Cultivo in vitro de plântulas de orquídea em meios com diferentes concentrações de fertilizante mineral

In vitro cultivation of orchid seedlings in media with differents concentrations of mineral fertilizer

BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Cultivo in vitro de plântulas de orquídea em meios com diferentes concentrações de fertilizante mineral

In vitro cultivation of orchid seedlings in media with differents concentrations of mineral fertilizer

Donizetti Tomaz Rodrigues^I; Roberto Ferreira Novais^I; Víctor Hugo Alvarez V.^I; José Maria Moreira Dias^II; Wagner Campos Otoni^III; Ecila Mercês de Albuquerque Villani^IV,*

^IEngenheiros-Agrônomos, Doutores. Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Solos, Av. P.H. Rolfs, s/n., CEP 36570-000, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]

^IIEngenheiro-Agrônomo, Doutor. Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Fitotecnia. Av. P.H. Rolfs, s/n., CEP 36570-000, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. [e-mail]

^IIIEngenheiro-Agrônomo, Doutor. Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Biologia Vegetal, Av. P.H. Rolfs, s/n., CEP 36570-000, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. [e-mail]

^IVEngenheira-Agrônoma, Doutora. Pós Doutoranda, Bolsista FAPEMIG. Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Solos, Av. P.H. Rolfs, s/n., CEP 36570-000, Viçosa, Minas Gerais, Brasil. [e-mail]

RESUMO

Existem diversos meios nutritivos utilizados no cultivo in vitro de orquídeas, com diferentes composições e concentrações de sais, resultando em respostas distintas entre eles. O objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento in vitro de plântulas de orquídea (Cattleya walkeriana Gardner) sob diferentes doses de fertilizante NPK, adicionado ao meio de cultivo, como fonte de nutrientes. Foi utilizado o fertilizante Peters^® na formulação NPK 10-30-20 + Mg + micronutrientes, nas doses de: 0,0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 e 10,0 g L^-1 de meio, acrescido de água de coco (150 mL L^-1), sacarose (20 g L^-1), carvão ativado (2 g L^-1) e pH corrigido para 5,6. Foram utilizados frascos de vidro de 320 mL de capacidade, contendo 35 mL de meio onde foram inoculadas dez plântulas com seis meses de idade, previamente germinadas em meio Knudson C. O experimento foi mantido em sala de crescimento a 27 ± 2 ºC, 16/8 h luz/escuro e irradiância de 48 µmol m^-2 s^-1. A produção máxima de matéria seca da parte aérea das plantas, aos seis meses de idade, foi estimada em 0,255 g/frasco com uso de 5,22 g L^-1 do fertilizante adicionado ao meio de cultura. Considerando a possibilidade de salinidade elevada do meio, para algumas espécies de orquídea, estimou-se a dose de fertilizante (3,55 g L^-1) necessária para obtenção de 90% da produção máxima. As raízes apresentaram drástica redução do crescimento (menor número e curtas) em condições de alta concentração de fertilizante.

Palavras-chave: fertilizante comercial, nutrição, micropropagação, Orchidaceae.

ABSTRACT

There are a number of medium formulations for growth of orchid seedlings in vitro, with different compositions and concentrations of salts, leading to varying plant responses to them. The objective of this work was to evaluate in vitro growth of orchid (Cattleya walkeriana Gardner) seedlings subjected to different rates of a NPK fertilizer added to the growth medium. The fertilizer Peters^® was used in the formulation NPK 10-30-20+Mg+micronutrients in the rates of 0.0; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0; and 10.0 g L^-1 medium, with coconut milk (150 mL L^-1), sucrose (20 g L^-1) and activated charcoal (2 g L^-1) and pH adjusted to 5.6. Six-month-old seedlings, previously germinated in Knudson C medium were transferred to 320 mL glass jars containing 35 mL of medium, using 10 plants per jar. The maximum production of dry matter from the aerial part at six months of age was estimated at 0.255 g/jar, with the medium added of 5.22 g L^-1 of fertilizer. Considering the possibility of high salt concentration in the medium for some orchid species, the fertilizer rate needed to obtain 90% of maximum production was estimate at 3.55 g L^-1. There was a drastic growth reduction in root growth when using high fertilizer concentrations, producing fewer roots and shorter.

