Emergência e análise ultraestrutural de plântulas de soja inoculadas com Sclerotinia sclerotiorum sob efeito da aplicação de Trichoderma harzianum

Emergence and ultrastructural analysis of soybean seedlings inoculated with Sclerotinia sclerotiorum under the effect of Trichoderma harzianum application

RESUMO

A elevada susceptibilidade da soja ao mofo-branco tem impactado negativamente a sua produtividade. Atualmente métodos de controle biológico como o uso de Trichoderma spp. têm proporcionado alternativas ao controle químico, com menor impacto ambiental e favorecimento do desenvolvimento vegetal. Objetivou-se avaliar os efeitos de T. harzianum sobre a emergência de sementes de soja inoculadas com Sclerotinia sclerotiorum; além de verificar a interação entre os fungos e com a soja, por meio da microscopia eletrônica de varredura (MEV). Sementes de soja foram submetidas aos tratamentos: 1. Sem S. sclerotiorum, em BDA+Manitol; 2. Com S. sclerotiorum, em BDA+Manitol; 3. Com Ecotrich^®WP e sem S. sclerotiorum, em BDA+Manitol; 4. Com S. sclerotiorum e Ecotrich^® WP, em BDA+Manitol. O teste de emergência foi conduzido em bandejas com areia esterilizada a 25 ºC por 8 dias. Após isto foram seccionados órgãos vegetativos das plântulas emergidas para avaliar, por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV), o potencial de T. harzianum em parasitar e inibir S. sclerotiorum. De fato, o mofo-branco é capaz de colonizar e deteriorar todas as sementes de soja. T. harzianum mostra-se efetivo em colonizar o sistema radicular da soja, porém não contribui para a emergência quando comparada com a testemunha. A análise ultraestrutural permitiu evidenciar o micoparasitismo de T. harzianum a S. sclerotiorum, porém o controle do agente causal do mofo-branco não foi efetivo quanto se mostrou em outros estudos.

Palavras-chave Controle biológico; Glycine max; Mofo-branco; Microscopia Eletrônica de Varredura

ABSTRACT

The high susceptibility of soybean to white mold has negatively impacted its productivity. Currently, biological control methods, such as the use of Trichoderma spp., have provided alternatives to chemical control, as they promote less environmental impact and favor the plant growth. The aim of this study was to evaluate the effects of T. harzianum on the emergence of soybean seeds inoculated with Sclerotinia sclerotiorum, besides identifying the interaction between fungi and soybeans by means of scanning electron microscopy (SEM). Soybean seeds were subjected to the following treatments: 1. Without S. sclerotiorum, in PDA+Mannitol; 2. With S. sclerotiorum, in PDA+Mannitol; 3. With Ecotrich^®WP and without S. sclerotiorum, in PDA+Mannitol; 4. With S. sclerotiorum and Ecotrich^® WP, in PDA+Mannitol. The emergence test was conducted on trays with sterile sand at 25 °C for 8 days. Then, the vegetative organs of emerged seedlings were sectioned to evaluate, by scanning electron microscopy (SEM), T. harzianum potential to parasitize and inhibit S. sclerotiorum. In fact, the white mold is capable of colonizing and deteriorating all soybean seeds. T. harzianum is effective in colonizing the root system of soybeans but does not contribute to emergence, compared to control. Based on the ultrastructural analysis, mycoparasitism of T. harzianum and S. Sclerotiorum was evidenced, but the control of the causal agent of white mold was not as effective as shown in other studies.

Keywords Biological control; Glycine max; White mold; Scanning Electron Microscopy

A soja é a principal cultura do agronegócio brasileiro, com 31,94 milhões de hectares plantados e produção aproximada de 97 milhões de toneladas de grãos colhidos na safra de 2014/2015. O país é o segundo maior produtor e maior exportador mundial com índices de 50,8 milhões de toneladas (⁸). Essa expansão produtiva decorre da crescente utilização da soja na alimentação humana e animal e na produção de biodiesel.

A alta susceptibilidade a doenças e o uso de sementes com baixa qualidade, limitam à obtenção de altos rendimentos no cultivo da soja (¹⁸). Dentre estas, o mofo branco é considerado uma das doenças de maior importância na cultura, pois em condições ambientais favoráveis causa grandes perdas na lavoura (¹¹). Estima-se que no Brasil a sua ocorrência se deu em quase sete milhões de ha de área de cultivo de soja na safra 2013/2014 (²³).

O agente causal do mofo branco (Sclerotinia sclerotiorum L. de Bary) tem como hospedeiros mais de 400 espécies de plantas, dentre esta a soja (³). O patógeno se associa às sementes como micélio dormente ou na forma de escleródios e reduz drasticamente o potencial germinativo, o vigor e a emergência (¹⁴).

