Avaliação da biodiversidade de rizóbios simbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em Santa Catarina

Assessment of biodiversity in rhizobia symbionts of common bean (Phaseolus vulgaris L.) in Santa Catarina, Brazil

SEÇÃO III - BIOLOGIA DO SOLO

Avaliação da biodiversidade de rizóbios simbiontes do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) em Santa Catarina

Assessment of biodiversity in rhizobia symbionts of common bean (Phaseolus vulgaris L.) in Santa Catarina, Brazil

Priscila Stocco^I; Julio César Pires do Santos^II; Vitor Paulo Vargas^I; Mariangela Hungria^III

^IMestrando do Departamento de Solos, Faculdade de Agronomia, Universidade do Estado de Santa Catarina – CAV/UDESC. Caixa Postal 281, CEP 88520-000 Lages (SC). Bolsista do CNPq-MCT. E-mail: [e-mail]

^IIProfessor do Departamento de Solos, Faculdade de Agronomia, CAV/UDESC. Bolsista do CNPq-MCT. E-mail: [e-mail]

^IIIPesquisadora da Embrapa Soja, Caixa Postal 231, CEP 86001-970 Londrina (PR). E-mail: [e-mail]

RESUMO

Os solos brasileiros, em geral, apresentam uma população abundante de rizóbios capazes de nodular e fixar N₂ em simbiose com o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.); contudo, a diversidade dessas bactérias ainda é pouco conhecida. Este estudo teve por objetivo conhecer a biodiversidade de microssimbiontes do feijoeiro em Santa Catarina e, para isso, foram obtidos 117 isolados de nódulos de plantas coletadas em campo, em 23 áreas do extremo oeste, do meio oeste e do planalto sul catarinense. Com base nos atributos morfofisiológicos, os isolados foram classificados em nove grupos. Pela análise dos perfis de DNA após a amplificação (PCR) com o "primer" BOX, que codifica regiões conservadas e repetidas do genoma, 107 perfis distintos foram agrupados em um nível final de similaridade de apenas 26,9 %. Os perfis obtidos pela amplificação do gene 16S ribossômico – referência na taxonomia atual de procariotos – seguida pela digestão com três enzimas de restrição (técnica de RFLP-PCR), resultaram em seis agrupamentos principais e cinco bactérias isoladas. As populações consistiram de 17,1 % de Rhizobium tropici, 35,9 % de R. etli, 32,5 % de R. leguminosarum, 1,7 % de R. giardinii e 12,8 % com perfis distintos das espécies descritas de rizóbios de feijoeiro. R. tropici predominou em solos ácidos do meio oeste e do planalto sul, R. leguminosarum não foi detectado no extremo oeste e R. etli ocorreu nas três regiões, essas duas últimas espécies em solos menos ácidos. Os resultados enfatizam a diversidade genética elevada de rizóbios, inter e intra-específica, nos solos catarinenses, inclusive com a indicação de novas espécies.

Termos para indexação: biodiversidade, fixação biológica do N₂, Phaseolus vulgaris, Rhizobium etli, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium tropici.

SUMMARY

Brazilian soils usually present a great number of populations of rhizobial bacteria capable of nodulating and fixing N₂ in symbiosis with common bean (Phaseolus vulgaris L.), but the diversity of these bacteria is still poorly known. This study aimed to assess the biodiversity of micro-symbionts of common bean in the state of Santa Catarina in southern Brazil. One-hundred and seventeen isolates were obtained from field-grown plants in 23 areas of the far west, midwest and southern plateau of Santa Catarina. Based on morpho-physiological properties, the isolates were classified in nine groups. The DNA analysis by BOX-PCR, with the amplification of conserved and repetitive genome regions, detected 107 different profiles joined at a final similarity level of only 26.9 %, i.e., a high level of genetic diversity. The profiles obtained by the amplification of the 16S rRNA gene, followed by the digestion with three restriction enzymes (RFLP-PCR technique) defined six main groups and five isolated bacteria. The population consisted of 17.1 % Rhizobium tropici, 35.9 % R. etli, 32.5 % R. leguminosarum, 1.7 % R. giardinii and 12.8 % yet undocumented profiles of the common bean rhizobial species. R. tropici predominated in the acid soils of the midwest and southern plateau, R. leguminosarum was not detected in the far west and R. etli occurred in all three regions, while the last two species predominated in less acid soils. The results demonstrate the high inter- and intra-specific rhizobial diversity in the soils of Santa Catarina, besides indicating new species.

