Indução de resposta inflamatória sistêmica e espessamento de artérias subepicárdicas em um modelo animal de uremia

ARTIGO ORIGINAL

Indução de resposta inflamatória sistêmica e espessamento de artérias subepicárdicas em um modelo animal de uremia

Induction of systemic inflammation and thickening of subepicardiac arteries in an animal model of uremia

Anthony Augusto Carmona^II; Bruno Gleizer da Silva Rigon^II; Michel Peter Barchik Salvatierra Barroso^II; Aline Borsato Hauser^I; Dalton Précoma^I; Sérgio Bucharles^II; Lúcia de Noronha^II; Roberto Pécoits-Filho^II

^IUniversidade Federal do Paraná - UFPR

^IIPontifícia Universidade Católica do Paraná - PUC/PR

^{Correspondência para}

RESUMO

A disfunção renal é um fator de risco para doença cardiovascular (DCV). Estudos experimentais controlados que possam analisar o impacto da disfunção renal no sistema cardiovascular, isolando esses fatores relacionados à uremia dos fatores de risco tradicionais, que são altamente prevalentes na população com doença renal crônica (DRC), ainda são escassos.

OBJETIVO: Analisar o impacto cardiovascular em ratos com disfunção renal, analisando biomarcadores de risco cardiovascular e a histologia das artérias subepicárdicas desses animais.

MÉTODOS: Estudo experimental envolvendo trinta ratos machos Wistar, divididos em dois grupos. Um grupo foi submetido à ablação renal e o outro grupo SHAM (grupo controle) à manipulação do pedículo renal. Ambos os grupos foram acompanhados por oito semanas, período em que foram feitas dosagens de ureia, fósforo e do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Lâminas obtidas de cortes do miocárdio foram confeccionadas para análise das características das arteríolas subepicárdicas.

RESULTADOS: O grupo DRC apresentou níveis elevados de uréia e fósforo em relação ao grupo SHAM. Já os níveis de TNF-α, em todas as análises, foram indetectáveis nos animais do grupo SHAM, em contraste com o grupo DRC, onde se observaram elevados níveis de TNF-α (p < 0,05). A espessura da camada média dos vasos subepicárdicos do grupo DRC foi significativamente maior do que em relação ao grupo SHAM (p = 0,011).

CONCLUSÃO: A indução de disfunção renal determinou alterações em biomarcadores de risco cardiovascular e um aumento na espessura dos vasos subepicárdicos estudados em comparação aos animais com função renal normal.

Palavras-chave: Doença das Coronárias. Falência Renal Crônica. Uremia. Modelos Animais.

ABSTRACT

Although renal dysfunction is a known risk factor for cardiovascular disease (CVD), there are few experimental studies investigating the cardiovascular consequences of this condition.

OBJECTIVE: To analyze the impact of the induction of renal dysfunction on biomarkers of cardiovascular risk and on the histology of subepicardial vessels.

METHODS: This experimental study involved thirty Wistar male rats, which were divided into two groups. One (chronic kidney disease - CKD group) underwent renal ablation, and the other (SHAM group) was submitted to kidney manipulation only. Both groups were followed up for eight weeks. During follow-up, serum levels of urea, phosphorus and TNF-α were measured. Heart tissue was processed for histological analysis.

RESULTS: The CKD group had increased levels of urea and phosphorus, in comparison with the SHAM group. The levels of TNF-α were increased in the CKD group and undetectable in the SHAM group (p < 0.05). Thickness of the middle layer of the subepicardial vessels of the CKD group was significantly higher than that of the SHAM group (p = 0.011).

CONCLUSION: Induction of renal dysfunction in rats increased the biomarkers of cardiovascular risk and led to a thickening of the subepicardial vessels when compared with normal controls,

Keywords: Coronary Disease. Kidney Failure, Chronic. Uremia. Models, Animal.

INTRODUÇÃO

A doença cardiovascular (DCV) representa a principal causa de morbidade e mortalidade entre os pacientes com disfunção renal, sendo a miocardiopatia e a doença arterial na forma de aterosclerose acelerada as suas principais traduções fisiopatológicas.^1-3 Postula-se que fatores de risco peculiares da uremia, como: anemia, sobrecarga de volume, toxicidade urêmica, inflamação sistêmica e distúrbios do metabolismo mineral estejam intimamente envolvidos na fisiopatologia da DCV relacionada à disfunção renal.² Estudos experimentais controlados que possam analisar o impacto da disfunção renal no sistema cardiovascular, isolando esses fatores relacionados à uremia dos fatores de risco tradicionais, que são altamente prevalentes na população com disfunção renal, ainda são escassos.

