Lentivírus em caprinos leiteiros do semiárido paraibano: prevalência de anticorpos, fatores de risco e detecção molecular

Lentivirus in dairy goats from the semiarid region of Paraiba state: seroprevalence, risk factors and molecular detection

ANIMAIS DE PRODUÇÃO

Lentivírus em caprinos leiteiros do semiárido paraibano: prevalência de anticorpos, fatores de risco e detecção molecular

Lentivirus in dairy goats from the semiarid region of Paraiba state: seroprevalence, risk factors and molecular detection

Maria L.C.R. Silva^I; Roberto S. Castro^II; Rita C. Maia^II; Sergio A. Nascimento^II; Ana Lisa V. Gomes^II; Sérgio S. Azevedo^I,*

^IUniversidade Federal de Campina Grande (UFCG), Centro de Saúde e Tecnologia Rural, Unidade Acadêmica de Medicina Veterinária, Av. Universitária s/n, Patos, PB 58700-970, Brasil

^IIDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, Recife, PE 52171-900, Brasil

RESUMO

Os objetivos do presente trabalho foram determinar a prevalência de caprinos leiteiros soropositivos para a infecção por Lentivirus de pequenos ruminantes no semiárido do Estado da Paraíba, Nordeste do Brasil, identificar fatores de risco associados à prevalência de rebanhos positivos, e realizar a detecção molecular do agente. Foram utilizadas 1047 cabras leiteiras de 110 propriedades selecionadas aleatoriamente no Município de Monteiro, Estado da Paraíba, no período de março de 2009 a dezembro de 2011. Para o diagnóstico da infecção por Lentivirus, foi utilizado o teste de imunodifusão em gel de ágar (AGID). Um ano após foi realizada nova sorologia, e PCR em tempo real foi aplicada em amostras de sangue e leite de 48 cabras procedentes de quatro propriedades com animais soropositivos. As prevalências de propriedades positivas e de animais soropositivos na AGID foram 44,6% (IC 95% = 35,1% - 54,3%) e 8,1% (IC 95% = 5,6% - 16,8%), respectivamente. Realizar corte e desinfecção de umbigo (odds ratio = 2,44; p = 0,048) e condições de aglomeração de animais (odds ratio = 3,45; p = 0,048) foram associadas com a prevalência de propriedades positivas. Um ano após a realização do inquérito sorológico, foi verificada a permanência de animais infectados, detectados por PCR em tempo real a partir de amostras de sangue e leite. A PCR em tempo real das amostras de leucócitos circulantes apresentou boa performance, com sensibilidade de 100%, especificidade de 92,86%, concordância de 93,75% e indicador Kappa de 0,765. Sugere-se que seja realizado um trabalho de educação sanitária junto aos produtores sobre medidas de prevenção com o objetivo de reduzir a disseminação da infecção nos rebanhos.

Termos de indexação: Lentivírus, artrite-encefalite caprina, caprinos leiteiros, soroepidemiologia, PCR em tempo real.

ABSTRACT

The aims of this study were to determine the seroprevalence of infection by ruminants Lentivirus in dairy goats in the semiarid of the Paraiba State, Northeastern Brazil, to identify risk factors associated with the herd-level prevalence and to perform molecular detection of the agent. A total of 1,047 dairy goats from 110 herds were randomly selected from the county of Monteiro, Paraiba State, and serum samples were collected from March 2009 to December 2011. For the diagnosis of Lentivirus infection, the agar gel immunodiffusion test (AGID) was used. One year after that a new serology was performed and the real-time PCR assay was applied in blood and milk samples from 48 goats from four herds with seropositive animals. Prevalence of positive herds and seropositive animals at AGID were 44.6% (95% CI=35.1-54.3%) and 8.1% (95% CI =5.6-16.8%), respectively. Umbilical cord cutting and disinfection (odds ratio = 2.44; p = 0.048) and conditions of animal agglomeration (odds ratio=3.45; p=0.048) were associated with herd-level prevalence. One year after the serological profile, the permanence of infected animals detected by real-time PCR in blood and milk samples was verified. Real-time PCR using white blood cells had a good performance, with sensitivity of 100%, specificity of 92.86%, concordance of 93.75% and Kappa index of 0.765. It was suggested to teach sanitary measures to the herd owners in order to encourage them to adopt prevention measures aiming to reduce the spread of the infection in the herds.