Index terms: biodiversity, biological nitrogen fixation, Phaseolus vulgaris, Rhizobium etli, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium tropici.

INTRODUÇÃO

O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é cultivado em todo o território nacional, particularmente por sua importância nutricional, como fonte de minerais e proteínas para a população brasileira (Vieira & Rava, 2000). O Brasil é o maior produtor e consumidor mundial de feijão comum e 67 % dos grãos provêm de estabelecimentos com base em agricultura familiar (INCRA/FAO, 2000; Vieira & Rava, 2000). Em Santa Catarina, responsável por 4,5 % da produção nacional em 2006, a agricultura familiar representa 90,5 % dos estabelecimentos, que ocupam 60 % da área agrícola e respondem por 71,3 % do valor bruto da produção agropecuária estadual (FETAESC, 2006).

Considera-se que o feijoeiro foi domesticado separadamente em dois centros distintos de diversidade genética, de modo que os alelos estão distribuídos em dois grupos: o mesoamericano, ou grupo do norte (do México à região norte da América do Sul – México, América Central, Colômbia, norte do Peru) e o andino, ou grupo do sul (do sul do Peru ao norte da Argentina – Equador, Bolívia, Peru, Argentina) (Debouck, 1986; Gepts & Debouck, 1991). No Brasil, não são encontrados ancestrais selvagens do feijoeiro (Debouck, 1986), mas essa leguminosa vem sendo cultivada no País desde tempos pré-históricos (Freitas, 2006).

Um atributo importante do feijoeiro é a sua capacidade de se associar simbioticamente com bactérias denominadas, coletivamente, rizóbios, formando estruturas típicas, os nódulos, onde ocorre o processo de fixação biológica do nitrogênio atmosférico (N₂). Inicialmente, a simbiose com o feijoeiro era considerada bastante restrita, sendo relatado que ocorreria apenas com um grupo de bactérias classificadas, em 1932, como Rhizobium phaseoli (Fred et al., 1932) e reclassificadas como Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli em 1984 (Jordan, 1984). Contudo, o avanço nas metodologias de biologia molecular e a coleta de rizóbios em vários locais do mundo indicaram que essa leguminosa pode ser bastante promíscua em suas associações simbióticas (Hernandez-Lucas et al., 1995; Michiels et al., 1998), resultando na descrição de quatro novas espécies: R. tropici (Martínez-Romero et al., 1991), R. etli bv. phaseoli (Segovia et al., 1993), R. gallicum (bv. gallicum e bv. phaseoli) e R. giardinii (bv. giardinii e bv. phaseoli) (Amarger et al., 1997). Além disso, outros gêneros e espécies foram isolados de nódulos de feijoeiro: Bradyrhizobium sp. (Hungria et al., 1993), Rhizobium sp. OR 191 (Eardly et al., 1985), R. mongolense (van Berkum et al., 1998), Sinorhizobium fredii (Straliotto et al., 1999; Grange & Hungria, 2004), Sinorhizobium sp., Mesorhizobium plurifarium, além de outros isolados que podem representar novas espécies (Grange & Hungria, 2004). Finalmente, outras espécies de rizóbios são capazes de nodular o feijoeiro em condições de laboratório, mas ainda não foram isoladas desse hospedeiro em condições de campo (Michiels et al., 1998).

Apesar dos avanços nas metodologias para a avaliação da biodiversidade, ainda pouco se conhece sobre as bactérias simbióticas fixadoras de N₂ nos ecossistemas brasileiros, e um exemplo relevante é o dos microssimbiontes do feijoeiro. Nesse contexto, este trabalho visou determinar a diversidade de rizóbios isolados de plantas de feijoeiro coletadas em campo nas principais regiões produtoras de Santa Catarina.

MATERIAL E MÉTODOS

Estirpes utilizadas como referência

Como referência, foram incluídas as estirpes-tipo das espécies de rizóbios já descritas, capazes de nodular o feijoeiro: Rhizobium tropici tipo A CFN 299 (= USDA 9039, = LMG 9517), R. tropici tipo B CIAT 899^T (= UMR 1899, = USDA 9030, = TAL 1797, HAMBI 1163, = SEMIA 4077, = ATCC 49672), R. etli CFN 42^T (= USDA 9032), recebidas do Centro de Ciências Genômicas, Cuernavaca, México; R. giardinii bv. giardinii H152^T, R. gallicum bv. gallicum R602^T, fornecidas pelo INRA, Dijon, France; R. leguminosarum bv. phaseoli USDA 2671, proveniente do USDA, Beltsville, EUA; foi incluída, também, a estirpe PRF 81 (= SEMIA 4080) de R. tropici, da coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Soja, utilizada em inoculantes comerciais no Brasil.