Key words: mineral fertilizer, nutrition, micropropagation, Orchidaceae.

INTRODUÇÃO

A literatura especializada mostra que não há, ainda, um meio de cultura específico e ideal quanto à composição nutricional para todos os gêneros, espécies ou híbridos de orquídeas. Entretanto, trabalhos relatam que a concentração de sais no meio de cultivo influencia diretamente o crescimento de orquídeas in vitro, seja pela falta, seja pelo excesso (Park et al., 2004; Figueiredo et al., 2007; Stancato et al., 2008).

Alguns autores afirmam que há especificidade muito grande entre a composição química do meio e o genótipo, em que, para cada espécie ou grupo de espécies, há um meio mais apropriado. Esse fato foi verificado por Dijk & Eck (1995) ao avaliarem diferentes concentrações de fósforo (P) e nitrogênio (N) no cultivo in vitro de Dactylorhiza majalis (Rchb. f.) P.F. Hunt & Summerh., D. praetermissa (Druce) Soó, D. incarnata (L.) Soó e D. maculata (L.) Soó ssp. maculata. Esses autores também concluíram que somente o N, em grandes doses, trouxe problemas de toxicidade, provavelmente pela salinidade causada.

Adelberg et al. (1997) compararam, na forma líquida, os seguintes meios: MS (Murashige & Skoog, 1962), ½ MS, ¼ MS, Knudson C (Knudson, 1946), Lindemann (Lindemann et al., 1970) e Vacin & Went (Vacin & Went, 1949), e obtiveram melhores resultados na produção de matéria seca de plântulas obtidas de sementes de dois híbridos de Cattleya (Sophrolaeliocattleya Jewel Box 'Scheherezade' e Brassolaeliocattleya Rugley's Mill 'Mendenhall') com o uso de MS e suas diluições.

Em cultivo in vitro de duas orquídeas terrestres (Bromheadia finlaysonia Rchb. f. e Cymbidium sinense (Jacks. ex Andrews) Willd.) e uma epífita (Dendrobium "White Fairy"), avaliou-se a absorção de nitrato e amônio (Hew et al., 1993). Os autores não observaram diferenças significativas nos padrões de absorção de N entre as espécies estudadas, embora a taxa de absorção de amônio tenha sido maior do que a de nitrato.

A nutrição nitrogenada de cultivo in vitro também foi estudada por Majerowicz & Kerbauy (2002); nesse estudo, foram utilizadas diferentes fontes de N: NO₃^-, NH₄⁺, ureia, e glutamina, para o cultivo de plântulas de dois genótipos de Catasetum fimbriatum (Gardner ex Hook.) Rchb. f. Esses autores verificaram melhores respostas à glutamina em termos de produção de matéria seca das plântulas, sendo que não houve diferença significativa entre as outras fontes. Também, a presença do nitrato causou maior crescimento de raízes em um dos genótipos, contrariamente ao ocorrido com a ureia. Por outro lado, no outro genótipo observaram restrição do crescimento da parte aérea das plantas quando a fonte amoniacal foi utilizada.

A exaustão de nutrientes no meio de cultivo faz com que as plantas cultivadas in vitro tenham, com o passar do tempo, taxas de crescimento reduzidas. Kishi & Tagaki (1997), estudando a exaustão de nutrientes no meio de cultivo para Dendrobium moniliforme (L.) Sw. e Darwinara 'Pretty Girl', verificaram aumento de matéria seca dos tecidos em 10 e 13 vezes, respectivamente, em relação ao início do experimento. O P foi todo absorvido por D. moniliforme, ocorrendo o mesmo para S, sacarose, e com decréscimo no valor de pH de 5,8 para 5,0. Resultados semelhantes foram observados para Darwinara "Pretty Girl", exceto para o P que não foi totalmente absorvido. Com esse trabalho, os autores constataram que as diferenças nos padrões de absorção de NH₄⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Cl^-, NO₃^-, H₂PO₄^-, glicose, frutose, sorbitol e manitol, e também nos padrões de produção de matéria seca são oriundas da carga genética e dos métodos de propagação in vitro.

