aumentada de produtos avançados da glicação não enzimática (AGEs), ativação da via da PKC, aumento da atividade da via das hexosaminas e ativação de TGF-b1. Altas concentrações de glicose também aumentam angiotensina II (AII) nas células mesangiais por aumento intracelular da atividade da renina (ações intrácrinas, mediando efeitos proliferativos e inflamatórios diretamente). Portanto, glicose e AII exercem efeitos proliferativos celulares e de matriz extracelular nas células mesangiais, utilizando vias de transdução de sinais semelhantes, que levam a aumento de TGF-b1. Nesse estudo são revisadas as vias que sinalizam os efeitos da glicose e AII nas células mesangiais em causar os eventos-chaves relacionados à gênese da glomerulopatia diabética. As alterações das vias de sinalização implicadas na glomerulopatia, aqui revisadas, suportam dados de estudos observacionais/ensaios clínicos, onde controle metabólico e anti-hipertensivo, especificamente com inibidores do sistema renina-angiotensina, têm-se mostrado importantes e aditivos na prevenção do início e progressão da nefropatia. Novas estratégias terapêuticas dirigidas aos eventos intracelulares descritos deverão futuramente promover benefício adicional.

Descritores: Nefropatias diabéticas; Patogênese; Mecanismos moleculares de ação

ABSTRACT

The determinant of the diabetic nephropathy is hyperglycemia, but hypertension and other genetic factors are also involved. Glomerulus is the focus of the injury, where mesangial cell proliferation and extracellular matrix occur because of the increase of the intra- and extracellular glucose concentration and overexpression of GLUT1. Sequentially, there are increases in the flow by the poliol pathway, oxidative stress, increased intracellular production of advanced glycation end products (AGEs), activation of the PKC pathway, increase of the activity of the hexosamine pathway, and activation of TGF-b1. High glucose concentrations also increase angiotensin II (AII) levels. Therefore, glucose and AII exert similar effects in inducing extracellular matrix formation in the mesangial cells, using similar transductional signal, which increases TGF-b1 levels. In this review we focus in the effect of glucose and AII in the mesangial cells in causing the events related to the genesis of diabetic nephropathy. The alterations in the signal pathways discussed in this review give support to the observational studies and clinical assays, where metabolic and antihypertensive controls obtained with angiotensin-converting inhibitors have shown important and additive effect in the prevention of the beginning and progression of diabetic nephropathy. New therapeutic strategies directed to the described intracellular events may give future additional benefits.

Keywords: Diabetic nephropathy; Pathogenesis; Molecular mechanisms of action

O DIABETES MELLITUS É UMA DOENÇA crônico-degenerativa cuja prevalência mundial em 1995 foi de 4% (135 milhões de portadores), sendo projetada para o ano de 2025 uma estimativa de 5,4% (300 milhões de portadores), representando um aumento na incidência de 122% (1). No Brasil, esta taxa, em 1986, correspondeu a 7,6% da população urbana com mais de 30 anos (2), mas dados mais atualizados, especificamente do RS, mostram quase o dobro desta prevalência (12,4%) (3), confirmando as tendências mundiais apresentadas.

Os indivíduos com diabetes têm alto risco para a doença macrovascular e esta é sua principal causa de morte (4). Diversos fatores de risco são passíveis de prevenção e tratamento, como a nefropatia diabética e a hipertensão arterial sistêmica. A nefropatia diabética acomete cerca de 40% dos pacientes com diabetes, sendo a principal causa de insuficiência renal naqueles que ingressam em programas de diálise. A mortalidade dos pacientes diabéticos em programas de hemodiálise é maior do que a dos não diabéticos. Cerca de 40% dos pacientes morrem no primeiro ano de tratamento, principalmente por doença cardiovascular (5), e o custo do tratamento de insuficiência renal crônica é elevado.

A nefropatia diabética incipiente caracteriza-se por microalbuminúria, enquanto que a nefropatia clínica se caracteriza por macroalbuminúria ou proteinúria persistentes. Nesta fase, a progressão inexorável à insuficiência renal crônica e necessidade de diálise e/ou transplante renal eram a regra, mas o controle metabólico intensivo (6), tratamento rigoroso da hipertensão arterial e o uso de drogas com efeito bloqueador do sistema renina-angiotensina-aldosterona (7) têm sido estratégias eficazes na redução da incidência e desaceleração da progressão da doença (8). No entanto, ainda um número considerável de pacientes desenvolve esta complicação e suas mais graves conseqüências, sendo necessária a identificação dos mecanismos envolvidos na sua gênese para se obter prevenção e tratamento mais eficientes.

O principal determinante na gênese e progressão da nefropatia diabética é a hiperglicemia (6), processo que pode ser modificado por susceptibilidade genética (9) e acelerado por outros fatores, especialmente a hipertensão arterial sistêmica (10). Os efeitos no rim ocorrem especificamente nos glomérulos, foco principal de lesão na nefropatia diabética. O diabetes seletivamente lesa células cujo transporte de glicose não se reduz com a hiperglicemia, como é o caso das células mesangiais, endoteliais da retina e neurônios de nervos periféricos, acarretando maior concentração intracelular de glicose. Vários são os mecanismos envolvidos no dano tecidual causado pela hiperglicemia: aumento do fluxo pela via dos polióis, o que aumenta a sensibilidade ao estresse oxidativo intracelular, produção intracelular aumentada de produtos avançados da glicação não enzimática (AGEs), ativação da via da PKC e aumento da atividade da via das hexosaminas (11).