Isolamento e caracterização morfofisiológica dos isolados

Foram coletadas, ao acaso, amostras de solo (camada de 0–10 cm) e de nódulos de raízes de feijoeiro, em 33 áreas representativas do estado de Santa Catarina, localizadas no extremo oeste, meio oeste e no planalto sul. O número de amostras de solo e de plantas coletadas variou de acordo com o tamanho da propriedade, com, no mínimo, dez subamostras por local para compor uma amostra. Após o isolamento, foram obtidos rizóbios viáveis em 23 das 33 áreas, indicadas na figura 1, totalizando 117 isolados que foram objeto deste estudo. As características de zoneamento climático dessas áreas são apresentadas no quadro 1. Os solos foram classificados conforme o mapa de solos de Santa Catarina (Embrapa, 2006), enquanto as propriedades químicas foram determinadas segundo Tedesco et al. (1995), podendo ser visualizadas no quadro 2.

No laboratório, dez nódulos de pelo menos dez plantas, coletadas em cada local, foram retirados ao acaso, procedendo-se ao isolamento e obtenção de culturas puras de bactérias em meio YMA (Vincent, 1970), modificado para 5 g L^-1 de manitol. As estirpes foram caracterizadas quanto à produção de muco, transparência, cor, tamanho, borda, elevação e crescimento, aos três e cinco dias de crescimento (Vincent, 1970). Também foi observada, a partir do quinto dia de crescimento, a acidificação ou alcalinização do meio YMA modificado que continha o indicador de pH azul de bromotimol (Vincent, 1970). Os isolados obtidos foram mantidos em meio YMA modificado inclinado, a 4 ºC, e armazenados em YM com 25 % de glicerol, a -80 ºC.

Caracterização genética dos isolados

Amplificação do DNA por rep-PCR (BOX)

Inicialmente, o DNA das bactérias foi extraído conforme descrito por Kaschuk et al. (2006), e as amostras foram armazenadas a -20 ºC. A seguir, o DNA das bactérias foi submetido à amplificação pela técnica de PCR ("polymerase chain reaction"), utilizando o "primer" BOX A1R (Invitrogen^TM), que amplifica regiões conservadas e repetitivas do DNA cromossômico, em geral, no espaço intergênico, metodologia conhecida como rep-PCR. As condições de amplificação foram descritas por Kaschuk et al. (2006). Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em géis de agarose de 20 X 25 cm, por 6 h, a 120 V, utilizando como peso molecular o marcador 1 kb plus DNA Ladder (Invitrogen^TM). Os géis foram corados com brometo de etídeo e fotografados sob radiação UV.

RFLP-PCR da região do 16S RNAr

O DNA das bactérias também foi submetido à amplificação com os "primers" fD1 e rD1, conforme descrito por Menna et al. (2006); esses "primers" amplificam a região do DNA que codifica para o gene ribossomal 16S. A seguir, o produto da amplificação foi submetido à análise de polimorfismo de comprimento dos fragmentos de restrição do DNA (RFLP, "restriction fragment length polymorphism"), pela digestão, separadamente, com três enzimas de restrição: HhaI (5' - GCG/C - 3'; 3' - C/GC - 5'), HpaII (5' - C/CGG - 3'; 3' - GGC/C - 5') e RsaI (5'- GT/AC - 3'; 3'- CA/TG - 5') (Invitrogen^TM). Os produtos obtidos da digestão foram submetidos à eletroforese horizontal em gel com 3 % de agarose, a 120 V, por 4 h, tendo como padrão o peso molecular de 100 pb (Invitrogen^TM). Os géis obtidos foram corados com brometo de etídeo e fotografados sob radiação UV.