Com este trabalho, avaliou-se a produção in vitro de matéria seca de plântulas de orquídeas, com seis meses de idade, em resposta a doses crescentes do fertilizante Peters^® 10-30-20 + Mg + micronutrientes, adicionadas ao meio de cultura, como fonte de nutrientes minerais.

MATERIAL E MÉTODOS

Este experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Células e Tecidos Vegetais do Departamento de Fitotecnia, da Universidade Federal de Viçosa. As condições da sala de crescimento foram mantidas constantes a 27 ± 2 ºC, com 16/8 h luz/escuro e irradiância de 48 µmol m^-2 s^-1, fornecida por tubos fluorescentes Osram^®, 40 W luz do dia.

A unidade experimental foi composta por um frasco com capacidade para 320 mL com 35 mL de meio sobre o qual foram colocadas cinco plântulas de Cattleya walkeriana Gardner, provenientes de sementes, com aproximadamente 0,5 cm de altura e 0,2 cm de comprimento radicular, cultivadas inicialmente em meio Knudson C (Knudson, 1946) durante seis meses. Quando repicadas para os frascos com o respectivo tratamento, estas foram separadas individualmente e limpas do ágar aderido às raízes.

O experimento, em blocos ao acaso com quatro repetições, foi constituído por sete concentrações do fertilizante Peters^®: NPK 10-30-20 + Mg + micronutrientes (em g kg^-1, N 100; P 130,9; K 166,0; Mg 0,6 e, em mg kg^-1, B 68; Fe 500; Zn 25; Cu 36; Mn 250; e Mo 9) adicionado ao meio nas concentrações: 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 10 g L^-1. Em todos os tratamentos, foram utilizados 30 g L^-1 de sacarose, 2 g L^-1 de carvão ativado, 6 g L^-1 de ágar (Merck^®, Alemanha) e pH corrigido para 5,6.

Ao final de seis meses, foram avaliados o crescimento das plantas quanto à produção de matéria fresca e seca de parte aérea e de raízes, comprimento e número de raízes, altura e número de unidades de parte aérea (UPA, constituída pela estrutura formada pelo limbo foliar + pseudobulbo), utilizando-se de paquímetro digital (Digimess 100A) e balança analítica (Gehaka BG 400).

As amostras foliares foram secas em estufa de circulação forçada de ar a 70 ºC, moídas e submetidas à digestão nítrico-perclórica para a determinação dos teores de P, K, Ca, Mg, S, Fe, Mn, B e Zn, quantificados por espectrometria de emissão ótica em plasma induzido (ICP), e N pelo método semi-micro-Kjeldahl (Embrapa, 1999).

As análises de variância, de regressão e contrastes foram realizadas com auxílio do programa SAEG 9.0, ajustando-se as equações para as variáveis: matéria seca da parte aérea (MSPA), matéria seca de raízes (MSR), relação raiz:parte aérea (RA/PA), número de raízes (NR), comprimento médio de raízes (CMR), unidades de parte aérea (UPA), comprimento médio das unidades de parte aérea (CMUPA) e os teores de nutrientes na parte aérea da planta, como variáveis das doses do fertilizante no meio.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em experimento anterior, doses de fertilizantes minerais compreendidas entre 0,25 e 2,25 g L^-1 resultaram, para muitas variáveis de crescimento, em curvas lineares, não sendo possível definir a melhor dose de fertilizante a ser adicionada ao meio de cultivo (Rodrigues et al., 2012). Com base nesses resultados, foram estabelecidas as doses para este experimento. Acreditava-se que, em concentrações a partir de 3 a 4 g L^-1 do fertilizante, a salinidade começasse a exercer efeito prejudicial ao crescimento e desenvolvimento das plântulas (explantes).