Estudos histopatológicos em humanos e em animais de experimentação verificaram que o processo de esclerose dos glomérulos renais inicia-se com a proliferação de células mesangiais, que produzem excessivamente componentes da matriz extracelular, cujo depósito excessivo é a via final comum de várias doenças renais, inclusive a diabética (12). Os principais componentes da matriz extracelular são fibronectina, laminina, tenascina e colágeno (tipo IV, V e VI) (13). Entretanto, no glomérulo esclerótico, além desses componentes há também acúmulo de colágeno tipo I e tipo III, que geralmente não são detectados na matriz extracelular do glomérulo normal (14). O colágeno tipo IV é a proteína mais abundante na matriz mesangial (12) e sua deposição aumenta com a gravidade da doença glomerular (15). A tenascina, outra proteína da matriz mesangial normal, pode também ser encontrada em situações patológicas e seu acúmulo é proporcional ao grau de esclerose glomerular (16).

Conforme proposto por Brownlee, em sua Banting Lecture apresentada em 2004 (11) sobre os mecanismos patofisiológicos do diabetes, 4 principais mecanismos são desencadeados pelo aumento da glicose intracelular e a partir daí são responsáveis pela gênese das complicações crônicas do diabetes: 1) aumento do fluxo pela via dos polióis, gerando estresse oxidativo, 2) aumento dos produtos avançados da glicação não enzimática (AGEs), gerando aumento de glicação de proteínas plasmáticas e da matriz extra-celular, 3) ativação da via da PKC, gerando aumento de citocinas, estresse oxidativo e fatores proliferativos, e 4) aumento do fluxo pela via das hexosaminas, gerando aumento de citocinas. O fato de que pacientes tratados com drogas que bloqueiam um desses mecanismos não terem como resultado a prevenção completa das complicações crônicas, assim como não haver relação aparente entre os 4 mecanismos citados, levou o autor a propor um mecanismo unificador. Este está representado pelo aumento de estresse oxidativo na mitocôndria induzido pelo aumento da glicose intracelular, o qual leva à quebra das fitas do DNA nuclear, que ativa a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP). Esta modifica a atividade de uma enzima-chave da via glicolítica, a gliceraldeído-3-fosfato (GADPH), reduzindo sua atividade, o que ativa a via dos polióis, aumenta a formação de AGEs, ativa a PKC e aumenta o fluxo pela via das hexosaminas. Estes mecanismos estão sumarizados na figura 1.

EVENTOS MOLECULARES DA LESÃO GLOMERULAR ASSOCIADOS À ELEVAÇÃO DA GLICOSE

O advento e a popularização de novas metodologias ao longo das duas últimas décadas vem possibilitando um enorme avanço no conhecimento das bases moleculares de processos biológicos. Uma das conseqüências imediatas deste avanço é a unificação progressiva dos vários ramos da biologia experimental, permitindo que a biologia molecular, biologia celular, bioquímica, genética e fisiologia desenvolvam-se de maneira indistinta através de abordagens experimentais. Esta revolução nas ciências básicas nos permite identificar e caracterizar eventos moleculares que até o momento permaneciam pouco elucidados.

As células mesangiais glomerulares desempenham papel fundamental na manutenção da estrutura e funcionamento fisiológico normal dos glomérulos. Estudos in vitro utilizando células mesangiais cultivadas em meios com alta concentração de glicose demonstraram maior expressão de mRNA e síntese protéica de colágeno tipo IV e fibronectina (17), alterações que são mediadas pela ativação da PKC (18). A glicose entra para o interior da maioria das células, inclusive as mesangiais, por difusão facilitada. Este processo é mediado por proteínas integrais de membrana específicas, os transportadores de glicose (GLUTs) (19). Estudos com células mesangiais in vitro demonstraram maior expressão de GLUT1 em meios com alta concentração de glicose, maior atividade da PKC e conseqüente estímulo à síntese de proteínas da matriz extracelular (20).

Estudos de nosso grupo demonstraram, in vivo, no modelo de diabetes por STZ em ratos, maior expressão de GLUT1 em córtex renal, associado à maior excreção urinária de TGF-b1 e microalbuminúria (21). O GLUT2, principal transportador responsável pela reabsorção tubular de glicose, também se encontra expresso no diabetes experimental (22), favorecendo aumento da glicose intersticial, a qual é transportada então para o interior das células mesangiais pela ação do GLUT1 (figura 1). No modelo animal de hipertensão geneticamente determinada (ratos SHR) com diabetes por STZ, os resultados foram semelhantes, além de se observar um efeito aditivo da hipertensão sobre a hiperglicemia em aumentar a expressão de GLUT1 e GLUT2 (21). Estudos in vitro identificaram o GLUT1 como o principal transportador de glicose nas células mesangiais de camundongos (23) e humanos (24). Um transporte de glicose aumentado através da membrana celular pode, portanto, amplificar os efeitos da hiperglicemia característica do diabetes, contribuindo para a gênese da glomerulopatia diabética.