Análise da diversidade genética

As bandas resultantes das análises do DNA por rep-PCR e RFLP-PCR foram analisadas pelo programa Bionumerics (Applied Mathematics, Kortrijk, Bélgica, versão 1.50), utilizando o algoritmo UPGMA ("unweighted pair-group method with arithmetic mean") e o coeficiente de Jaccard, conforme descrito anteriormente por Germano et al. (2006). Nas análises por rep-PCR e RFLP-PCR, a tolerância das bandas foi estabelecida em 2 e 3 %, respectivamente, no programa Bionumerics, de acordo com estudos realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa (Germano et al., 2006; Grange et al., 2007).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Apesar de o Brasil não ser centro de diversidade genética do feijoeiro, algumas evidências arqueológicas indicam que a leguminosa é cultivada no País desde os tempos pré-históricos. Pouco se conhece, porém, sobre o cultivo do feijoeiro no período anterior a 1.500, em razão da quebra nas tradições orais nativas, após a colonização do Brasil pelos europeus (Prous, 1997; FUNAI, 2006). Nesse contexto, informações sobre as estruturas das populações de rizóbios, bem como sobre a co-evolução dos microssimbiontes com as plantas hospedeiras são importantes porque podem contribuir não só para delinear estratégias visando a maximizar o processo de fixação biológica do N₂, como também para obter informações sobre a evolução da simbiose em solos brasileiros (Grange et al., 2007) e, nesse contexto, este estudo teve por objetivo avaliar a biodiversidade dos microssimbiontes no feijoeiro no Estado de Santa Catarina.

Das 33 áreas avaliadas neste estudo, não foram obtidos isolados viáveis em dez delas: três do extremo oeste, três do meio oeste e seis do planalto sul. Os solos dessas áreas apresentavam atributos químicos semelhantes, exceto pelo N: em média, o conteúdo de N dos 23 solos de origem dos isolados foi de 17,61 ± 8,15 mg dm^-3 de N no solo (Quadro 2), enquanto, nos dez solos onde não foram encontrados nódulos, foi de 331,20 ± 176,23 mg dm^-3 de N no solo. Além disso, os solos com alto teor de N também recebiam descarte de resíduos de suínos, podendo apresentar problemas com metais pesados.

Para este estudo, foram obtidos 117 isolados das 23 áreas amostradas, representando três regiões do Estado de Santa Catarina (Quadros 2 e 3). Todos os isolados apresentaram crescimento rápido, sendo possível realizar a caracterização morfofisiológica em três dias; 96,6 % dos isolados apresentaram reação ácida em meio YMA (Quadro 4). Praticamente todos os isolados apresentaram colônias com borda lisa e elevação cupular e, aos três dias, as colônias apresentaram de 1,4 a 3,8 mm (dados não mostrados). Além disso, 67,5 % dos isolados apresentaram colônias de cor branca opaca e produção moderada de muco em meio YMA (Quadro 4). As informações sobre cada isolado, individualmente, encontravam-se disponíveis no endereço http://www.bmrc.lncc.br/ (público a partir de 1/9/2008). Os atributos morfofisiológicos (Quadro 4) não foram relacionados com a distribuição geográfica, com as condições climáticas (Quadro 1), ou com as propriedades químicas do solo (Quadro 2).

Quando o DNA dos 117 isolados foi amplificado e analisado por rep-PCR com o "primer" BOX, constatou-se um grau elevado de polimorfismo, de tal forma que foram obtidos 107 perfis distintos (Figura 2). Na análise dos perfis de rep-PCR, utilizando o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard e considerando o nível de similaridade genética de 70 % na análise de agrupamento, estabelecido em estudos anteriores (Grange & Hungria, 2004; Kaschuk et al., 2006), foram formados 24 grupos e 23 % dos isolados não foram inseridos em nenhum agrupamento (Figura 2). Apenas cinco grupos, IV, V, X, XIV e XIV, uniram bactérias com perfis idênticos e, em cada grupo, houve casos de isolados semelhantes provenientes da mesma área, por exemplo, os isolados 111, 113, 115 e 110, no grupo IV, provenientes de Cerro Alto, Palmeira, ou os isolados 75 e 74, da localidade de Toca da Onça, no grupo XIV. Contudo, perfis idênticos também foram constatados em áreas distintas, por exemplo, no grupo V (os pares de isolados 118 e 96; 95 e 87) e no grupo XVI (isolados 63, 46 e 56) (Figura 2).