As diferenças encontradas na produção de matéria seca da parte aérea (MSPA) como variável das doses foram descritas por uma equação quadrática (Figura 1A), que permitiu estimar a concentração de fertilizante (5,22 g L^-1) necessária para atingir a produção máxima de MSPA (0,255 g/ frasco). Considerando-se 90% da produtividade máxima, a concentração de fertilizante no meio é de 3,55 g L^-1.

A produção de matéria seca de raízes (MSR) apresentou alto incremento até a dose de 1 g L^-1 de fertilizante; e, como observado no modelo, apresentou um intervalo entre as doses de 1 a 5 g L^-1, com pequenas variações na produção de matéria seca (Figura 1B). De acordo com esse resultado, verificou-se que a relação entre a produção de MS de raiz e de parte aérea (RA/PA) (Figura 1C) foi fortemente influenciada pela concentração de sais no meio, tendo em vista o aumento da MSPA acompanhado pela diminuição na MSR. Orquídeas cultivadas in vitro podem apresentar relação RA/PA superior a dois, dependendo do meio usado e da espécie (Rego-Oliveira & Faria, 2005; Stancato et al., 2008), o que não ocorre com plantas ex vitro que apresentam, de modo geral, relação menor que 1, como observado por Rodrigues et al. (2010) ao avaliarem o crescimento de Laelia purpurata 'Werkhaser' x Laelia lobata 'Jeni' cultivadas em vasos, em casa de vegetação. No presente estudo, a relação RA/PA na condição da dose correspondente à produção máxima de MSPA foi de 1,85 (Figura 1C). Desta forma, a relação RA/PA pode ser utilizada como característica auxiliar ao estudo nutricional, sabendo-se que valores extremos de RA/PA podem indicar problemas relativos à deficiência ou ao excesso de nutrientes.

O número de unidades de parte aérea (UPA) e o comprimento médio dessas unidades (CMUPA) (Figuras 1D e 1E) apresentaram alto incremento em resposta ao aumento da dose do fertilizante, com valores máximos estimados em 14,7 unidades/frasco e 2,6 cm por UPA, nas concentrações de 3,7 e 4,8 g L^-1, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos por Moraes et al. (2009) ao avaliarem o crescimento de plântulas de Cattleya loddigesii Lindl. em meio de cultura MS (50% da concentração original) e em dois meios contendo os fertilizantes: Hyponex (NPK 6,5-6-19) e Kristalon laranja (NPK 6-12-36), durante o período de 180 dias de cultivo in vitro.

As raízes demonstraram sensibilidade à salinidade quando expostas às maiores concentrações (acima de 6 g L^-1 do fertilizante), com reduzido número (Figura 1F) e comprimento (Figura 1G). As orquídeas, as epífitas em particular, têm as raízes com velame, estrutura que estoca água e nutrientes, disponibilizando-os de maneira lenta e gradual para a planta em seu habitat (Arditti, 1992). Assim, pode-se deduzir que o suprimento de nutrientes deve ser em baixas concentrações e mais continuamente, ao contrário do que se faz para as culturas anuais: grandes doses em poucas aplicações (Novais & Rodrigues, 2004). Portanto, a adição de 10 g L^-1 de fertilizante Peters® 10-30-20 + Mg + micronutrientes resultou em perdas para todas as variáveis biométricas analisadas.

As plantas, de modo geral, apresentaram aspecto saudável e sem sintomas de estresse salino nos tratamentos que receberam até 5 g L^-1 do fertilizante. No entanto, no tratamento com a dose de 10 g L^-1, as plantas manifestaram o fenômeno da hiper-hidricidade, definida como uma desordem morfofisiológica de plantas crescidas in vitro, resultando em baixa habilidade para o crescimento normal, além de problemas relativos à aclimatização. Este fenômeno é uma resposta da planta a estresses gerados por um ambiente inadequado ou impróprio para o crescimento e desenvolvimento in vitro, caracterizado por redução no teor de clorofila e proteínas, incremento no conteúdo de água e alteração na composição iônica dos tecidos (Hazarika, 2006; Hossain et al., 2010).