Uma resposta inflamatória sistêmica relacionada à disfunção renal é caracterizada em estudos clínicos por elevados níveis de proteína C-reativa (PCR) e citocinas pró-inflamatórias em até 50% dos pacientes em tratamento dialítico crônico.^4,5 Acredita-se que esse estado de inflamação sistêmica e a consequente exacerbação do estresse oxidativo colaboram para a aceleração das alterações cardiovasculares na uremia.⁶

Do ponto de vista miocárdico, as três lesões que constituem o remodelamento estrutural do miocárdio observado na doença renal crônica (DRC) são: hipertrofia miocárdica, fibrose intersticial e espessamento intramural de artérias e arteríolas.⁷ A doença vascular provocada pela uremia é tanto macrovascular quanto microvascular, e está associada a uma diminuição na complacência das artérias, em que a permeabilidade do vaso e a expressão de moléculas de adesão estariam alteradas.⁸ A maior expressão dessas moléculas de adesão leucocitária na superfície das células endoteliais favorece os fenômenos de progressiva oclusão arterial.⁹ Vasos subepicárdicos são, particularmente, suscetíveis a distúrbios metabólicos que aceleram o processo de DCV.

A hipótese do estudo é a de que a disfunção renal e o consequente acúmulo de compostos urêmicos e uma ativação da resposta inflamatória sistêmica determinem modificações na estrutura da parede arterial de animais de experimentação submetidos à redução de massa renal. O objetivo deste estudo foi o de analisar o comportamento de biomarcadores de risco cardiovascular e as alterações histológicas em artérias subepicárdicas em um modelo animal de uremia.

MÉTODOS

Foram utilizados ratos machos Wistar com peso entre 200 a 260 g. A indução de disfunção renal (grupo DRC) foi realizada através de ablação de 5/6 da massa renal em quinze ratos com dez semanas de idade, anestesiados com cloridrato de ketamina e cloridrato de xilasina. As artérias renais mediana e posterior do rim esquerdo foram ligadas assegurando um infarto de, pelo menos, 2/3 desse rim. A nefrectomia total direita sucedia a ligação das artérias.^10,11 Quinze ratos de um grupo, denominado SHAM, foram submetidos à anestesia, laparotomia ventral e manipulação dos pedículos renais, sem a remoção da massa renal. Após o procedimento, os animais retornaram às suas gaiolas originais, tendo livre acesso à água e à ração padrão (0,5% de sódio e 22% de proteína), e mantida a 23 ± 1°C sob ciclo noite-dia controlados (12h por 12 h) por um período de oito semanas.

Amostras de sangue de ambos os grupos de animais foram coletadas no sétimo, trigésimo e sexagésimo dias, após o procedimento cirúrgico renal, para a determinação das concentrações séricas de ureia, fósforo, e dos níveis de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α). Os níveis de ureia eram determinados em todas as amostras com Kit Ureia por Reação Colorimétrica - Labtest^®. Os níveis de fósforo foram determinados em todas as amostras com Kit Fósforo por Reação Colorimétrica - Labtest^®. As dosagens de TNF-α foram determinadas em microplacas por Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), ou seja, empregando uma técnica imunoenzimática de sanduíche utilizando um anticorpo policlonal específico para a citocina TNF-α em ratos (Kit TNF-α/TNFSF1A - Quantikine, R&D Systyems). Todas as amostras foram coletadas com o anticoagulante etileno diaminotetracético tripotássico (EDTA K₃) e estocadas em vials (livres de endotoxinas) a -80°C até a realização das análises.

Ao final do período de seguimento, os animais foram submetidos à eutanásia. Realizou-se a assepsia na região torácica do animal usando polivinilpirrolidona-iodo (PVPI). A peça cardíaca retirada dos animais foi fixada em formol a 10% após terem sido realizados quatro cortes transversais, todos com o mesmo diâmetro, longitudinalmente. Os cortes foram emblocados em parafina e, em seguida, realizados cortes de quatro micras com micrótomo Lica RM 2145. As lâminas foram coradas em hematoxilina-eosina, tricômico de Gomori e elástica de Weigert. Para a análise da espessura da camada média dos vasos subepicárdicos, utilizou-se um aparelho de histomorfometria, composto por um microscópio Olympus BX 50, de onde as imagens capturadas eram transferidas para um microcomputador e analisadas pelo software Image Pro-plus 4.5 da Media Cybernetics^® (Figura 1).