Catorze agrupamentos reuniram isolados provenientes exclusivamente da região do planalto sul de Santa Catarina: I, II, III, V, VII, X, XIV, XV, XVII, XIX, XX, XXI, XXII e XXIII; além disso, em outros três grupos, os isolados dessa região foram predominantes: IV, VIII e XVI (Figura 2). Em relação ao meio oeste catarinense, foram observados apenas dois grupos, IX e XXIV, com isolados provenientes exclusivamente dessa região, e somente com dois isolados por grupo. Além disso, seis dos 13 isolados dessa região 2 foram geneticamente bastante distintos, não sendo posicionados em nenhum grupo. No extremo oeste, somente em um grupo, XIII, os isolados foram do mesmo local; além disso, somente dois isolados (12 e 6) não foram posicionados em nenhum grupo e os demais oito isolados foram dispersos em seis grupos: VI, XI, XII, XIII, XVI e XVIII. Finalmente, as estirpes utilizadas como referência apresentaram perfis distintos dos isolados de Santa Catarina e somente o isolado 116, de Cerro Alto, Palmeira, foi posicionado no mesmo grupo IV com as estirpes USDA 2671 de R. leguminosarum bv. phaseoli e R602^T de R. gallicum bv. gallicum (Figura 2). Desse modo, não houve agrupamento claro dos isolados de acordo com a região de procedência.

A análise de agrupamento também foi efetuada considerando os perfis de rep-PCR de cada região. Na região 1, extremo oeste, incluindo Chapecó e Concórdia, os 12 isolados formaram agrupamentos em um nível de similaridade baixo, de apenas 24 %. A região 2, meio oeste, agrupou 13 isolados com uma similaridade de 31 % e, finalmente, a região 3, planalto sul, reuniu, com 34 % de similaridade, 92 isolados. Finalmente, a análise de agrupamento dos perfis de rep-PCR também foi realizada em cada município que contasse com mais de dois isolados. A maior variabilidade na similaridade genética foi constatada na região 1, variando de 94 % entre os dois isolados de Pinhalzinho, a 13 %, entre os dois isolados de Planaltina (Quadro 3). Na região 2, a similaridade variou de 33 a 41 % e, na região 3, de 36 a 52 % (Quadro 3). Não foi constatada correlação significativa entre os índices de similaridade genética (Quadro 3) e os atributos químicos do solo (Quadro 2), ou climáticos (Quadro 1).

O polimorfismo de perfis de DNA obtidos por rep-PCR tem mostrado grande aplicabilidade para a identificação de estirpes em várias espécies de bactérias, inclusive nos rizóbios (de Bruijn, 1992; Grange & Hungria, 2004; Grange et al., 2007; Kaschuk et al., 2006). É interessante destacar que a diversidade genética dos isolados de Santa Catarina, detectada por rep-PCR, foi bastante elevada, com o agrupamento dos 117 isolados e as estirpes de referência em um nível de similaridade final bastante baixo, de apenas 26,9 % (Figura 2). Essa diversidade é semelhante à observada em um levantamento no México, centro de diversidade genética do feijoeiro, utilizando eletroforese de multilocos enzimáticos (Caballero-Mellado & Martinez-Romero, 1999).

Os 117 isolados também foram avaliados pela técnica de RFLP-PCR da região do DNA que codifica o gene ribossomal 16S, digerido separadamente com três enzimas de restrição. O dendrograma obtido com os produtos de restrição indicou diversidade genética elevada entre os isolados, com o agrupamento em um nível de similaridade final de 31,2 % (Figura 3). O grupo I incluiu dois isolados com 100 % de similaridade, um de Urupema (planalto sul) e o outro de Campos Novos (meio oeste), que se uniram com a estirpe tipo de R. giardinii bv. giardinii em um nível de similaridade de 94,4 %. O grupo II reuniu 19 isolados, 17 do planalto sul e dois da região meio oeste, com as estirpes de R. tropici PRF 81 e CIAT 899^T (tipo B). Já o isolado 12, do extremo oeste, de Peritiba, foi o único que agrupou com a estirpe CFN 299 de R. tropici tipo A, com uma similaridade de 93,3 %, formando o grupo III. Quatro isolados foram unidos em um nível final de similaridade de 94,4 %, no grupo IV, com dois subgrupos, o primeiro com dois isolados com semelhança total, 106 e 107, ambos de Bela Vista, Lages, e o segundo, com três isolados de perfis idênticos, dois do extremo oeste e um do planalto sul catarinense (Figura 3). Os grupos V e VI foram os que reuniram maior número de isolados (Figura 3). No grupo V, 38 isolados foram reunidos, com 100 % de similaridade, a R. leguminosarum bv. phaseoli USDA 2671 e, também, com R. gallicum bv. gallicum R602^T, pois as três enzimas não conseguiram diferenciar essas duas espécies. Esse grupo reuniu isolados das regiões 2 e 3, mas nenhum do extremo oeste. No grupo VI, 42 isolados provenientes das três regiões catarinenses mostraram 100 % de similaridade com a estirpe CFN 42^T de R. etli bv. phaseoli. No grupo VII, foram unidos, com 100 % de similaridade, dois isolados de Pinhalzinho e um de Palmitos, ambos na região 1. Os isolados 97 e 98, com perfis idênticos, constituíram o grupo VIII. Finalmente, os isolados 23 e 24, de Curitibanos (região 2), e o isolado 99, de Cadeados (região 3), ocuparam posições isoladas (Figura 3).