Index terms: Lentivirus, caprine arthritis-encephalitis, dairy goats, seroepidemiology, real-time PCR.

INTRODUÇÃO

Os lentivírus de pequenos ruminantes (SRLV) compreendem o vírus da artrite encefalite caprina (Caprine arthritis encephalitis virus - CAEV) e o vírus Maedi-Visna, relacionados antigenicamente e fenotipicamente, pertencentes ao gênero Lentivirus, família Retroviridae (Valas et al. 2000). A maioria dos casos de infecção por SRLV tem curso subclínico (Costa et al. 2007), causando perdas econômicas decorrentes da diminuição da vida produtiva e da produção leiteira, falhas reprodutivas, predisposição da glândula mamária a infecções bacterianas, retardo no crescimento das crias, mortalidade neonatal, descarte de animais doentes, desvalorização comercial dos produtos de criatórios com animais positivos e despesas com programas de controle (Greenwood 1995, Concha-Bermejillo 1997)

A infecção compromete vários sistemas como o locomotor, reprodutivo, respiratório e nervoso, apresentando evolução lenta, degenerativa e crônica, com sintomatologia variável, caracterizada por emagrecimento, artrite (principalmente na articulação carpo-metacarpiana), mastite e encefalites (Callado et al. 2001). Em caprinos, a principal via de transmissão é a ingestão de colostro e leite contaminados (Rowe & East 1997, Guedes et al. 2001, Blacklaws et al. 2004).

O diagnóstico laboratorial da infecção por SRLV é baseado primariamente na detecção de anticorpos contra proteínas estruturais dos vírus, e nesse contexto a imunodifusão em gel de ágar (AGID) é o teste mais utilizado (Karanikolaou et al. 2005). No entanto, os métodos para detecção de anticorpos podem apresentar baixa sensibilidade em decorrência da variação antigênica do vírus e da existência de animais que não desenvolvem resposta humoral. Dessa maneira, a utilização da reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção molecular do agente tem se mostrado uma alternativa importante aos métodos sorológicos (Leginagoikoa et al. 2009).

Os SRLV já foram detectados em diversos países, inclusive no Brasil, pela detecção de anticorpos ou isolamento dos agentes. No Brasil, a primeira descrição de ocorrência de lentiviroses ocorreu no Estado do Rio Grande do Sul (Moojen et al. 1986). A partir daí, vários estudos demonstraram a presença dessa infecção em caprinos em vários estados: Minas Gerais, Pernambuco, Ceará, Sergipe, Bahia, São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo, Goiás, Maranhão, Mato Grosso do Sul, Pará, Paraíba, Piauí, Rio Grande do Sul, Paraná e Rio Grande do Norte (Callado et al. 2001, Pinheiro et al. 2001, Batista et al. 2004, Silva et al. 2005).

Apesar dos vários estudos conduzidos no território brasileiro apontarem a ocorrência de lentiviroses em caprinos, não há estudos baseados em amostragem planejada no Estado da Paraíba. Dessa maneira, os objetivos do presente trabalho foram determinar a prevalência de propriedades positivas (focos) e de animais soropositivos, e identificar fatores de risco para a infecção por lentivírus em caprinos leiteiros no semiárido da Paraíba, bem como realizar diagnóstico direto pela detecção molecular do agente.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de estudo

O trabalho foi conduzido durante o período de março de 2009 a dezembro de 2011 no Município de Monteiro (7º53'S, 37º5'W), mesorregião do Cariri Ocidental, semiárido do Estado da Paraíba. O clima da região é semiárido, com temperatura média de 22ºC. A altitude é 599 metros acima do nível do mar. O município se destaca na produção de leite de cabra no Estado da Paraíba e no Brasil, com um total de 90 mil litros mensais, e possui o maior efetivo de caprinos do Estado, com 30.240 animais (Brasil 2009).