O emprego de fungicidas químicos aplicados em sementes é amplamente utilizado na prevenção e na redução do inóculo inicial (¹¹). Deste modo, o controle biológico tem sido utilizado como uma alternativa sustentável, por meio da aplicação de microrganismos antagonistas a patógenos habitantes do solo (²², ²⁷, ²⁹).

Os fungos do gênero Trichoderma são agentes de controle biológico que exercem antagonismo a diversos fungos, inclusive Sclerotinia sclerotiorum, por meio de parasitismo, antibiose e/ou competição, além de contribuir na promoção de crescimento das plantas (²,¹³, ¹⁹, ³², ³⁴).

A relação de Trichoderma spp.com a planta ocorre, em geral, na região das raízes onde o fungo coloniza a epiderme e as células do córtex, onde uma série de mecanismos bioquímicos acionam transduções de sinais de respostas de defesa da planta contra patógenos diversos (³⁵). Lamdan et al. (¹⁷) verificaram que existem diversas proteínas secretadas por Trichoderma virens presentes quando em raízes de milho e ausente em sua ausência. Foi demonstrado que no secretoma estudado havia proteínas específicas importantes no diálogo molecular entre planta e fungo, as quais participam da ativação do sistema de defesa sistêmico vegetal. Yedidia et al. (³³) observaram o estímulo de proteínas relacionadas à patogenicidade (RP) em resposta à presença de T. harzianum em plantas. Além disso, sabe-se que a promoção de crescimento da planta pode ser favorecida pela solubilização de fosfato e micronutrientes por T. harzianum (¹⁹).

Sua atividade antagonística pode ocorrer pela produção de metabólitos voláteis e não voláteis, como ácido harziânico, alameticinas e tricolinas, além da atividade de diversas enzimas líticas, tais como quitinases, glucanases e proteases (², ¹⁶, ²⁵, ²⁶). Por fim, sua relação parasítica sobre fungos fitopatogênicos pode envolver eventos tais como localização, reconhecimento, contato direto, formação de estruturas em forma de gancho com função de apressórios, penetração, enovelamento e desenvolvimento de hifas paralelas, observados geralmente por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV) (¹, ²², ³⁵).

Diante do exposto objetivou-se com este trabalho conhecer, por meio de MEV, o efeito potencial de um produto à base de de T. harzianum em inibir o crescimento micelial de S. sclerotiorum em sementes de soja, e estudar os efeitos de ambos os fungos na emergência de plântulas.

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi conduzido no Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultraestrutural (LME) do Departamento de Fitopatologia da Universidade Federal de Lavras, localizada no município de Lavras, MG.

Obtenção das sementes de soja e isolados

As sementes utilizadas neste trabalho pertencem a cultivar M7110 IPRO, Monsoy^®, com tecnologia INTACTA RR2 e susceptível a S. sclerotiorum. O isolado de S. sclerotiorum, Ref. LAPS 412 é procedente de soja cultivada no município de Patos de Minas, MG, e pertence à coleção micológica do Laboratório de Patologia de Sementes da UFLA. O agente de controle biológico T. harzianum é proveniente do produto comercial Ecotrich^®, pó molhável (WP).

Tratamento de sementes

Escleródios do isolado de S. sclerotiorum (LAPS 412) foram transferidos para oito placas de Petri de 15 cm de diâmetro contendo o meio batata-dextrose-ágar (BDA) [HIMEDIA^®] acrescido do soluto Manitol [VETEC^®] com potencial osmótico ajustado para -1,0 Mpa (73,04 g/L), conforme o software SPMM (²⁴), e incubadas em câmara tipo BOD com temperatura ajustada para 20 ± 2 ºC e fotoperíodo de 12 horas, durante cinco dias.

Após a completa colonização das placas de Petri pelo crescimento micelial, foram distribuídas sobre a colônia fúngica, 50g de sementes de soja, por tratamento, as quais foram desinfestadas em solução de hipoclorito de sódio (1% por 1 minuto), lavadas em água esterilizada e secas em temperatura ambiente por 24 horas, e incubadas em câmara de crescimento a 20 ºC com fotoperíodo de 12 horas por um período de exposição de 48 horas em meio BDA com Manitol (¹⁰).