Conforme Leehey e cols. (25), em sua revisão, experimentos in vitro com células mesangiais demonstraram que o aumento na expressão de GLUT1 induz a uma retroalimentação positiva, aumentando ainda mais a expressão de GLUT1, ativando a PKC, promovendo uma estimulação prejudicial da síntese de matriz extracelular em células mesangiais. Com isso, a elevação na expressão de GLUT1 parece ser o passo limitante para o uso de glicose pelas células mesangiais.

Nose e cols. (26) foram os primeiros a demonstrar que a angiotensina II (AII) aumenta a expressão e o acúmulo de RNA mensageiro (RNAm) de GLUT1 em células mesangiais. Estes autores também mos-traram que o efeito estimulador da AII é principalmente mediado pelo processamento e liberação da heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) via ativação das metaloproteinases (MMP) com ligação ao receptor (EGF-R), seguido da ativação da via de sinalização da ERK. Previamente, estudos desse mesmo grupo (27) já haviam demonstrado que a ativação de ERK mediava a indução da expressão de fibronectina estimulada pela AII em células mesangiais, e que a fosforilação de ERK ocorre depois da ativação do receptor de EGF pela ligação da heparina ao receptor. Nesse mesmo estudo, verificou-se que a transativação do EGF-R era mediada pelo receptor AT1 para AII.

Estudos mostram que as células mesangiais possuem todos os componentes do sistema renina-angiotensina (SRA), incluindo renina, angiotensinogênio, receptor tipo 1 de AII (AT1), ECA somática e ECA N-domínio (28,29), sugerindo a existência de um SRA intra-renal que parece ser regulado independentemente do SRA convencional presente na circulação sangüínea (30). Conforme Leehey e cols. (25) sugerem, as células mesangiais podem não necessitar de ECA para a síntese de AII, e podem utilizar outras peptidases para converter a angiotensina I (AI) em AII. Além das células mesangiais, todos os componentes do SRA foram detectados em células epiteliais do túbulo proximal (31), células endoteliais glomerulares (32) e células do ducto coletor (33). Em especial, sabe-se que a ECA N-domínio encontra-se localizada no núcleo das células mesangiais em cultura primária e é responsável pela transcrição de novos genes (34).

As células mesangiais são capazes de sintetizar fatores que promovem sua mitogênese in vitro, como a interleucina I (IL-I) (35) e o fator de crescimento semelhante ao fator de crescimento derivado de plaquetas. Efeitos mitogênicos também são descritos na presença do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), insulina (36), EGF (epidermal growth factor), TGF-b, prostaglandina F_2a (PGF_2a) e endotelina (37).

A ação do TGF-b depende de sua concentração: em pequenas concentrações, é mitogênico, mas em altas concentrações inibe a proliferação celular, as prostaglandinas, nucleotídeos cíclicos e o tromboxano A₂, que possuem atividades anti-mitogênicas sobre a cultura de células mesangiais. Alguns constituintes da própria matriz extracelular exercem efeitos sobre as células mesangiais: a fibronectina, uma glicoproteína de adesão, promove a proliferação celular (38), enquanto os proteoglicanos inibem o crescimento das células mesangiais (39), sugerindo que alguns elementos da matriz possuam um papel na regulação do crescimento celular. De fato, Righetti e cols. (40) mostraram acúmulo precoce de fibronectina em córtex renal de animais SHR tornados diabéticos.

Estudos in vitro mostram que meio de cultura com alta concentração de glicose exerce influência sobre o crescimento de células renais e sobre o crescimento da matriz extracelular, de forma semelhante ao que ocorre in vivo (41). Além disto, altas concentrações de glicose em culturas de células mesangiais de ratos aumentam a produção de AII (42).

Vidotti e cols. (29) demonstraram que, em condições basais, as células mesangiais secretam pró-renina, mas na presença de altas concentrações de glicose ocorre um decréscimo desta secreção. Após um tempo de 72 horas de exposição das células mesangiais ao meio contendo alta concentração de glicose, somente o RNA mensageiro da ECA e angiotensinogênio estão elevados. Esses resultados sugeriram que altas concentrações de glicose induzem aumento da geração de AII nas células mesangiais em decorrência do aumento intracelular da atividade da renina mediado por três fatores: estimulação tempo-dependente da transcrição do gene da pró-renina, redução da secreção da pró-renina e aumento da conversão da pró-renina em renina ativa, mediado pela catepsina B.

O aumento do RNA mensageiro do angiotensinogênio em paralelo ao aumento da atividade da renina indica que a alta concentração de glicose também aumenta os níveis do substrato para a renina, sugerindo que, ao lado da renina, a ECA está diretamente envolvida no aumento da AII nas células mesangiais. A produção de AII pelas células mesangiais sob estimulação da glicose faz com que este hormônio tenha ações intrácrinas mediando os efeitos proliferativos e inflamatórios diretamente, com conseqüente proliferação celular, expansão de matriz e inflamação, contribuindo diretamente com a esclerose glomerular observada na nefropatia diabética (29).

Como vimos acima, ambas, glicose e angiotensina II, parecem exercer efeitos similares sobre células mesangiais em cultura, promovendo o crescimento celular, proliferação da matriz extracelular e inibindo a sua degradação (29). Possivelmente glicose e AII utilizam semelhantes vias de transdução de sinais, que em última análise levam a um aumento da produção celular de TGF-b (32).