Delineamento amostral e colheita de amostras

O delineamento utilizado foi de um estudo transversal, e a amostragem foi delineada para a determinação da prevalência de propriedades positivas (focos) e de animais soropositivos, sendo realizada em duas etapas: (1) seleção aleatória de um número pré-estabelecido de propriedades (unidades primárias); (2) dentro das unidades primárias, foi amostrado, aleatoriamente, um número pré-estabelecido de caprinos (unidades secundárias).

Para o cálculo do número de unidades primárias a serem amostradas, foram considerados os seguintes parâmetros: (a) prevalência esperada de 50% (utilizada para a maximização da amostra); (b) erro absoluto de 5%; e (c) nível de confiança de 95%, de acordo com a fórmula para amostras aleatórias simples (Thrusfield 2007). De acordo com o Centro de Desenvolvimento Integrado da Ovinocaprinocultura da Paraíba (CENDOV), havia 155 propriedades de exploração de cabras leiteiras cadastradas. Com base nesses dados, o número de unidades primárias a serem visitadas foi de 110.

O número de animais testados para um rebanho ser classificado como positivo ou negativo foi calculado com base no valor de sensibilidade e especificidade agregadas (Donald et al. 1994). Dessa forma, o cálculo do número de unidades secundárias foi realizado com o programa Herdacc versão 3.0 (University of Guelph, Guelph), de modo a ser obtido um valor de sensibilidade e especificidade agregadas de pelo menos 90% (Jordan 1996), utilizando os seguintes parâmetros: a) sensibilidade e especificidade do teste de imunodifusão em gel de ágar (AGID) em nível individual, de 90% e 100%, respectivamente (Karanikolaou et al. 2005); b) tamanho do rebanho; c) ponto de corte 1, ou seja, número mínimo de animais positivos para classificar o rebanho como foco. Após várias simulações no programa Herdacc versão 3.0, optou-se pelos seguintes tamanhos amostrais:

• Propriedades com até 100 fêmeas adultas => foram amostrados 12 animais.

• Propriedades com mais de 100 fêmeas adultas => foram amostrados 13 animais.

• Propriedades com até 12 fêmeas adultas => foram amostrados todos os animais.

No total, foram amostradas 1047 fêmeas caprinas adultas procedentes de 110 propriedades. Foram colhidos 10 mL de sangue por punção da veia jugular utilizando tubos a vácuo. As amostras foram centrifugadas e os soros foram armazenados a -20ºC até a realização da sorologia por AGID.

Um ano após a realização da AGID, foram selecionadas aleatoriamente por sorteio probabilístico 16 propriedades que apresentaram animais soropositivos no ano anterior, com colheita de sangue e leite de 179 fêmeas adultas. Foi realizada AGID nesses soros, e PCR em tempo real (qPCR) de leucócitos circulantes e leite de animais procedentes das propriedades que apresentaram pelo menos um animal soropositivo no segundo AGID. Foram colhidos 10 mL de sangue em tubos de vácuo heparinizados e 10 mL de leite. As amostras foram refrigeradas imediatamente, com processamento antes de completar seis horas após a colheita. O sangue heparinizado foi centrifugado por 10 minutos a 1500g a 4ºC, a intercamada (anel de leucócitos - "buffycoat") foi coletada e adicionada a 10 mL de solução de lise para células vermelhas. Depois de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente em rotação de shaker, centrifugou-se a 1500g por 10 min. O pellet foi ressuspendido em 200µl de PBS e congelado a -20ºC. O leite foi centrifugado por 10 minutos a 1500g a 4ºC, a camada de gordura e o soro foram removidos e o pellet foi ressuspendido em 1mL de PBS. O material foi transferido para outro tubo e adicionou-se 9mL de PBS, com posterior centrifugação por 10 minutos a 1500g a 4ºC. O pellet foi ressuspendido em 200µL de PBS e congelado a -20ºC. As amostras foram descongeladas, agitadas em vórtex por 15 segundos, e em seguida foi feita a extração do DNA com o kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Germany), segundo a técnica descrita por Brinkhof et al. (2010).