Após este período de 48 horas, as sementes foram submetidas aos respectivos tratamentos:

1. Testemunha (sementes sem inoculação de S. sclerotiorum);

2. Sementes inoculadas com S. sclerotiorum;

3. Sementes não inoculadas com S. sclerotiorum, porém tratadas com Ecotrich^®WP;

4. Sementes inoculadas com S. sclerotiorum e posteriormente tratadas com Ecotrich^®WP.

O produto comercial Ecotrich^®WP (Trichoderma harzianum) foi utilizado na proporção de 5g/200 mL de água destilada esterilizada. Em seguida, as sementes foram secas a temperatura ambiente por 24 horas para posterior teste de emergência.

Teste de emergência em areia

O teste de emergência foi realizado em bandejas plásticas contendo como substrato areia de textura média e esterilizada em autoclave (90 minutos a 120 ºC). Foram utilizadas 8 repetições de 25 sementes, totalizando 200 sementes por tratamento. Após a semeadura (3 cm de profundidade), as bandejas foram acondicionadas em câmara de crescimento vegetal, com temperatura de 25 ± 2 ºC, fotoperíodo de 12 horas durante 8 dias. A irrigação foi realizada uniformemente sempre que necessário (¹⁰).

No oitavo dia procedeu-se a contagem (%) das plântulas normais. As plântulas foram retiradas cuidadosamente da areia, avaliadas conforme as Regras para Análise de Sementes (⁵). Nos tratamentos que apresentaram emergência de plântulas, coletaram-se folhas, hipocótilos e raízes para realizar a análise de microscopia eletrônica de varredura. Quando houve emergência, coletaram-se apenas as sementes.

Análise ultraestrutural de órgãos vegetativos de soja por meio da Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Amostras de tecido vegetal foram coletadas e preservadas em solução fixativa Karnovsky (glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 2,0% em tampão de cacodilato de sódio 0,05M, CaCl₂ 0,001M, pH 7,2) e armazenadas a 4ºC por 24 horas (⁴).

Após a fixação as amostras foram lavadas em tampão cacodilato 0,05 M por três vezes de 10 minutos cada e transferidas para uma solução de tetróxido de ósmio 1% em água por 1 hora. Posteriormente foram lavadas em água destilada por três vezes e desidratadas em gradiente de acetona (25%, 50%, 75%, 90% e 100%) permanecendo por dez minutos em cada concentração e três vezes de dez minutos na concentração 100%, conforme Bozzola & Russel (⁴).

Após, as amostras foram tratadas em aparelho de ponto crítico Balzers CPD 030, onde a acetona foi substituída por CO₂. Os espécimes foram metalizadas com ouro em sputtering Balzers SCD 050, para observação em microscópio eletrônico de varredura Zeiss LEO EVO 40. As imagens geradas foram editadas utilizando software Corel Draw.

Delineamento experimental e análises estatísticas

Para o teste de emergência em areia, foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado, com quatro tratamentos e oito repetições. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o software estatístico Sisvar^® (⁹), e as médias foram comparadas pelo teste de Scott-knott a 5% de probabilidade (³⁰).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Teste de emergência em areia

O teste de emergência realizado em bandejas com areia evidenciou diferenças significativas (p<0,05) entre os tratamentos. A testemunha (sem S. sclerotiorum e sem T. harzianum) apresentou maior porcentagem de emergência de plântulas normais de soja (68,88%), seguido pelo tratamento com T. harzianum (45,5%); com S. sclerotiorum e T. harzianum (21,13%); e apenas com S. sclerotiorum (0,00%).

De fato, o agente causal do mofo-branco foi muito agressivo, reduzindo drasticamente a emergência das plântulas mesmo com a presença do agente de controle biológico testado. A alta agressividade desta doença tem sido relatada por diversos autores (²¹, ²⁸, ²⁹, ³²).

Nas condições utilizadas neste trabalho, o emprego do produto comercial Ecotrich^® WP à base de T. harzianum no tratamento de sementes não favoreceu a emergência de plântulas em relação à testemunha. Ferreira 2015 (¹⁰) relata que a presença de Trichoderma harzianum (Trichodermil^® SC 1306) e Trichoderma asperelum (Quality^®) em sementes de soja (ambos a 100g/100kg de semente) semelhantemente não favoreceu a emergência e o índice de velocidade de emergência, em condições de casa de vegetação.

Sabe-se que o emprego de Trichoderma como agente de controle biológico contra patógenos de plantas é efetivo apenas em condições ambientais e em substratos favoráveis ao seu desenvolvimento e à sua atividade antagonística (¹⁰, ¹³, ²², ²⁷,³¹). Chitrampalam et al. (⁷) e Zancan et al. (³⁴) também observaram a ineficiência de Trichoderma spp. sob condições desfavoráveis.