O aumento de glicose em culturas de células ativa mecanismos e vias que levam ao aumento da transcrição do TGF-b1 em células mesangiais; entre as conhecidas está a ativação da via MEK-ERK (43) e a ativação da PKC. Além do aumento de glicose no meio de cultura, sabe-se que a AII também tem efeito estimulador da transcrição e ativação do TGF-b1 (44). Uma vez ativado nas células mesangiais, o TGF-b1 pode determinar aumento na apoptose dessas células (45), da proliferação celular (46), da formação e deposição de proteínas de matriz como laminina, fibronectina e colágeno do tipo I e do tipo IV (47,48), diminuição da degradação das proteínas de matriz por aumento da expressão de PAI-1 (inibidor do ativador de plasminogênio-1), induzindo assim esclerose glomerular (37,43).

Os mecanismos pelos quais o aumento de glicose no meio de cultura pode induzir disfunção nas células mesangiais, e outros tipos celulares, envolvem aumento da síntese autócrina de fatores de crescimento (TGF-b1, AII, fator de crescimento derivado de plaquetas e endotelina 1) ou alteração das vias de sinalização como a da PKC (49). Esses fatores de crescimento, além de poder promover diretamente a alteração de vias de sinalização intracelulares, estimulam a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), que por sua vez podem atuar como segundo mensageiro (50). Além desses efeitos, o aumento de glicose no meio de cultura promove alteração na sinalização de Ca²⁺ nas células mesangiais. Mené e cols. (51) demonstraram que o influxo de cálcio estava reduzido em meios com alta concentração de glicose. Seguindo essa mesma linha de estudo, Hua e cols. (52) demonstraram que a elevação de glicose no meio suprime a sinalização de Ca²⁺ em resposta à endotelina 1, e sugerem que esse efeito está associado à modulação das sub-unidades da PKC (PKC-b e PKC-d) e da produção de ROS pelas células mesangiais.

Xu & Kyriakis (53) demonstraram que AGEs em cultura de células mesangiais estimulam a fosforilação de ERK via ativação da sub-unidade K-Ras, de maneira dependente da ativação de PI3K, proteína efetora de Ras na maioria das, mas não em todas as, vias de sinalização (54). Inibidores farmacológicos de Ras têm sido extensivamente utilizados em estudos para a terapia do câncer, e pesquisadores sugerem que esses inibidores também poderiam ser úteis na prevenção de doenças renais (55).

Resultados anteriores de Danesh e cols. (56) demonstraram que as células mesangiais expostas a meios com alta concentração de glicose apresentavam maior proliferação e expressão das proteínas da família das GTPases, Ras e Rho. Nesse mesmo estudo, foi observado que o co-tratamento das células mesangiais com um inibidor da HMG-CoA redutase, a simvastatina, revertia os efeitos causados pela elevação da glicose no meio na indução de Ras e Rho e na proliferação. O processo de prenilação é insuficiente para a translocação e localização na membrana das isoformas de Ras, necessitando de um sinal adicional para sua ativação. Danesh e cols. (56) sugerem que o sinal adicional pode ser tanto promovido pelo farnesil como pelo geranilgeranil, que são modificações nos lípides indispensáveis pela ancoragem funcional da proteína Ras na membrana plasmática.

Outra família de proteína relacionadas às GTPases são as Arfs, que podem modular o recrutamento de proteínas quinases de membrana e ativar eventos de sinalização via interação com a PKC. Já foi demonstrado que o diabetes induz alterações no fenótipo das células mesangiais por ativação das isoformas de PKC. Padival e col. (57) demonstraram, em células mensagiais cultivadas com alta concentração de glicose no meio de cultura, aumento da presença de PKCb1 e Arf 6 na membrana, e sugeriram que Arf 6 poderia atuar nas alterações do fenótipo das células mesangiais associadas à glomerulopatia diabética.

Lin e cols. (58), estudando outras proteínas da família das GTPases, avaliaram a indução de fibronectina pela alta glicose em células mesangiais. Neste estudo, descreveram a expressão e ativação de Rap 1b e a importância de PKC e Raf na síntese de fibronectina, e demonstraram que a alta concentração de glicose causa ativação específica de Rap 1b, uma vez que Rap 2b permaneceu inalterada neste ambiente. Além disso, demonstraram que Rap1b estimula a síntese de fibronectina e que esse efeito da alta concentração de glicose na Rap e fibronectina é dependente de PKC e de Raf, e independente de PDGF, sugerindo um novo caminho de aumento de produção de proteínas de matriz estimulado pela alta concentração de glicose que é PKC-Rap1b-Raf (58).

Schnaper e cols. (59), avaliando as proteínas de matriz, demonstraram que o TGFb1 está relacionado com o acúmulo de colágeno tipo 1 por estimulação via Smad. Em outro estudo, demonstraram que TGFb1 rapidamente induz rearranjo do citoesqueleto das células mesangiais por aumento das fibras de estresse (a-actina), por promover a redistribuição e a união do complexo de adesão focal, como também por modular a proteína Rho da família das GTPase. Esses autores verificaram que a inibição de Rho por toxina B C. difficile ou por Y-27632 bloqueava o efeito deletério do TGF-b1 na estimulação da expressão de colágeno do tipo I (60).

