Constituintes químicos da ascídia didemnum psammatodes (sluiter, 1895) coletada na costa cearense

Chemical constituent from the ascidian didemnum psammatodes (sluiter, 1895) collecter on the shores of ceara state

chemical contituents; Didemnum psammatodes; tunicate

ARTIGO

Constituintes químicos da ascídia didemnum psammatodes (sluiter, 1895) coletada na costa cearense

Chemical constituent from the ascidian didemnum psammatodes (sluiter, 1895) collecter on the shores of ceara state

Renata Takeara^I; João Luis Callegari Lopes^I,*; Norberto Peporine Lopes^I; Paula Christine Jimenez^II; Letícia Veras Costa-Lotufo^II; Tito Monteiro da Cruz Lotufo^III

^IDepartamento de Física e Química, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Av. do Café, s/n, 14040-903 Ribeirão Preto - SP, Brasil

^IIDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal do Ceará, CP 3157, 60430-270 Fortaleza - CE, Brasil

^IIIDepartamento de Engenharia de Pesca, Universidade Federal do Ceará, CP 12168, 60455-760 Fortaleza - CE, Brasil

ABSTRACT

Chemical investigation of the methanolic extract of the ascidian Didemnum psammatodes has led to the identification of the nucleosides 2'-deoxyuridine (1), thymidine (2), 2'-deoxyinosine (3) and 2'-deoxyguanosine (4), the steroids cholestanol, cholestanone and stigmasterol in mixture and batyl alcohol plus two analogs, 1-heptadecyloxy-2,3-propanediol and 1-nonadecyloxy-2,3-propanediol in mixture. Their structures were proposed by NMR, MS and comparison with literature data and GC-MS analysis.

Keywords: chemical contituents; Didemnum psammatodes; tunicate.

INTRODUÇÃO

O ambiente marinho é considerado uma rica fonte de compostos com atividades biológicas interessantes, como agentes anti-tumorais, antiinflamatórios, analgésicos, imunomodulatórios, alergênicos e antivirais¹. As ascídias são invertebrados marinhos produtores de uma gama destes compostos, sendo a maioria deles derivados de aminoácidos^2,3. Alguns destes derivados e alguns alcalóides de ascídias encontram-se em fase de triagem clínica como agentes anti-tumorais^1,4.

Didemnidae é a maior família de ascídias em termos de número de espécies e tem provado ser uma grande fonte de compostos naturais com diversidade química e potente propriedade biológica. Várias espécies do gênero Didemnum já foram investigadas quanto à composição química, encontrando-se predominância de alcalóides^5,6, muitos deles com atividade citotóxica^5,7-10.

Didemnum psammatodes apresenta ampla distribuição geográfica, com registros em praticamente todos os mares tropicais, sendo particularmente abundante no litoral brasileiro¹¹. Pouca coisa é conhecida acerca de suas propriedades biológicas. Um estudo preliminar que descreveu a atividade citotóxica do extrato bruto das 10 espécies de ascídias mais abundantes da costa do Ceará mostrou que D. psammatodes possui atividade antimitótica sobre ovos de ouriço do mar¹². Entretanto, não há relatos na literatura sobre a composição química desta espécie. Sendo assim, o presente trabalho descreve os principais componentes químicos da ascídia D. psammatodes.

PARTE EXPERIMENTAL

Instrumentação e procedimentos gerais

Os espectros de RMN ¹H foram obtidos em aparelhos de RMN Brucker DRX-400, operando em 400 MHz para ¹H e 100 MHz para ¹³C, respectivamente, com as amostras solubilizadas em CDCl₃, DMSO deuterado e D₂O. Os espectros bidimensionais de HMQC e HMBC foram obtidos em aparelho DRX-500.

Os espectros de massas foram obtidos em aparelho da Micromass, modelo Micromass Quattro LC com ionização por electrospray a 45 eV.

Para identificação dos esteróides foi utilizado cromatógrafo com fase gasosa acoplado a espectrômetro de massas, marca Shimadzu, modelo QP 2010, com coluna capilar HP-1, com 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm de espessura de filme, utilizando-se as seguintes condições: temperatura do injetor: 260 ºC; gás de arraste: He; temperatura inicial do forno: 200 ºC por 5 min, velocidade de aquecimento a 5 ºC/min até 280 ºC, permanecendo nessa temperatura por 30 min. O espectro de massas foi obtido por impacto de elétrons a 70 eV. O banco de dados utilizado foi o Wiley Mass Spectral Database.