Considerou-se para a análise os vasos subepicárdicos, escolhidos por serem, particularmente, suscetíveis a distúrbios metabólicos que aceleram o processo de DCV. Foram selecionados aqueles vasos que se encontravam até o equivalente a um campo de maior aumento de quarenta vezes. Após localizarmos os vasos subepicárdicos para estudo, a medição micrométrica da espessura da camada média seguia um mesmo protocolo de aferição, de acordo com a Figura 1.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram expressos como médias ± desvios-padrão. Comparações entre as médias dos dois grupos foram realizadas utilizando teste t de Student. Correlações entre variáveis contínuas foram avaliadas pelo teste de Pearson. Todas as análises foram feitas com programa estatístico SPSS para Windows (SAS Institute Inc., Berkley (CA), USA). Valores p < 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.

RESULTADOS

Três animais do grupo DRC morreram durante o seguimento e foram excluídos das análises finais do estudo. Durante os cortes histológicos, foram descartadas três peças cardíacas do grupo SHAM devido à inadequação do material obtido. Finalmente, vinte e quatro animais, sendo doze ratos do grupo DRC e doze ratos do grupo SHAM, terminaram o experimento e foram incluídos nas análises.

Quando comparamos a diferença de peso do grupo SHAM versus grupo DRC, não observamos diferença significativa ao longo do estudo (Tabela 1). As análises sanguíneas realizadas no decorrer do estudo revelaram um padrão ascendente dos níveis de ureia e de fósforo no grupo DRC, que foram estatisticamente superiores aos valores encontrados no grupo controle, SHAM, no sétimo, trigésimo e sexagésimo dias de observação, confirmando o sucesso na indução de disfunção renal. Observou-se, também, que, no grupo SHAM, os valores médios de fósforo e de ureia permaneceram estáveis ao longo do período de observação (Tabela 1).

Paralelamente, a insuficiência renal induziu o aparecimento de uma maior resposta inflamatória durante todo o período de observação, com elevação nos níveis de TNF-α no grupo DRC e, comparativamente, ausência da mesma resposta nos animais do grupo SHAM (Tabela 1). A análise histomorfométrica da espessura da camada média nas artérias subepicárdicas revelou que o grupo DRC apresentou um valor médio significativamente maior em relação ao grupo SHAM (18,98 ± 3,98 µm versus 13,90 ± 4,90 µm; p = 0, 011; Figuras 2A e 2B).

DISCUSSÃO

A disfunção renal é fator de risco para DCV, alterando a concentração plasmática e a expressão de biomarcadores de risco cardiovascular e induzindo alterações miocárdicas e vasculares, ainda pouco caracterizadas em modelos animais de uremia. Neste estudo, a indução da disfunção renal pelo modelo experimental de nefrectomia 5/6 induziu o desenvolvimento de uremia, a sustentação de um estado inflamatório e alterações vasculares compatíveis com espessamento arteriolar.

DRC em estágio final, muito frequentemente, determina o aparecimento de uremia, que é, atualmente, definida como o acúmulo sanguíneo de produtos orgânicos que, em condições normais, são excretados pelos rins,¹² especificamente, acúmulo de toxinas urêmicas como: ácidos orgânicos, ureia, beta2-microglobulina, produtos resultantes do estresse oxidativo e fósforo,^13-16 diretamente relacionados à morbi-mortalidade cardiovascular na DRC. Neste estudo, o modelo de uremia desenvolvido pela nefrectomia 5/6 se caracterizou pelo acúmulo de ureia e também de fósforo, duas das citadas representativas toxinas urêmicas. Dessa forma, acredita-se que este seja um modelo interessante para o estudo das repercussões cardiovasculares da uremia. Até o momento, a utilização desse modelo vem sendo quase que exclusivamente voltada para o estudo da progressão da doença renal.