Não existe na literatura dados sobre os níveis críticos de macro e micronutrientes para plantas de orquídeas cultivadas in vitro. Para uma comparação entre os tratamentos, serão considerados adequados os teores de macro e micronutrientes encontrados para a produção máxima de MSPA e para 90% desta produção.

Teores adequados de N em folhas de plantas adultas apresentam valores entre 16 e 35 g kg^-1 (Jones Jr. et al., 1991). Considerando que o teor adequado de N em cultivos in vitro seja aquele em que ocorre a produção máxima (28,3 g kg^-1 de N) e comparando este com o teor apresentado para a última dose de fertilizante (51,8 g kg^-1), percebe-se alto incremento de N nos tecidos da planta (Figura 2A), sendo este um fator indicativo de hiper-hidricidade.

Nas raízes e na parte aérea das plantas, foram observados teores muito elevados de P (Figura 2B) quando comparados com aqueles considerados adequados para plantas adultas (Jones Jr. et al., 1991). Isso se deve, em parte, à grande disponibilidade deste nutriente no meio de cultura, uma vez que o fertilizante utilizado apresentava na sua formulação teor elevado de P (130,9 g kg^-1). Estes teores elevados de P sugerem que plantas jovens de orquídeas tenham comportamento semelhante a outras plantas perenes, sendo muito responsivas ao P nesta fase inicial de crescimento.

Os teores de K na parte aérea variaram segundo um modelo (raiz quadrada), com valores entre 16,9 e 39,0 g kg^-1, em que os maiores teores foram observados entre as doses de 5 e 10 g L^-1 de fertilizante no meio (Figura 2C). Plantas cultivadas in vitro têm, inicialmente, comportamento heterotrófico, isso porque a fotossíntese realizada pelas folhas não produz carboidratos suficientes para crescimento satisfatório. Por isso, há necessidade da adição de fontes externas de carboidratos ao meio, os quais serão absorvidos e utilizados pela planta (Arditti, 1992; George, 1993). Essa relação entre o transporte de açúcares e o K sugere que plantas cultivadas in vitro sejam muito mais sensíveis à deficiência deste nutriente no meio. Diversos trabalhos mostram que não apenas a dose de K interfere no crescimento de plantas cultivadas in vitro, mas também a fonte usada, uma vez que o K entra como íon acompanhante de nitrato, cloreto ou sulfato (Caldas et al., 1998; Junqueira et al., 2003; Villa et al., 2006; Figueiredo et al., 2008).

Como o fertilizante Peters^® 10-30-20 foi utilizado neste experimento, o meio apresentava baixa concentração em Ca, confirmado pelos baixos teores encontrados na parte aérea (Figura 2D), inferiores aos considerados adequados por Jones Jr. et al. (1991), de 5 a 20 g kg^-1. Entretanto, sintomas visuais de deficiência deste nutriente não foram observados. Provavelmente, a necessidade de Ca foi suprida, em parte, pela água de coco adicionada ao meio, sendo que o teor de Ca apresentou uma diluição linear nos tecidos da planta com o aumento da produção de matéria seca, com valores de 5,5 para 1,81 g kg^-1, respectivamente para a dose de 1 a 10 g L^-1 do fertilizante.

Água de coco, muito utilizada na propagação in vitro de orquídeas, quando adicionada ao meio de cultura pode induzir a divisão celular e promover um rápido crescimento de plantas, em decorrência de sua composição (sais minerais, açúcares, reguladores de crescimento, proteínas, além de vitaminas e outros componentes orgânicos) (George, 1993). Araújo et al. (2006) verificaram maior desenvolvimento de plântulas de Cattleya loddgesii 'Grande' x Cattleya loddgesii 'Alba' cultivadas in vitro com a adição de 200 mL de água de coco ao meio Knudson C.