Separações por CLAE foram realizadas em aparelho Shimadzu LC-6A, com detector de UV-visível modelo SPD-6A, colunas Shim-pack ODS-C₁₈ 4,6 x 250 mm (analítica) e 20 x 250 mm (preparativa).

Nas separações por cromatografia em coluna (CC) foram utilizadas colunas de vidro de dimensões variadas e como fase estacionária, sílica gel 60 (70-230 mesh ASTM, Sigma) e Sephadex LH-20 (25-100 µ, Pharmacia) como suporte, na proporção média de 1:100 entre amostra:adsorvente para sílica e Sephadex LH-20.

Nas análises por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) foram utilizadas placas de vidro contendo sílica gel GF₂₅₄ (Merck) e como reveladores foram utilizadas luzes UV com comprimentos de onda de 254 e 366 nm e nebulização com ácido sulfúrico seguida de aquecimento.

Solventes comerciais foram utilizados para cromatografias em coluna e em camada delgada comparativa, e grau cromatográfico para as purificações em CLAE.

Estudo químico da ascídia Didemnum psammatodes

Exemplares de D. psammatodes (606 g de massa úmida) foram coletados manualmente na zona entre-marés da Praia de Ponta Grossa, Icapuí, estado do Ceará.

Após a coleta, os animais foram lavados com água do mar para remoção de contaminantes, colocados em metanol e mantidos em freezer até o momento da extração. As amostras foram homogeneizadas em um volume de metanol 3 vezes superior à massa úmida total e o material foi, então, filtrado em papel de filtro e seco em evaporador rotativo, sob pressão reduzida, para remoção do metanol, sendo obtidos 12,15 g de extrato bruto (cerca de 2%).

Foram suspensos 8,41 g de extrato em metanol. O precipitado insolúvel foi removido por centrifugação. A parte solúvel em metanol (2,70 g) foi fracionada por cromatografia em coluna de Sephadex LH-20 (MeOH) fornecendo 13 frações. A fração 8 foi posteriormente refracionada por cromatografia em Sephadex LH-20, fornecendo 5 frações. A subfração 8.2, segunda fração desta coluna, foi purificada por CLAE (coluna ODS preparativa; solvente: MeOH/H₂O 1:9; fluxo: 9 mL/min; detecção: 250 nm), fornecendo 1 mg de 2'-deoxiuridina (1), 2 mg de 2'-deoxiinosina (3) e 1 mg de timidina (2). Na subfração 8.3, terceira da coluna, formou-se precipitado branco, o qual foi separado do sobrenadante por filtração. O precipitado (7 mg) foi identificado como 2'-deoxiguanosina (4). Na fração 9 também formou precipitado branco, o qual foi separado do sobrenadante por filtração. O precipitado (4 mg) foi identificado também como 2'-deoxiguanosina (4).

Uma alíquota do extrato insolúvel em metanol (2,0 g) foi suspensa em diclorometano, ocorrendo solubilização de 0,218 g, o qual foi submetido à cromatografia em coluna (CC) de sílica gel, utilizando-se como eluentes diclorometano, misturas de diclorometano/MeOH e MeOH em gradiente de polaridade, fornecendo 9 frações. A fração 3 (obtida em diclorometano/MeOH 9:1) foi identificada como uma mistura dos esteróides colestanol, colestanona e estigmasterol (28 mg) por CG-EM, cujos dados são citados abaixo. A fração 4 (obtida em diclorometano/MeOH 9:1) foi purificada por CC de sílica gel utilizando-se como eluentes misturas de hexano/AcOEt e MeOH em gradiente de polaridade, resultando em álcool batílico e seus análogos 2,3-propanodiol, 1-heptadeciloxi e 2,3-propanodiol, 1-nonadeciloxi, obtidos e analisados em mistura (5 mg).

Colestanol

t.r. 22,437 min; EIMS [m/z (intensidade relativa)]: 388 (45%, M^-·), 373 (38%), 355 (15%), 331 (5%), 262 (17%), 233 (87%), 215 (100%), 165 (41%), 95 (64%), 81 (64%), 55 (61%).

Colestanona

t.r. 22,938 min; EIMS [m/z (intensidade relativa)]: 386 (35%, M^_•), 371 (13%), 231 (100%), 217 (31%), 163 (20%), 95 (38%), 81 (37%), 55 (45%).

