Pesquisa de Rickettsia spp em carrapatos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum no Estado de São Paulo

Survey of Rickettsia spp in the ticks Amblyomma cajennense and Amblyomma dubitatum in the State of São Paulo

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Pesquisa de Rickettsia spp em carrapatos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum no Estado de São Paulo

Survey of Rickettsia spp in the ticks Amblyomma cajennense and Amblyomma dubitatum in the State of São Paulo

Richard Campos Pacheco^I; Maurício Cláudio Horta^I; Adriano Pinter^II; Jonas Moraes-Filho^I; Thiago Fernandes Martins^I; Marcello Schiavo Nardi^I; Savina Silvana Aparecida Lacerra de Souza^II; Celso Eduardo de Souza^II; Matias Pablo Juan Szabó^III; Leonardo José Richtzenhain^I; Marcelo Bahia Labruna^I

^IDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP

^IISuperintendência de Controle de Endemias, São Paulo, SP

^IIIFaculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, MG

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Foi pesquisada a presença de riquétsias em 3.545 carrapatos Amblyomma cajennense e 2.666 Amblyomma dubitatum. Através do teste de hemolinfa, reação em cadeia pela polimerase e isolamento de rickettsia em cultivo celular, todos os Amblyomma cajennense foram negativos, sendo que 634 (23,8%) Amblyomma dubitatum mostraram-se infectados com Rickettsia bellii.

Palavras-chaves: Carrapatos. Amblyomma dubitatum. Amblyomma cajennense. Rickettsia bellii. Isolamento em cultivo celular.

ABSTRACT

The presence of rickettsial infection was surveyed in 3,545 Amblyomma cajennense ticks and 2,666 Amblyomma dubitatum ticks. Using the hemolymph test, polymerase chain reaction and isolation of Rickettsia in cell cultures, all of the Amblyomma cajennense were negative, whereas 634 (23.8%) of the Amblyomma dubitatum ticks were shown to be infected with Rickettsia bellii.

Key-words: Ticks. Amblyomma dubitatum. Amblyomma cajennense. Rickettsia bellii. Isolation in cell culture.

A febre maculosa brasileira (FMB), doença causada pela bactéria Rickettsia rickettsii, é o principal agravo em conseqüência da infecção por riquétsias do grupo da febre maculosa (GFM) em humanos no Brasil. Casos confirmados de FMB têm sido relatados em determinadas áreas dos Estados da região Sudeste¹⁸. O carrapato Amblyomma cajennense é incriminado como o principal vetor da doença⁵ e, embora não haja comprovação do papel do Amblyomma dubitatum na transmissão da FMB, suspeita-se de sua possível participação na transmissão de riquétsias do GFM para humanos^{11 12}. Os eqüinos, capivaras e antas estão entre os principais hospedeiros para todos os estágios parasitários de Amblyomma cajennense⁷, enquanto as capivaras são também hospedeiros primários para o Amblyomma dubitatum⁹. Desta forma, este trabalho buscou avaliar a infecção por Rickettsia spp em carrapatos Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum no Estado de São Paulo.

Durante o período de 2002 a 2006, carrapatos adultos das espécies Amblyomma cajennense e Amblyomma dubitatum, provenientes de 16 localidades do Estado de São Paulo (Figura 1), foram capturados em vida livre e, também através da retirada manual sobre as capivaras. Os carrapatos foram inicialmente submetidos ao teste de hemolinfa², método de triagem para detectar organismos morfologicamente compatíveis com riquétsias e, em seguida congelados a -80ºC para posterior processamento. Os carrapatos positivos pelo teste de hemolinfa tiveram suas patas removidas, sem que o corpo fosse descongelado, as quais foram submetidas à extração de DNA e a técnica da reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando-se os oligonucleotídeos CS-78 e CS-323, que amplificam um fragmento de 401 pares de base (pb) do gene citrato sintase (gltA), presente em todas as espécies de riquétsias¹¹. Se positivo, a amostra de DNA era testada por outro PCR utilizando-se os oligonucleotídeos Rr190.70p e Rr190.602n, os quais amplificam um fragmento de 530pb do gene ompA (proteína de 190kDa), presente apenas em riquétsias do GFM¹⁶. Produtos da PCR foram purificados e, em seguida o DNA de cada amostra foi seqüenciado¹⁴. As seqüências obtidas foram submetidas ao programa BLAST analysis para determinar similaridades com outras espécies de riquétsias¹.

Dois carrapatos Amblyomma dubitatum, positivos na PCR para o gene gltA, foram descongelados e submetidos à técnica de isolamento de riquétsias em cultura de células Vero, conforme previamente descrito¹¹. Depois de estabelecido os isolados, foi realizado a extração de DNA de uma alíquota de cada inoculo, a qual foi testada por uma bateria de PCR's, objetivando a caracterização molecular dos isolados. Para a realização de cada reação foram utilizados os oligonucleotídeos CS-239 e CS-1069, que amplificam um fragmento de 834pb do gene gltA¹¹, oligonucleotídeos 17k-5 e 17k-3, os quais amplificam um fragmento de 549pb do gene htrA (proteína de 17kDa)¹¹, oligonucleotídeos 120-M59 e 120-807 para amplificação de uma fragmento de 865pb do gene ompB (proteína de 135kDa)¹⁷ e, por fim uma alíquota dos isolados foi testada pela PCR utilizando os oligonucleotídeos Rr190.70p e Rr190.602n¹⁶.