Considerando as três enzimas de restrição utilizadas, não foi possível diferenciar, isoladamente, as espécies de rizóbios. Constatou-se, também, que, embora R. tropici tipo A e tipo B sejam consideradas uma única espécie, a enzima HhaI conseguiu diferenciar a estirpe CFN 299 (tipo A) de todas as demais espécies de rizóbios, inclusive da CIAT 899^T (tipo B). A enzima RsaI produziu perfis semelhantes com todas as espécies, exceto com R. etli CFN 42^T e permitiu a separação de R. etli de R. leguminosarum. Essas três enzimas somente não conseguiram separar as espécies R. leguminosarum de R. giardinii (Figura 3).

Quando os perfis de RFLP-PCR foram analisados para cada região catarinense, a similaridade genética entre os isolados das regiões 1, 2 e 3 foi estimada em 78, 44 e 39 %, respectivamente. Os perfis de RFLP-PCR de cada local também foram analisados. Embora os dois isolados de Caxambu do Sul e Pinhalzinho, no extremo oeste, tenham apresentado identidade total de perfis, de modo geral, os isolados do planalto sul apresentaram maior similaridade genética, variando de 70 %, em Toca da Onça, a 93 %, em cinco locais, e a única exceção foi com os isolados de Cadeados (Lages), que apresentaram similaridade de 40 % (Quadro 3). Não houve correlação significativa entre os índices de diversidade genética por RFLP-PCR (Quadro 3) e os atributos químicos do solo (Quadro 2), ou climáticos (Quadro 1). Contudo, em relação às espécies, houve predominância de R. tropici em solos com pH inferior ao das demais regiões (valor médio de pH de 4,9 ± 0,5), enquanto R. etli e R. leguminosarum predomina-ram em pH de 5,9 ± 0,5 e de 5,4 ± 0,6, respectivamente (Figura 3 e Quadro 2).

Até o presente momento, foram feitos poucos levantamentos sobre as espécies de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro em solos brasileiros. Além disso, os levantamentos foram realizados em condições variáveis e sabe-se que a diversidade genética pode variar de acordo com a amostragem (Alberton et al., 2006), metodologia de avaliação (Kaschuk et al., 2006), condições ambientais (Straliotto et al., 1999) e planta utilizada como isca (Mercante et al., 1998; Straliotto et al., 1999), dentre outros. No caso do método de amostragem, Alberton et al. (2006) constataram diferenças entre a população de rizóbios capturada utilizando feijoeiro em condições de campo – menor diversidade, mas estirpes mais competitivas – e aquela obtida a partir de plantas inoculadas com diluições de solo – maior diversidade, mas estirpes menos competitivas. Os resultados também variam com a planta utilizada como isca para os rizóbios, por exemplo, em um mesmo solo foi constatada maior diversidade de rizóbios com a utilização de feijoeiro, do que com a leucena como planta-isca (Mercante et al., 1998; Straliotto et al., 1999).

A evolução na metodologia também teve reflexos profundos na identificação das espécies de rizóbios. Como exemplo, estudos pioneiros consideravam as propriedades fisiológicas e simbióticas dos isolados, tais como a capacidade de nodular Leucaena spp e o crescimento em meio LB, que ocorreriam exclusivamente com as estirpes de R. tropici tipo A (Martinez-Romero et al., 1991; Hungria et al., 2000); contudo, essas propriedades não foram confirmadas posteriormente (Hernandez-Lucas et al., 1995; Amarger et al., 1997). Outras metodologias empregadas, por exemplo, a determinação do perfil protéico (Soares et al., 2006), não são aceitas nos critérios atuais de classificação de espécies procarióticas (Boone et al., 2001). Já a análise do 16S ribossômico, por seqüenciamento ou por RFLP-PCR, apresenta alta correlação com a hibridização DNA-DNA, podendo ser utilizada para a identificação das espécies (Boone et al., 2001; Coenye et al., 2005), razão pela qual foi escolhida para a análise dos isolados catarinense.