Estigmasterol

t.r. 24,708 min; EIMS [m/z (intensidade relativa)]: 412 (16%, M^_•), 281 (10%), 273 (53%), 255 (35%), 161 (40%), 149 (53%), 137 (52%), 121 (29%), 107 (37%), 97 (50%), 83 (84%), 69 (100%), 55 (77%).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fracionamento do extrato metanólico da ascídia D. psammatodes resultou no isolamento e identificação dos nucleosídeos 2'-deoxiuridina (1), timidina (2), 2'-deoxiinosina (3) e 2'-deoxiguanosina (4), na identificação da mistura dos esteróides colestanol, colestanona e estigmasterol e da mistura do álcool batílico e seus análogos 2,3-propanodiol, 1-heptadeciloxi e 2,3-propanodiol, 1-nonadeciloxi. As estruturas dos nucleosídeos 2'-deoxiuridina^13,14 (1), timidina^14,15 (2), 2'-deoxiinosina^13,14 (3) e 2'-deoxiguanosina¹⁴ (4) e do álcool batílico¹⁴ e seus dois análogos 2,3-propanodiol, 1-heptadeciloxi¹⁶ e 2,3-propanodiol, 1-nonadeciloxi¹⁷ foram elucidadas com base nas análises dos dados de EM, RMN ¹H e ¹³C e espectros bidimensionais COSY ¹H-¹H, HMQC e HMBC, além de comparação com dados publicados anteriormente. Os esteróides foram identificados através de análises por CG-EM, comparando-se os espectros obtidos com os espectros existentes no banco de dados Wiley Mass Spectral Database e com padrões autênticos existentes no laboratório.

Os nucleosídeos observados no presente estudo já foram identificados em diversos organismos marinhos, incluindo ascídias, sendo que timidina já foi encontrada anteriormente no gênero Didemnum¹⁸. 2'-deoxiuridina, timidina e 2'-deoxiinosina foram isoladas da ascídia Trididemnum cereum¹³, da ascídia Aplidium pantherinum¹⁹ e da esponja Carteriospongia sp.²⁰; 2'-deoxiuridina e timidina foram isoladas da esponja Phakellia mauritiana²¹; timidina foi encontrada na esponja Crambe crambe²², na esponja Mycale tenuispiculata²³, na ascídia Eudistoma sp.²⁴ e na ascídia Atriolum robustum²⁵; 2'-deoxiuridina foi isolada da esponja Spongia sp.²⁶ e 2'-deoxiguanosina foi encontrada nos briozoários marinhos Cellaria spp²⁷.

Diversas espécies de ascídias foram anteriormente analisadas e mostraram conter misturas com colesterol como componente majoritário^28-30. O colestanol foi encontrado na túnica da ascídia Phallusia nigra³¹; na ascídia Microcosmus sulcatus²⁸; na ascídia Polizoa opuntia³⁰ e nas ascídias Styela sp. e Phallusia sp³². A colestanona foi identificada na ascídia Styela sp.³² A presença de esteróides vegetais em ascídias, como estigmasterol, pode ser proveniente de fontes dietéticas planctônicas, por serem animais filtradores^30,31 ou podem ser provenientes de simbiontes³⁰.

O álcool batílico e seus análogos também foram encontrados em outras fontes marinhas. O 2,3-propanodiol, 1-heptadeciloxi foi encontrado anteriormente na esponja Haliclona sp¹⁶. O álcool batílico também foi isolado da esponja Ulosa ruetzleri³³; da esponja Tedania ignis³⁴, da esponja Haliclona sp.¹⁶, da esponja Suberites vestigium³⁵ e da esponja Mycale mytilorum³⁶. O 2,3-propanodiol, 1-nonadeciloxi foi encontrado anteriormente na esponja Suberites vestigium³⁵.

Assim, as substâncias encontradas não são inéditas e estão coerentes com o perfil químico do gênero Didemnum, sendo este o primeiro estudo sobre a composição química da espécie D. psammatodes.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP pela bolsa de pós-graduação concedida e ao CNPq, pelos auxílios (Projeto Milênio, processo nº 420015/05-1) e bolsas concedidas.

Recebido em 7/7/06; aceito em 9/11/06; publicado na web em 14/5/07

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2007
• Data do Fascículo
  Out 2007

Histórico

• Aceito
  14 Maio 2007
• Recebido
  07 Jul 2006