Um total de 3.545 carrapatos Amblyomma cajennense e 2.666 Amblyomma dubitatum foi coletado nas 16 áreas estudadas. Dos Amblyomma cajennense, 3.517 foram negativos pelo teste de hemolinfa e 28 amostras foram inconclusivas, em conseqüência de problemas inerentes à técnica. Dos 2.666 Amblyommadubitatum, 2.019 foram negativos no teste de hemolinfa, 244 foram inconclusivos e em 403 amostras foi possível observar organismos morfologicamente compatíveis com riquétsias.

Os 28 carrapatos Amblyomma cajennense inconclusivos pelo teste de hemolinfa foram negativos pela PCR. Dos 647 Amblyomma dubitatum positivos e inconclusivos, 634 (403 previamente positivos e 231 inconclusivos no teste de hemolinfa) foram positivos na PCR para o gene gltA (Tabela 1).Nenhum deles foi positivo para o gene ompA. Os produtos da PCR dos 634 Amblyomma dubitatum positivos nessa técnica foram seqüenciados e todas as seqüências obtidas mostraram 100% de similaridade com as seqüências correspondentes de Rickettsia bellii disponíveis no GenBank (números de acesso CP000087, DQ865204, DQ517288 e U59716). Dos 16 municípios amostrados, 10 apresentaram carrapatos Amblyomma dubitatum infectados por Rickettsia bellii, numa freqüência geral de 23,8%, variando de 6,1 a 44,9% por população de carrapato infectada (Tabela 1). Foram obtidos dois isolados de Rickettsia bellii, provenientes de dois carrapatos Amblyomma dubitatum dos municípios de Cordeirópolis e Ribeirão Grande e, designados como Ad-CORD-SP e Ad-25-INT, respectivamente. Amostras de DNA de células infectadas da terceira passagem dos dois isolados geraram fragmentos de 1.078 a 1.092pb para o gene gltA e de 498 a 499pb para o gene htrA, respectivamente, os quais mostraram todos 100% de identidade com seqüências correspondentes de Rickettsia bellii no GenBank (números de acesso CP000087 e CP000849 para Ad-CORD-SP; DQ865204 e AY362702 para Ad-25-INT). Fragmentos dos genes ompA e ompB não foram obtidos para esses dois isolados.

Embora o carrapato Amblyomma cajennense seja o principal vetor de Rickettsia rickettsii no Brasil⁵, no presente estudo não foi possível verificar a infecção por nenhuma espécie de riquétsia neste carrapato. Sangioni e cols¹⁸ observaram resultado semelhante em seis outras áreas do Estado de São Paulo, possivelmente em conseqüência de uma baixa infecção pela bactéria. Notavelmente, Labruna e cols⁸ observaram que o Amblyomma cajennense é parcialmente refratário à infecção por Rickettsia rickettsii, quando comparado com outras espécies de carrapatos. A Rickettsia bellii foi a única espécie de riquétsia encontrada infectando carrapatos Amblyomma dubitatum. Esta espécie de riquétsia, embora de patogenicidade desconhecida para os seres humanos, tem sido relatada infectando inúmeras espécies de carrapatos no Brasil, incluindo Amblyomma dubitatum, com freqüências variadas de 0 a 100%, dependendo da espécie e população de carrapato^{4 6 10 11 14 15}.

Pacheco e cols¹³, avaliando a infecção por Rickettsia spp pela reação de imunofluorescência indireta (RIFI) em capivaras de seis municípios do Estado de São Paulo, onde nunca houve relatos de FMB em seres humanos, observaram evidências sorológicas de infecção por Rickettsia parkeri em capivaras de apenas um município e, por Rickettsia bellii em outros quatro locais, onde a maior parte das capivaras estavam infestadas por Amblyomma dubitatum. Esses resultados, em conjunto com o presente trabalho, indicam que enquanto a maior parte das populações de Amblyomma dubitatum do Estado de São Paulo encontram-se infectada por Rickettsia bellii, a infecção por riquétsias do GFM, como a Rickettsia parkeri, parece ser um achado bem raro nessa espécie de carrapato^{11 12}. Futuros estudos deverão avaliar o papel da infecção por Rickettsia bellii em diferentes populações de carrapatos, especialmente no que diz respeito à ecologia de riquétsias do GFM, uma vez que é sabido que um carrapato infectado por uma espécie de Rickettsia se torna refratário à infecção por uma segunda espécie de Rickettsia³.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro e ao Cássio Peterka do Instituto de Pesquisa Ecológica pela colaboração na coleta de amostras de carrapato.

Recebido para publicação em 25/06/2008

Aceito em 29/04/2009

Apoio financeiro: FAPESP (processo n.º 03/13871-8)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Ago 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Recebido
  25 Jun 2008
• Aceito
  29 Abr 2009