Com base no RFLP-PCR do 16S RNA, a população nos solos das três regiões produtoras de Santa Catarina, capturada utilizando o feijoeiro como planta-isca, consistiu de 17,1 % de R. tropici, 35,9 % de R. etli, 32,5 % de R. leguminosarum e 1,7 % de R. giardinii; 12,8 % dos isolados não foram classificados em nenhuma das cinco espécies descritas como simbiontes do feijoeiro.

Em relação à espécie R. etli, sabe-se que é o microssimbionte dominante em ambos os centros de diversidade genética do feijoeiro, o mesoamericano e o andino (Segovia et al., 1993; Souza et al., 1994; Bernal & Graham, 2001; Aguilar et al., 2004). Além disso, essa espécie também já foi amplamente detectada em solos brasileiros (Straliotto et al., 1999; Hungria et al., 2000; Andrade et al., 2002; Mostasso et al., 2002; Soares et al., 2006; Giongo et al., 2007) e, em um estudo com R. etli de solos dos Estados de Pernambuco e do Paraná, o 16S rRNA apresentou maior semelhança com a estirpe mexicana CFN 42^T (Grange et al., 2007). Existem evidências de que o feijoeiro é cultivado há milhares de anos no Brasil, e feijões de origem mesoamericana foram encontrados em sítios arqueológicos, com indicações de que houve um intercâmbio entre as populações indígenas do México e do Brasil (Freitas, 2006). Desse modo, a introdução de R. etli no Brasil pode ter sido via sementes do México, que são capazes de carregar células viáveis de rizóbios (Pérez-Ramirez et al., 1998). Contudo, também no noroeste da Argentina, feijões selvagens são predominantemente nodulados por R. etli (Aguilar et al., 2004) e Santa Catarina é uma antiga e conhecida rota de tropeiros da Argentina para o Brasil; desse modo, essa seria outra rota provável de introdução de R. etli em Santa Catarina.

Nos solos catarinenses, R. leguminosarum representou a segunda maior população, com 32,5 % dos isolados. Na descrição de R. etli, Segovia et al (1993) levantaram a hipótese de que, com a colonização da América, sementes de feijão carregando R. etli foram introduzidas na Europa, onde provavelmente ocorreu a transferência do plasmídeo simbiótico, primeiro para R. leguminosarum (Segovia et al., 1993) e, posteriormente, deste para R. gallicum bv. phaseoli e R. giardinii bv. phaseoli (Amarger et al., 1997). A espécie R. leguminosarum, porém, já foi amplamente detectada em vários ecossistemas brasileiros (Straliotto et al., 1999; Andrade et al., 2002; Mostasso et al., 2002; Giongo et al., 2007; Pinto et al., 2007). É interessante observar, ainda, que R. leguminosarum também foi detectada na Colômbia (Eardly et al., 1995), país sugerido como um terceiro centro de diversificação genética do feijoeiro (Gepts & Debuck, 1991), portanto essa espécie de rizóbio poderia também ser nativa da América do Sul. Neste estudo, as três enzimas de restrição utilizadas na análise de RFLP-PCR não conseguiram diferenciar as espécies R. leguminosarum e R. gallicum, contudo, os isolados catarinenses devem pertencer à espécie R. leguminosarum, visto que, até o presente momento, R. gallicum bv.gallicum ainda não foi encontrada nos solos brasileiros (Mostasso et al., 2002).