Com relação ao teor de Mg na parte aérea, este apresentou expressivo aumento a partir de 2 g L^-1 de fertilizante (de 0,92 a 1,81 g kg^-1), ainda assim, insuficientes para o adequado crescimento de Cattleya de 2 a 3 g kg^-1 (Jones Jr. et al., 1991) (Figura 2E).

Os teores de S aumentaram, significativamente, com o aumento da dose de fertilizante no meio de cultivo, de 1,04 a 3,5 g kg^-1 (Figura 2F), sendo este comportamento inesperado, uma vez que o fertilizante Peters^® 10-30-20 não apresenta S em suas garantias mínimas de nutrientes, levando a crer que um pequeno teor, não considerado pelo fabricante, está presente no fertilizante e na água de coco.

No Brasil, o setor produtivo de flores e plantas ornamentais vem ocupando espaço no setor do Agronegócio o que tem estimulado muito os produtores. Todavia, é um setor ainda carente de pesquisas, principalmente no que diz respeito às técnicas que promovam melhorias na qualidade do produto (folhas e flores). Furlani & Castro (2001) enfatizam que o balanço adequado de micronutrientes é fundamental uma vez que estes estão diretamente relacionados com a formação dos botões florais e, sua deficiência ou, seu excesso, pode causar alterações no aspecto de folhas e flores.

No presente trabalho, dos micronutrientes analisados, apenas os teores de Zn e Mn mostraram-se adequados, semelhantes àqueles encontrados em plantas adultas (Figuras 3B e C) (Jones Jr. et al., 1991; Arditti, 1992; Novais & Rodrigues, 2004). Isso demonstra que os teores de Zn e Mn no fertilizante Peters® e na água de coco foram suficientes para suprir as necessidades das plantas.

Os teores de Fe encontrados nos tecidos da parte aérea da espécie estudada foram baixos, indicando que os sintomas visuais de deficiência deste nutriente, frequentemente observados em cultivos in vitro, são devidos à restrição deste nutriente no meio (Figura 3A), ou pelos elevados teores de P nos tecidos (Figura 2B). Em outros experimentos realizados in vitro, sintomas de provável deficiência de Fe foram observados em plantas cultivadas em altas concentrações de P (Rodrigues et al., 2010), sendo esses mais acentuados em meios com concentrações muito baixas de Fe. Vários autores relatam que altos teores de P no solo e na planta podem ser considerados como principais fatores que contribuem para o surgimento de deficiência de Fe (Hue et al., 1988; Koseoglu, 1995; Furlani & Castro, 2001; Marrocos et al., 2003).

Teores elevados de B foram encontrados na parte aérea de plantas (Figura 3D), sem diferenças estatísticas entre tratamentos. Apesar de estes teores serem bastante elevados, não foram observados problemas de toxidez causada pelo B. O principal sintoma descrito para a toxicidade de B é clorose, seguida pela necrose em margens e ápices foliares (Nable et al., 1997). Sintoma semelhante a este foi observado em alguns frascos; no entanto, este não seguiu nenhuma relação entre os tratamentos que pudesse levar à certeza quanto a este sintoma.

CONCLUSÕES

A produtividade máxima de matéria seca de parte aérea das mudas foi obtida com 5,22 g L^-1 do fertilizante Peters^® 10-30-20.

A relação raiz/parte aérea decresceu com o aumento da dose de fertilizante no meio.

Altas concentrações (10 g L^-1) de sais no meio geram prejuízos ao crescimento de plantas de orquídeas in vitro.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG, pela concessão de bolsa de pós-doutoramento à Dra. Ecila Mecês de Albuquerque Villani.

Recebido para publicação em 15/09/2011 e aprovado em 27/01/2012

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autor correspondente

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Fev 2012

Histórico

• Recebido
  15 Set 2011
• Aceito
  27 Jan 2012