Imunodifusão em gel de ágar (AGID)

Para o diagnóstico sorológico, foi utilizado o microteste de imunodifusão em gel de ágar (micro-AGID), de acordo com a orientação do fabricante (Biovetech, Recife, PE), utilizando-se como antígeno a proteína p28 do vírus da Artrite-Encefalite Caprina. O teste foi realizado em placas de Petri de 90 mm de diâmetro, contendo 16mL de agarose a 1%, com padrão de perfuração composto por seis orifícios na periferia e um no centro, e no poço central foi adicionado o antígeno (10µL), enquanto que nos poços periféricos foram adicionados, de forma alternada, soro padrão positivo (10µL) e soros a serem testados (30 µL). As placas foram incubadas a 25ºC em câmara úmida, e leitura efetuada após 48 horas. Os soros foram considerados positivos quando ocorria a formação da linha de precipitação entre o poço central e o poço do soro testado, apresentando identidade com a linha formada entre o soro padrão positivo e o antígeno (OIE 2008).

PCR em tempo real (qPCR)

A PCR em tempo real (qPCR) foi executada no termociclador line - Gene K (Bioer, China), com todas as amostras em reações em duplicatas. Inicialmente foi realizado o estudo de controle endógeno da amostra através da pesquisa do gene constitutivo (12S) para caprino (housekeeping) com os primers 12S-R 5'-TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG-3' e 12S-F 5'- CGAGCCACCGCGGTCATACG-3'. A reação foi composta por 12,5µL do master mix Syber green (Qiagen), 20pmol de cada primer, 2µL da DNA da amostra e 6,5µL de dH₂O, totalizando 25µL por microtubo. Após resultado positivo no housekeeping realizou-se a qPCR específica para lentiviroses, com os primers CF2 5'-GTTCCAGCAACTGCAAACAGTAGCAATG-3' e CR2 5'-ACCTTTCTGCTTCTTCATTTAATTTCCC-3', que foram construídos a partir do gene gag, o qual é um gene conservado dos retrovírus, amplificando um fragmento de 185bp (Rimstad et al. 1993). As condições da reação foram as mesmas utilizadas para o gene constitutivo. Nas reações foram utilizados controles negativo (todos os reagentes menos a amostra de DNA) e positivo (para CAEV a amostra CAEV COR K e para o Maedi-Visna a amostra K 1514, isoladas de cultivo celular Cor FC da linhagem celular de córnea caprina imortalizada e desenvolvida no Laboratório de Virologia Animal da Universidade Federal Rural de Pernambuco, cujo DNA genômico de células infectadas foi diluído a 0,15ng/µL).

Análise dos dados

Para a análise de possíveis fatores de risco associados com a condição de propriedade positiva para a infecção por Lentivirus foram utilizados os dados coletados nos questionários epidemiológicos (Quadro 1). Uma propriedade foi considerada positiva quando apresentou pelo menos um animal soropositivo. A análise de fatores de risco foi conduzida em duas etapas: análise univariável e análise multivariável. Na análise univariável, cada variável independente foi cruzada com a variável dependente, e aquelas que apresentaram valor de p<0,20 pelo teste de qui-quadrado ou teste exato de Fisher foram selecionadas para a análise multivariável, utilizando-se regressão logística múltipla. O ajuste do modelo final foi verificado com o teste de Hosmer e Lemeshow, cujo valor de p>0,05 indica boa qualidade de ajuste (Hosmer & Lemeshow 2000). O nível de significância adotado na análise múltipla foi de 5%. Todas as análises foram realizadas com o programa SPSS 20.0 for Windows.