EVENTOS MOLECULARES DA LESÃO GLOMERULAR DO DIABETES ASSOCIADOS AO ÓXIDO NÍTRICO

Em modelos experimentais de glomerulopatia, desconsiderando-se o mecanismo de lesão renal, o óxido nítrico (NO) tem sido identificado como um potencial regulador do controle da proliferação das células mesangiais (61), o que implicaria em seu papel de modificar a deposição de matriz extracelular no mesângio, contribuindo para a progressão das anormalidades glomerulares (62).

A importância do tempo de exposição à alta concentração de glicose, tanto em cultura de células como em modelos experimentais in vivo, são importantes no entendimento da fisiopatologia do óxido nítrico nas modificações glomerulares (63).

O óxido nítrico é uma molécula gasosa e reativa com uma meia-vida de poucos segundos, formado a partir do aminoácido L-arginina em uma reação de oxidação catalisada por uma família de enzimas denominadas de óxido nítrico sintases (NOS) (64). Duas destas isoenzimas são dependentes de cálcio e expressas constitutivamente nas células endoteliais (eNOS ou tipo III NOS) e nas células neuronais (nNOS ou tipo I NOS), e a expressão da terceira isoenzima (iNOS ou tipo II NOS), independente da presença de cálcio, é dependente de um estímulo imunológico ou inflamatório, podendo ser expressa em uma variedade de células (65). A ação do óxido nítrico não se dá através da utilização de receptores celulares, apenas difunde-se pela membrana celular ativando seu segundo mensageiro, guanilato ciclase, que por sua vez atua sobre proteínas-alvo ativando várias cascatas de proteínas quinases, incluindo as vias da MAPK, JAK e JNK (66). Essas respostas intracelulares desencadeiam efeitos fisiológicos importantes, como o de ser um potente vasodilatador, com importante repercussão tanto na regulação da pressão arterial quanto na função renal (67).

O óxido nítrico também pode reagir com espécies reativas de oxigênio (68), atuando nas vias de sinalização de fatores de crescimento, como o NGF e VEGF (69), ou reagindo diretamente com o ânion superóxido formando peroxinitrito, potente oxidante celular, envolvido na progressão da doença renal.

Na progressão do diabetes, observa-se acúmulo progressivo dos AGEs associado com a hiperglicemia (70). Estudos recentes demonstraram que os AGEs induzem a expressão da iNOS em células mesangiais, pela ativação das citocinas NF-kB e p38 MAPK (71). Noh e cols. (72) também demonstraram que, em cultura de células mesangiais, o ambiente rico em glicose aumentava a expressão da iNOS e que esta, por sua vez, induzia a expansão extracelular pelo aumento da deposição de fibronectina.

Em glomérulo isolado de animais diabéticos, observou-se correlação entre a ativação da PKC e a supressão do óxido nítrico. Em cultura de células mesangiais, verificou-se aumento das proteínas de matriz mediado pela PKC e redução do GMPc. O aumento da PKC relaciona-se aos níveis celulares aumentados de diacilglicerol, maior modulador endógeno das vias glicolíticas da metabolização da glicose. Em conjunto, estas observações sugerem que o prejuízo da formação do GMPc, mediado pela redução do óxido nítrico, em resposta ao aumento da PKC em ambiente rico em glicose, pode representar uma importante via pela qual a toxicidade da glicose é traduzida em aumento da susceptibilidade celular no diabetes (73).

Veelken e cols. (74) mostraram que, no diabetes experimental de 2 semanas induzido por estreptozotocina, o aumento da expressão e da atividade da eNOS, tanto em glomérulo quanto na arteríola aferente, seria a causa do aumento do óxido nítrico que, por sua vez, levaria à hiperperfusão glomerular, contribuindo para iniciação da nefropatia diabética. Em cultura de células mesangiais, altas concentrações de glicose estimulavam a expressão tanto do RNA mensageiro quanto da proteína da iNOS via ativação da PKC, promovendo acúmulo da matriz extracelular, corroborando as avaliações in vivo (72). Khamaisi e cols. (75) mostraram tendência ao aumento da expressão da eNOS no córtex renal após 1 semana de diabetes, mantendo tal aumento após 2 a 8 semanas. A expressão da isoforma nNOS, por sua vez, foi reduzida em 52% após 2 semanas de diabetes (75).

A fosforilação da eNOS pela PKC reduz sua atividade catalítica (76), que, por sua vez, seria acompanhada pela fosforilação da Thr495 e desfosforilação da Ser1177 (77). Tal interação entre PKC e eNOS sugere uma forte associação entre diabetes e redução da NOS renal. Por outro lado, em cultura de CMS, a alta concentração de glicose leva ao aumento de citocinas que estimulam a síntese da iNOS, principalmente mediada pela PKC e aldose redutase, promovendo expansão da matriz extracelular pela deposição de fibronectina (72).

Em células endoteliais, a Akt tem sido identificada como uma das responsáveis pela ativação da eNOS, independentemente da presença do cálcio (78), através da fosforilação da Ser1177/1179. Feliers e cols. (79) descreveram aumento da fosforilação da tirosina em proteínas de córtex renal em camundongos geneticamente modificados, com diabetes (db/db), como a PI3K, Akt e ERK1/2.