Figura 1
Eletromicrografia de varredura do estudo das interações entre Sclerotinia sclerotiorum e Trichoderma harzianum com as sementes de soja e entre si: A) Tratamento Testemunha: Fragmento de radícula de soja isenta de fungos; B e C) Tratamento com Sclerotiorum sclerotiorum (Ss) apenas, colonizando semente de soja em estádio de decomposição; D) Tratamento com Trichoderma harzianum (Th) apenas, colonizando radícula; E e F) Tratamento S. sclerotiorum com posterior aplicação de T. harzianum: micoparasitismo de T. harzianum sobre S. sclerotiorum em semente de soja.

Em geral, a habilidade de Trichoderma em promover um controle sistêmico do mofo-branco e estimular o crescimento das plantas está relacionada ao tipo de substrato, o qual ocasiona variações no grau de supressão contra o fitopatógeno. Estudo de plantas em meio enriquecido demonstraram maior efetividade de Trichoderma no controle de doenças foliares (⁷, ¹⁰, ²⁹, ³¹). Smolinska et al. (³¹) observaram que a adição de palha de trigo e bagaço de maçã enriquecidos com T. virens preveniu completamente a sobrevivência de escleródios no solo. Além disso, verificaram que compostos orgânicos avaliados como veiculadores de T. virens promoveram efeito positivo no crescimento de plântulas de alface. Tancic et al. (³²) obtiveram resultados com efeito significativamente positivo em experimentos realizados em casa de vegetação, na germinação, crescimento radicular e vigor de sementes de soja plantadas em vasos com substrato utilizando isolados de Trichoderma spp. antagonistas a S. sclerotiorum. Gorgen et al. (¹³) observaram que o uso da palhada de Brachiaria ruziziensis favoreceu a colonização de até 84% de escleródios por T. harzianum 1306 em soja.

Assim, as bandejas com areia utilizadas nos ensaios proporcionaram um ambiente rizosférico pobre em matéria orgânica, com baixa umidade, e provavelmente com uma comunidade microbiana de baixa diversidade e biomassa, o que pode reduzir a ação de T. harzianum em exercer antagonismo à S. sclerotiorum e promover melhor desenvolvimento vegetativo da planta.

Análise das eletromicrografias de varredura

No tratamento testemunha observaram-se radículas de soja sem a presença de fungos (figura 1A).

Por sua vez, no tratamento com apenas S. sclerotiorum foi evidente a colonização micelial generalizada das sementes (figura 1B e C), o que impediu a emergência de plântulas. Este fungo é capaz não apenas em germinar e colonizar a superfície de tecidos vegetais, mas também em penetrar e colonizá-los internamente, inclusive de forma necrotrófica (¹²,¹⁵).

Quando as sementes foram tratadas apenas com T. harzianum, sua colonização sobre as raízes de soja se deu de forma efetiva (figura 1D). Chao et al. (⁶), Chitrampalam et al. (⁷) e Louzada et al. (²⁰) afirmam que após o agente biológico desenvolver-se na espermosfera ele acaba acompanhando o desenvolvimento do sistema radicular da planta. Benitez et al. (²) classifica a interação entre Trichoderma spp. e planta como de simbiose, a qual se dá pela colonização da superfície externa das raízes, estendendo-se pelo rizoplano e com capacidade de penetração na epiderme radicular.

Quanto ao tratamento onde se desenvolveram tanto o agente de controle biológico como o patógeno, foi possível identificar o micoparasitismo de T. harzianum sobre S. sclerotiorum (figura 1E e F). No presente trabalho observou-se apenas o desenvolvimento de hifas paralelas, sem a presença de enovelamentos (figura 1E e F). Ao observar o antagonismo de T. harzianum contra Fusarium spp. Monteiro et al. (²⁵) verificaram também apenas contato paralelo. Nota-se que o antagonismo ocorre não apenas por modificações morfológicas, mas também pela competição por nutrientes e pela produção de diversas enzimas hidrolíticas (², ¹⁶, ²⁵, ²⁶).

O agente causal do mofo-branco é altamente agressivo, promovendo colonização e decomposição de 100% das sementes de soja quando na ausência de T. harzianum.

A microbiolização de sementes com T. harzianum demonstra que o agente de controle biológico é capaz de colonizar sementes e raízes das plântulas de soja, no entanto não teve capacidade de promover o controle do patógeno e a emergência de plântulas nas condições do estudo.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos a Universidade Federal de Lavras, a Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais/Fapemig, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico/CNPq, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior/Capes e a Financiadora de Estudos e Projetos/Finep.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Mar 2017

Histórico

• Recebido
  05 Jul 2016
• Aceito
  15 Ago 2016