Foi realizada comparação dos testes de AGID e PCR em tempo real dos leucócitos e do leite, adotando como padrão-ouro a condição de animal infectado. Animais infectados foram arbitrariamente definidos como aqueles que apresentaram resultados positivos em no mínimo dois testes (Karanikolaou et al. 2005). Foram calculados sensibilidade, especificidade, concordância e indicador Kappa, com nível de confiança de 95%, utilizando o programa Dag Stat (Mackinnon 2000), e teste de hipóteses realizado com o teste de McNemar para amostras relacionadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No total, 49 rebanhos dos 110 pesquisados apresentaram pelo menos um animal soropositivo, com prevalência de 44,6% (IC 95%, 35,1-54,3%). Essa alta frequência de focos reflete a ampla distribuição do agente em rebanhos de caprinos leiteiros na região semiárida do estado da Paraíba, o que representa relevância do ponto de vista econômico, uma vez que a população-alvo incluiu propriedades de caprinos leiteiros de importante bacia leiteira, levando-se em consideração que prevalências elevadas de infecção por SRLV podem ter impacto negativo na produção de leite (Bandeira et al. 2009). No Brasil, outros inquéritos conduzidos em caprinos apontaram frequências variáveis de propriedades com animais soropositivos: Pinheiro et al. (2001), no Ceará, encontraram 4,6% (37/810) de propriedades positivas; Silva et al. (2005), no Rio Grande do Norte, encontraram 24 (57,14%) propriedades positivas entre 42 amostradas; e Bandeira et al. (2009), na Paraíba, pesquisaram 60 propriedades, das quais 21 (35%) apresentaram animais soropositivos.

Para animais, 85 cabras entre as 1047 examinadas foram soropositivas, com prevalência de 8,1% (IC 95%, 5,6-16,8%). Essa prevalência encontra-se dentro da variação das frequências de animais soropositivos encontradas em vários estudos conduzidos em caprinos no Brasil, que apontaram valores de 8,2% no estado da Paraíba (Bandeira et al. 2009) a 14,1% no Rio de Janeiro (Lilenbaum et al. 2007). Por outro lado, vale ressaltar que o uso de amostragem por conveniência em estudos soroepidemiológicos é muito comum e permite o levantamento de informações importantes, no entanto, inferência epidemiológica não deve ser feita a partir dessa metodologia em decorrência da possibilidade de vieses. No presente trabalho, foi utilizada amostragem planejada, com cálculo do número de propriedades e animais a serem amostrados.

A prevalência de 8,1% de animais soropositivos encontrada no presente trabalho levanta preocupação do ponto de vista epidemiológico, uma vez que foram utilizadas cabras adultas, e esses animais são potenciais fontes de infecção para os cabritos, que se infectam principalmente pela ingestão do colostro e/ou leite. Pesquisas anteriores mostraram que a infecção por SRLV ocorre com maior frequência em caprinos com mais de um ano de idade e a prevalência aumenta a partir de três anos em decorrência de transmissão horizontal (Rowe et al. 1992, Greenwood et al. 1995, Blacklaws et al. 2004, Al-Qudah et al. 2006, Kaba et al. 2011).

Na análise univariável para os fatores de risco, as variáveis associadas (p < 0,20) à prevalência de focos de SRLV foram: tipo de exploração, existência de cercas de boa qualidade, realizar vermifugação dos animais, realizar corte e desinfecção de umbigo, enterrar ou cremar animais mortos e realizar algum exame na compra de animais (Quadro 1). Na análise multivariável, as seguintes variáveis foram associadas com a prevalência de propriedades positivas (Quadro 2): realizar corte e desinfecção de umbigo (odds ratio=2,44; p=0,048) e existência de cercas de boa qualidade (odds ratio=3,45; p=0,048). O modelo final apresentou bom ajuste (χ² =1,095; p=0,895).