Trabalhos in vitro têm demonstrado que a eNOS é regulada por uma via coordenada de fosforilação e desfosforilação de resíduos de aminoácidos, como a tirosina, serina e treonina (80). Por exemplo, a fosforilação da Ser1177/1179 leva à ativação da enzima NOS (81), enquanto que a fosforilação da Thr495 tem efeito oposto, desativando a NOS (80). No diabetes, várias vias de sinalização podem estar alteradas, influenciando a fosforilação da eNOS e, provavelmente, das demais isoformas da NOS.

O aumento da expressão da iNOS relaciona-se de forma geral com o processo inflamatório que acompanha a nefropatia diabética, não tendo papel na hemodinâmica renal normal. Por outro lado, a eNOS, expressa nas células endoteliais glomerulares, além de contribuir de forma expressiva com o óxido nítrico para as funções renais normais, parece estar envolvida nos estágios iniciais da nefropatia. Tal controvérsia envolve o modelo e espécies experimentais estudados, o tempo do diabetes, controle metabólico, tratamento ou não com insulina e, principalmente, o método de avaliação do óxido nítrico ou da enzima NOS utilizados.

O papel do óxido nítrico na nefropatia diabética ainda não está claro. Sabe-se, entretanto, que está envolvido tanto na fase precoce quanto na tardia da doença renal. Chin e cols. (82) sugerem que esta aparente ambigüidade da ação do óxido nítrico deva-se a efeitos diferentes: o óxido nítrico teria um efeito direto induzindo a nitrosilação de proteínas envolvidas na proliferação celular, e um efeito indireto modulando a atividade e/ou produção de outros mensageiros celulares, que por sua vez inibiriam a proliferação celular. Esta idéia sugere que o óxido nítrico em condições fisiológicas, na ausência de estímulo, não estaria envolvido na modulação do crescimento celular, ao passo que, na presença de estímulo, o aumento do óxido nítrico teria papel importante regulando o crescimento celular.

EVENTOS MOLECULARES DA LESÃO RENAL ASSOCIADOS AO SISTEMA RENINA-ANGIOTENSINA

O SRA vem sendo extensivamente estudado no diabetes, com alguns resultados conflitantes: aumento, diminuição ou não alteração do SRA (32). Estas discrepâncias podem ser explicadas devido à quantidade de fatores que influenciam o SRA e diferentes espécies e estágios da doença estudados (25), bem como o nível glicêmico estabelecido durante a doença (30).

Vários modelos de diabetes mostram que o nível renal de renina está elevado em relação aos níveis plasmáticos, sugerindo uma diminuição na liberação renal de renina na circulação (83). Estudos com micropunção mostram que a concentração de AII em diversos compartimentos intra-renais é muito maior do que a concentração sistêmica (84). Sendo assim, a atividade da renina plasmática pode não refletir corretamente a condição do SRA no rim (85).

Resultados obtidos de experimentos realizados em ratos diabéticos sugerem que o uso de um agente anti-hipertensivo específico (inibidores da ECA) pode preservar a função e a estrutura renal independente de seus outros efeitos na pressão sangüínea sistêmica (86). Nestes animais, o uso de agentes anti-hipertensivos convencionais preveniu parcialmente o desenvolvimento de glomeruloesclerose. Entretanto, o uso de captopril (inibidor da ECA) preveniu completamente o desenvolvimento de glomeruloesclerose. O possível mecanismo de proteção postulado seria a diminuição do efeito constritor tônico da AII na arteríola eferente, levando à diminuição da pressão intracapilar glomerular e ao bloqueio dos efeitos da AII sobre o crescimento celular e produção de matriz extracelular no rim (87).

Estudos recentes têm ampliado nosso conhecimento sobre eventos celulares mediados pela AII, sugerindo que seu papel biológico é tão amplo que vai do intracelular ao tecido ou ao sistema. Apesar da AII ser a substância ativa mais importante do SRA, outras angiotensinas produzidas têm ações específicas e, entre as melhores caracterizadas até o momento, incluem-se as angiotensinas III e IV e a angiotensina (1-7) (88). Todas estas angiotensinas podem ser produzidas a partir do mesmo precursor, o angiotensinogênio, por ação da renina e outras reações enzimáticas. Entre estas, a angiotensina (1-7) tem sido a mais estudada, geralmente apresentando efeitos opostos aos da AII, levando à vasodilatação mediada por óxido nítrico, potenciando o efeito hipotensor da bradicinina, facilitando o reflexo presso-receptor e participando do efeito antitrombótico de drogas como captopril e losartan (88).

Além das funções já caracterizadas, a AII vem sendo considerada como uma citocina multifuncional com propriedades não-hemodinâmicas, entre as quais a de fator de crescimento, de citocina pró-fibrinogênica e pró-inflamatória (89), e moduladora da resposta imunológica, como a quimiotaxia, a proliferação e a diferenciação de monócitos em macrófagos (90). De fato, a AII tem vários efeitos como induzir a adesão de leucócitos a células endoteliais, modular a expressão de e-selectina, uma molécula de adesão que está implicada no contato inicial entre leucócitos e endotélio e que desempenha um papel importante no processo de rolamento de leucócitos e, conseqüentemente, na inflamação (91).

No modelo de hipertensão induzido por altas concentrações plasmáticas de AII observam-se lesões teciduais decorrentes de seu efeito vasoconstritor, aumento da secreção de endotelinas e aldosterona e disfunção endotelial pela produção de estresse oxidativo, e pelo aumento da adesão de leucócitos às células endoteliais (92). Além disso, vários estudos demonstraram que o bloqueio da ação da AII previne a inflamação, a expressão de MCP-1 e a infiltração de monócitos na parede arterial, assim como diminui a resposta inflamatória renal e a hipertensão arterial (93).