Neste estudo, identificou-se a clara presença de um estado inflamatório sistêmico e sustentado em ratos nefrectomizados, mostrando que, nesse modelo, a inflamação ocorre em paralelo com o acúmulo de toxinas urêmicas, como a ureia e o fósforo. Pacientes com disfunção renal frequentemente apresentam uma inflamação sistêmica e sustentada, documentada por elevados níveis de PCR, interleucina 6 e TNF-α^4,5,17, que se correlaciona fortemente a complicações cardiovasculares.¹⁷ Particularmente, em um nível endotelial, observou-se que a exposição desse tecido com níveis aumentados de biomarcadores inflamatórios determina disfunção endotelial, espessamento e vasoespasmo,¹⁸ o que pode colaborar para fenômenos de isquemia em tecidos suscetíveis, como o tecido miocárdico. Além dessas alterações potencialmente observáveis na uremia, alterações funcionais e estruturais do sistema arterial na DRC determinam prejuízo na distensibilidade arterial, promovendo aumento na pós-carga, na resistência vascular periférica e hipertrofia ventricular esquerda, bem como, resultando em redução na perfusão coronariana pelo desenvolvimento de remodelamento vascular.^7,19,20

O principal achado do presente estudo foi a observação de que a indução de disfunção renal leva a um espessamento da camada médica de artérias subendocárdicas, mesmo após um período de acompanhamento de apenas oito semanas. Poucos trabalhos associam a presença da DRC à histopatologia de vasos sanguíneos. Em estudos com animais de experimentação, observou-se que em ratos urêmicos ocorre uma significativa redução do lúmen arterial e um aumento na relação parede-lúmen de artérias mesentéricas, quando comparados a controles normais²¹ e, adicionalmente, que o uso de drogas bloqueadoras de canais de cálcio e inibidoras da enzima conversora de angiotensina (ECA) preveniu o espessamento na parede das arteríolas intramiocárdicas.²² Essas modificações estruturais, bem com suas respostas à terapia medicamentosa, não puderam ser adequadamente explicadas pela presença de hipertensão arterial e fatores de risco tradicionais para DCV, sugerindo a presença de outros fatores de risco cardiovascular para justificá-las, como aqueles ligados à presença de DRC.

Os achados indicam que os vasos subepicárdicos são afetados na presença de uremia, podendo repercutir em alterações cardiovasculares específicas e apresentação clínica peculiar. Estudos clínicos prévios têm revelado que, em pacientes portadores de doença renal e angina pectoris, até 50% não apresentam doença coronariana significativa. Tais pacientes apresentam uma microangiopatia das pequenas artérias miocárdicas, como as observadas neste estudo, resultado de espessamento de parede arterial, que, em condições de estresse, não permitem relaxamento vascular e podem predispor a fenômenos de isquemia miocárdica. Histopatologicamente ocorre hipertrofia de células musculares lisas, aumento na expressão de fatores de crescimento derivados de endotélio e deposição de colágeno tipo IV.⁷ Essa arteriopatia parece aparecer nas fases mais avançadas da doença, quando, entre outras alterações, o sistema para manutenção de balanço do fósforo é rompido pela adicional perda de tecido renal e o processo inflamatório sistêmico se torna mais nitidamente presente. A identificação de fatores de risco cardiovascular na uremia se torna, dessa forma, importante, pois pode revelar mecanismos peculiares da patologia, levando ao entendimento da história natural da doença e ao desenvolvimento de condutas terapêuticas, que podem diminuir o risco de morbi-mortalidade. Da mesma forma, fatores de risco cardiovascular específicos da DRC indicam um formato de investigação próprio para esse grupo de pacientes, que desenvolvem uma arteriopatia de características peculiares.

Em conclusão, observou-se neste estudo que a presença de uremia e suas alterações imunológicas e metabólicas (inflamação sistêmica e hiperfosfatemia) estiveram relacionadas à presença de arteriopatia, especificamente um aumento na espessura da camada média das artérias subepicárdicas em animais de experimentação. Este modelo poderá ser utilizado para investigar os mecanismos da arteriopatia da uremia, bem como para testar intervenções com a finalidade de cardioproteção na disfunção renal.

Data de submissão: 22/05/2011

Data de aprovação: 28/09/2011

Suporte financeiro: Bolsa de Produtividade, CNPq

O referido estudo foi realizado no Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da PUC/PR.

Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Dez 2011
• Data do Fascículo
  Dez 2011

Histórico

• Recebido
  22 Maio 2011
• Aceito
  28 Set 2011