No presente trabalho, foi observada associação entre prevalência de propriedades positivas e condições de aglomeração de animais, facilitada por cercas de boa qualidade. Isso pode estar relacionado ao fato de que essa condição impede a dispersão de caprinos em determinada área, aumentando a concentração de animais e, consequentemente, as chances de transmissão de lentivírus por contato prolongado com secreções de animais infectados (Greenwood et al. 1995, Guedes et al. 2001).

A prática de corte e desinfecção de umbigo também foi associada com a prevalência de propriedades positivas, o que pode estar relacionado com a realização inadequada desse procedimento, ou seja, sem os devidos cuidados higiênicos, possibilitando a transmissão horizontal do agente por contato com secreções e excreções de animais infectados, principalmente de secreções genitais e sangue de fêmeas parturientes infectadas (East et al. 1993, Rowe & East 1997, Callado et al. 2001, Blacklaws et al. 2004).

Na segunda etapa do trabalho, dos 179 caprinos pesquisados oito animais procedentes de quatro propriedades foram soropositivos. Foi realizada PCR em tempo real dos leucócitos sanguíneos e no pelllet do leite em 48 fêmeas dessas quatro propriedades. Os resultados da comparação entre as técnicas estão apresentados no Quadro 3. No total, oito, nove e 11 animais foram positivos no AGID, PCR de leucócitos sanguíneos e PCR do leite, respectivamente. Esse resultado indica que houve permanência de animais infectados nos rebanhos, detectados por sorologia e métodos diretos, expondo outros animais ao risco de infecção. Isso é reforçado pelo fato de que as quatro propriedades apresentavam animais com sinais clínicos sugestivos de CAE, como artrite na articulação carpo-metacarpiana, pneumonias e mastite, evidenciados por ocasião da segunda visita.

Considerando como infectados animais com resultados positivos no mínimo em dois testes (Quadro 3), a PCR em tempo real de leucócitos sanguíneos apresentou melhor performance, com sensibilidade de 100%, especificidade de 92,86%, concordância de 93,75% e indicador Kappa de 0,765 (concordância boa). No diagnóstico de lentiviroses, deve-se levar em consideração os custos, a viabilidade e as características individuais do teste. No presente trabalho, foi feita associação dos resultados do teste de AGID, o qual é um teste indireto para detecção de anticorpos, com a PCR em tempo real, o qual é um teste direto para detecção de DNA proviral. A PCR em tempo real é capaz de aumentar a eficácia na detecção de animais infectados, pois detecta resultados falsos-negativos no teste de AGID. Além de melhorar a sensibilidade do diagnóstico de SRLV, evidencia o processo virêmico que pode ocorrer em infecções naturais e na ausência de resposta imune humoral detectável pela AGID. Já foi relatada a existência de animais soronegativos no ELISA que foram PCR-positivos (Wagter et al. 1998, Gil et al. 2006). Modolo et al. (2009) detectaram quatro animais positivos na PCR em 34 caprinos soronegativos na AGID, utilizando amostras de sangue heparinizado.

CONCLUSÃO

Conclui-se que a infecção por lentivírus, demonstrada pela detecção de anticorpos e PCR de sangue e leite, está disseminada em rebanhos de caprinos leiteiros do semiárido paraibano. Sugere-se que seja realizado um trabalho de educação sanitária junto aos produtores no sentido de encorajá-los acerca da condução de medidas de prevenção da infecção com o objetivo de reduzir sua disseminação nos rebanhos.

Agradecimentos.- Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado da Paraíba (FAPESQ) pelo apoio financeiro. Ao CNPq, pela concessão de bolsa de Produtividade em Pesquisa a S.S. Azevedo e R.S. Castro. À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de Doutorado a M.L.C.R. Silva.

Recebido em 18 de dezembro de 2012.

Aceito para publicação em 7 de março de 2013.

Parte da Tese de Doutorado do primeiro autor.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Maio 2013
• Data do Fascículo
  Abr 2013

Histórico

• Recebido
  18 Dez 2012
• Aceito
  07 Mar 2013