A maioria das ações clássicas da AII é mediada pelo receptor AT₁ (94). Em ratos hipertensos transgênicos (com genes de renina e angiotensinogênio humanos), o tratamento com inibidores da enzima conversora ou com inibidores do receptor AT₁ preveniu o desenvolvimento de albuminúria, recrutamento de monócitos e resposta vascular inflamatória (95). Demonstrou-se, também, que a estimulação de receptores AT₁ provoca hipertrofia e aumento da síntese de matriz extracelular em células musculares lisas (96).

Amiri e cols. (97) demonstraram que a alta concentração de glicose potencializa os efeitos das AII na indução da ativação de JAK2 (fosforilação em resíduo de tirosina), o qual é acompanhado da fosforilação em tirosina e/ou serina de STAT1 e STAT3 em células mesangiais e células de musculatura lisa de vaso. A ativação de JAK2 é essencial para a indução da produção de colágeno tipo IV e proliferação induzida tanto pela alta concentração de glicose como também pela AII. Além disso, estudos desse mesmo grupo demonstraram que a ativação de JAK2 e STAT1 é um processo necessário para a indução da produção de TGF-b1 e fibronectina estimulada pela alta concentração de glicose nas células mesangiais (98).

Banes e cols. (99) demonstraram que a alta concentração de glicose estimula a fosforilação de JAK2, STAT1 e STAT3 in vivo, e que a fosforilação destas proteínas era reduzida quando os ratos eram tratados com o inibidor de AT1 (candesartan) e pelo inibidor de JAK2 (AG490). Em adição, este estudo demonstrou que em ratos diabéticos a administração de AG490 reduziu tanto a pressão sistólica quanto a excreção urinária de proteína (99). Esses resultados indicam uma importante relação entre a via de sinalização JAK/STAT, a indução da produção de proteínas de matriz e a proliferação de células mesangiais, eventos presentes na nefropatia diabética.

Recentemente, Banes-Berceli e cols. (100) demonstraram que a utilização de simvastatina suprimia os efeitos da alta concentração de glicose e da AII na ativação de JAK2, STAT1 e STAT3 em células mesangiais in vitro e em glomérulo de ratos diabéticos in vivo. Concomitantemente, este estudo mostrou que a simvastatina promovia a redução na produção de colágeno tipo IV em células mesangiais exposta a altas concentrações de glicose sozinha ou associada com AII, além de demonstrarem que o tratamento com a simvastatina em ratos diabéticos também reduzia a excreção de proteínas.

EVENTOS MOLECULARES DA LESÃO RENAL ASSOCIADOS AOS LÍPIDES

Desde Kimmelstiel & Wilson (101), com a descrição da glomeruloesclerose nodular clássica e da presença de depósitos de lípides nos rins diabéticos, vários pesquisadores também já verificaram depósito de lípides em rins diabéticos de humanos ou animais experimentais, e estes pesquisadores propõem que depósito lipídico pode ser um fator na patogênese da doença renal diabética (102).

A alta concentração de glicose, AII, noradrenalina, bradicinina, TGF-b e o PDGF podem ativar fosfolipases intracelulares (fosfolipase A2), promovendo a formação de ácido araquidônico, que pode ser metabolizado pelas ciclooxigenases, citocromos P-450 (CYP) e lipooxigenases (LO) (103). A metabolização do ácido araquidônico catalisado pelas CYP é uma importante via de formação de mediadores autócrinos e parácrinos de numerosos efeitos biológicos.

A ômega hidroxilação do ácido araquidônico gera níveis significativos de 20-ácido hidroxieicosatetraenóico (20-HETE) e ácido epoxieicosatrienóico estéreo específico (EETs) em vários tecidos, principalmente em vasculatura, pulmão e túbulos renais (104). O 20-HETE apresenta vários efeitos; em célula muscular lisa inibe a condutância de cálcio ativado pelos canais de potássio, resultando em despolarização das células lisas (105).

O aumento na expressão e função de CYP subtipo 4A (CYP4A) foi documentado em rim de animais diabéticos (104). Zangar & Novak (106) demonstraram que a elevação intracelular de ácidos graxos durante o diabetes contribuía com os efeitos no CYP4A. Em adição a esses achados, Kroetz e cols. (104) demonstraram que a ativação de PPARa é um passo necessário nos efeitos da diabetes para a transcrição de CYP4A. Kroetz & Xu (107) sugerem que baixas produções renais de 20-HETE em diabetes podem promover efeitos protetores por reduzir as ações vasoconstritoras desses eicosanóides.

As LO são enzimas da família que não contêm o grupo ferro no heme (nonheme iron-containing enzymes) e que insere o oxigênio molecular nos ácidos graxos poliinsaturados (108). Kang e cols. (109) demonstraram que a expressão do gene da enzima 12/15 lipoxigenase e sua proteína aumentavam pela elevação da concentração de glicose em células mesangiais. Além disso, demonstraram que a expressão de fibronectina do glomérulo de ratos estava associada com o aumento da expressão de 12-lipooxigenase, implicando essa enzima na patogênese da nefropatia diabética.