A terceira espécie mais abundante (17,1 %) encontrada em Santa Catarina foi R. tropici, que, originalmente, foi isolada de nódulos de feijoeiro na Colômbia e tem sido abundantemente encontrada no Brasil, em estudos utilizando como planta-isca tanto o feijoeiro, como Leucaena spp. (Martínez-Romero et al., 1991; Mercante et al., 1998; Hungria et al., 2000; Pinto et al., 2007). Uma primeira hipótese foi a de que a espécie seria nativa da América do Sul (Martinez-Romero et al., 1991), e é possível que tenha sido introduzida no País vinda da Colômbia, ou de algum país vizinho, pois existiam vários caminhos indígenas ligando os Andes ao Oceano Atlântico (Beltrão, 2005). Este pode ter sido o caminho de introdução e dispersão de feijões e de R. tropici no Brasil, onde a espécie teria encontrado condições ideais de adaptação, uma vez que apresenta maior tolerância à acidez e a temperaturas elevadas (Martinez-Romero et al., 1991; Hungria et al., 1993, 2000; Mercante et al., 1998). A origem da espécie R. tropici, porém, ainda é incerta, uma vez que também foi isolada de nódulos do feijoeiro ou de outras leguminosas em outros continentes, por exemplo, na África (Anyango et al., 1995), embora R. tropici também possa ter sido introduzido nesses continentes via sementes de feijão comercializadas, provenientes da América do Sul ou da Europa. Finalmente, a espécie também poderia ser um microssimbionte de outras leguminosas e possíveis candidatos no Brasil seriam os gêneros Mimosa e Gliricidia, que estabelecem simbioses bastante efetivas com R. tropici (Acosta-Durán & Martínez-Romero, 2002; Germano et al., 2006; Menna et al., 2006).

Duas estirpes catarinenses foram classificadas como Rhizobium giardinii, uma espécie capaz de nodular o feijoeiro, mas caracterizada pela baixa capacidade de fixação de N₂ (Amarger et al., 1997). Finalmente, 15 isolados (12,8 %) não formaram agrupamento com nenhuma das cinco espécies já descritas de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro, podendo representar novas espécies de rizóbios.

Houve predominância de R. tropici nos solos mais ácidos, em média, 4,9, enquanto R. leguminosarum e, principalmente, R. etli predominaram em pH mais elevado, em média 5,4 e 5,9, respectivamente. Essa distribuição deve estar relacionada com a tolerância elevada de R. tropici à acidez (Martinez-Romero et al., 1991; Anyango et al., 1995; Mercante et al., 1998; Hungria et al., 2000; Pinto et al., 2007). Finalmente, cabe salientar que a diversidade elevada de rizóbio, detectada em pequenas propriedades em Santa Catarina, pode indicar que as técnicas e insumos utilizados na agricultura familiar favorecem a biodiversidade; contudo, é importante ressaltar que, em dez propriedades com descarte contínuo de resíduos de suínos, não foi observado nenhum nódulo.

Este estudo é pioneiro na caracterização da diversidade genética de comunidades de rizóbios em áreas produtoras de feijão do Estado de Santa Catarina. A análise do DNA de 117 isolados por rep-PCR e por RFLP-PCR do 16S rRNA indicaram diversidade genética intra- e interespecífica elevada, inclusive com a indicação de novas espécies de rizóbios. Essa diversidade genética pode representar uma fonte importante de genes com potencial biotecnológico para a agricultura e para o meio ambiente, bem como de estirpes com maior capacidade de fixação biológica do N₂ com a cultura do feijoeiro. A funcionalidade dessas comunidades precisa ser determinada, visando a delinear estratégias que permitam incrementar a contribuição da fixação biológica do N₂.

CONCLUSÕES

1. A diversidade genética intra-específica de rizóbios microssimbiontes do feijoeiro em Santa Catarina mostrou-se elevada, com 91 % dos isolados deste estudo apresentando perfis únicos de DNA analisados por rep-PCR.

2. A composição de espécies de rizóbios microssimbiontes de feijoeiro em Santa Catarina consistiu de 17,1 % de Rhizobium tropici, 35,9 % de R. etli, 32,5 % de R. leguminosarum, 1,7 % de R. giardinii e 12,8 % de perfis distintos, podendo representar novas espécies.

3. R. tropici ocorreu preferencialmente em solos mais ácidos, enquanto R. leguminosarum e R. etli apresentaram maior ocorrência em solos com pH mais elevado.

AGRADECIMENTOS

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (MCT/CNPq), pelo auxilio financeiro (processo 471773/2004-2 e 552393/2005-3). P. Stocco é bolsista de mestrado e V.P. Vargas de iniciação científica do CNPq. Os autores agradecem a Fernando G. Barcellos, Pâmela Menna, Alan A. Pereira e Lígia Maria O. Chueire (Embrapa Soja), pelo auxílio em várias etapas deste estudo.

LITERATURA CITADA

Recebido para publicação em fevereiro de 2007 e aprovado em dezembro de 2007.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Ago 2008
• Data do Fascículo
  Jun 2008

Histórico

• Aceito
  Dez 2007
• Recebido
  Fev 2007