Reddy e cols. (110) demonstraram que lípides oxidados, tais como o 12(S)-ácido hidroxieicosatetraenóico [12(S)-HETE], podem diretamente induzir em células mesangiais hipertrofia e a produção de proteínas de matriz extracelular, com efeito similar ao da AII. Além disso, esses pesquisadores demonstraram que tal efeito acontece porque o 12(S)-HETE é capaz de ativar a p38MAPK e o fator de transcrição nuclear CREB (cAMP-responsive element-binding protein), sugerindo dessa forma que a ativação de 12-lipooxigenase e produção de 12(S)-HETE podem estar envolvidos em múltiplos eventos relacionados com o desenvolvimento da nefropatia diabética.

Sun e cols. (111), por sua vez, usando o modelo estreptozotocina para indução de diabetes em ratos, demonstraram que os depósitos de lípides ocorrem sem qualquer alteração nos níveis séricos de colesterol ou triglicerídeos. Além disso, verificaram que o aumento renal dos depósitos de lípides estava correlacionado com o aumento da expressão da proteína ligante do elemento responsível a esteróides -1 (SREBP-1), o que resultava num aumento da expressão da enzima-chave na síntese de ácido graxo (ácido graxo sintase) e num aumento no acúmulo de triglicerídeos. Neste mesmo estudo, os autores verificaram que o acúmulo de triglicerídeos e o aumento da expressão do SREBP-1 induziam aumento da expressão do TGF-b1 e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), como também aumento de colágeno e de fibronectina, o que pode resultar na glomeruloesclerose e na proteinúria.

A significância clínica do aumento dos conteúdos de lípides nas doenças renais está no desenvolvimento da esclerose glomerular, que pode progredir para a insuficiência renal (112). O efeito potencial das triglicérides como mediador de doenças renais diabéticas é ilustrado nos estudos com pacientes diabéticos que fazem tratamentos com agonistas de PPARa e que apresentam redução nas concentrações séricas de triglicérides, resultando também em uma significante redução para proteinúria, um marcador clínico para a injúria renal diabética (113).

Os PPARs (receptores ativados por proliferadores de peroxissoma) são fatores de transcrição de uma superfamília de receptores nucleares, caracterizados por seu padrão de distribuição nos tecidos e por sua função metabólica, onde os membros da família dos PPARs desempenham papel-chave no metabolismo de lipídeos (104,114,115).

Como mencionado anteriormente, o TGF-b1 modula o desenvolvimento da glomeruloesclerose pela estimulação da produção das proteínas de matriz extracelular, pelas células mesangiais. Wilmer e cols. (116) demonstraram que a estimulação do PPARa antagonisa a expressão do TGF-b1 em células mesangiais humanas. Utilizando a técnica de RT-PCR e imuno-histoquímica, estes autores demonstraram que as células mesangiais apresentam PPARa e que os ligantes de PPARa (Wy14643 ou clofibrato) podem atuar na modulação do TGF-b1.

Routh e cols. (117) demonstraram, através de RT-PCR, a presença de PPARa e PPARg em células mesangiais de ratos, e que o tratamento com troglitazona resulta em uma significante redução no colágeno tipo I e uma pequena redução na produção de laminina, entretanto o tratamento com clofibrato não apresentou nenhum efeito na síntese de laminina, mas conseguiram induzir uma redução na síntese de colágeno tipo I nas células em cultura com alta concentração de glicose.

De forma similar, Tsuchiya e cols. (118) demonstraram a presença do RNAm do PPARg em célula mesangial isolada de rato, e verificaram que a troglitazona inibe a proliferação e induz apoptose nessas células, sugerindo um efeito direto na função renal. Parameswaran e cols. (119) também demonstraram que outro membro da família das tiazolidinedionas, a ciglitazona, induz apoptose em células mesangiais e causa significante redução no crescimento celular.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

Os mecanismos patogenéticos associados à glomerulopatia diabética ainda não estão totalmente esclarecidos, porque muitos dos eventos moleculares associados à lesão renal ainda precisam ser desvendados. Contudo, sabe-se que as alterações na viabilidade das células mesangiais e nos depósitos de matriz, estimuladas direta ou indiretamente pela elevação da glicose, estão relacionadas com a lesão renal associada ao diabetes. Além disso, a literatura relata que não existe uma estratégia terapêutica específica que possa ser recomendada para a nefropatia diabética, sendo possível apenas controlar parcialmente os fatores associados à gênese e à progressão da glomerulopatia diabética. Dessa forma, as pesquisas direcionadas à compreensão dos mecanismos moleculares da glomerulopatia diabética poderão resultar em terapias mais apropriadas a serem testadas e utilizadas posteriormente.

AGRADECIMENTOS

Nosso grupo recebe suporte financeiro da FAPESP, CNPq, CAPES e Pronex.

Recebido em 03/07/06

Revisado em 19/01/07

Aceito em 14/05/07

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Endereço para correspondência:

Maria Claudia Irigoyen

Laboratório de Hipertensão Experimental

Instituto do Coração-FMUSP

Av. Dr. Enéas de Carvalho Aguiar 44

05403-000 São Paulo, SP

Fax: (11) 3085-7887

Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
08 Out 2007
Data do Fascículo
Ago 2007

Histórico

Aceito
14 Maio 2007
Revisado
19 Jan 2007
Recebido
03 Jul 2006

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

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