Fecundação in vitro com sêmen de bovinos da raça Gir

In vitro fertilization with bovine semen in Gyr breed

in vitro com sêmen de bovinos da raça Gir

[In vitro fertilization with bovine semen in Gyr breed]

A.A. Ramos¹, L.S.A. Camargo¹, W.F, Sá^1*, A.M.Ferreira¹, E.P. Costa²

¹Centro Nacional de Pesquisa em Gado de Leite – EMBRAPA

Rua Eugênio do Nascimento, 610 - Bairro Dom Bosco

36038-330 - Juiz de Fora, MG

²Departamento de Veterinária da UFV

Recebido para publicação, após modificações, em 4 de abril de 2000.

Apoio financeiro: FAPEMIG

*Autor para correspondência

E-mail: [e-mail]

RESUMO

Estudaram-se os efeitos da concentração espermática e do tempo de incubação do sêmen com ovócitos, durante a fecundação in vitro, sobre as taxas de penetração espermática, de fecundação monoespermática e de clivagem, utilizando-se sêmen de touros da raça Gir. Ovócitos (n=817) maturados in vitro foram distribuídos em tratamentos visando à fecundação in vitro (FIV), em um delineamento fatorial 2´2´2, com duas concentrações espermáticas (2 e 4´10⁶ espermatozóides/ml), dois períodos de incubação (12 e 18h) e dois touros (A e B). Espermatozóides viáveis foram obtidos pela técnica de swin-up. A FIV foi realizada em meio fert-talp com heparina, em incubadora com 5% de CO₂ em ar atmosférico e 95% de umidade, a 39ºC. Após inseminação, 359 ovócitos foram fixados e corados para determinação das taxa de penetração e poliespermia. O restante foi co-cultivado com células da tuba uterina e TCM-199 por 72h, avaliando-se a clivagem. As taxas de penetração, fecundação monoespermática e clivagem não foram influenciadas (P>0,05) pela concentração espermática e pelo período de incubação. O touro B produziu maiores taxas (P<0,05) de penetração e de clivagem (83,3 e 81,0%, respectivamente) do que o touro A (66,5 e 64,0%). Houve tendência do touro B apresentar maior taxa de polispermia (P=0,067) do que o touro A (16,4 e 6,2 %, respectivamente). As interações entre tratamentos não foram significativas (P>0,05). O efeito touro sobre a capacidade de fecundação dos espermatozóides deve ser considerado quando da fecundação in vitro.

Palavras-chaves: Cattle, Gir, fecundação in vitro

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the effects of differents sperm concentration and incubation time during in vitro fecundation on sperm penetration, monospermic fecundation and cleavage rates, using sperm of Gyr bulls. In vitro matured oocytes (n=817) were distributed into treatments to in vitro fertilization (IVF) in a factorial design, with two sperm concentration (2 and 4´10⁶ spermatozoa/ml), two incubation time (12 and 18h) and two bulls (A and B). Viable spermatozoa were obtained by swin-up. The IVF was realized in Fert-Talp medium with heparin, on incubator with 5% CO₂ and 95% humidity in air, at 39ºC. After insemination, 359 oocytes were fixed and stained to determine penetration and polyspermy rates. The remainder were co-cultivated in bovine oviduct epithelial cells and TCM-199, for 72h, to evaluate cleavage rate. The penetration, monospermic fecundation, and cleavage rates were not affected (P>0.05) by sperm concentration and incubation time. Higher (P<0.05) penetration and cleavage rates were observed for bull B (83.3 and 81.8%, respectively) than for bull A (66.3 and 64%, respectively). Bull B showed a tendency to present higher (P<0.07) polyspermy than bull A (16.4 and 6.25, respectively). No interactions among treatments were observed.

Keywords: Bovine, Gyr, in vitro fertilization

INTRODUÇÃO

A rápida multiplicação de material genético melhorado da raça Gir é de grande importância para o aumento da produção de leite nos países tropicais. A produção in vitro (PIV) de embriões vem ao encontro dessa meta, ao permitir aumentar a intensidade de seleção e encurtar o intervalo de gerações de maneira mais rápida que outros meios de seleção, como a transferência de embriões. Apesar de a técnica estar evoluindo com rapidez, a quase totalidade dos trabalhos publicados a respeito refere-se a animais de origem européia, com poucos relatos nas raças zebuínas.

Um sistema de fecundação in vitro (FIV) ótimo pode proporcionar alta taxa de penetração, com um mínimo de fecundações anormais (Long et al., 1994). Entre as fecundações anormais, a polispermia tem sido das mais freqüentes na FIV (Saeki et al., 1991; Chian et al., 1992). Outra alteração que pode ocorrer durante a FIV é a diminuição do potencial de desenvolvimento do ovócito, provocado por enzimas hidrolíticas liberadas pelos espermatozóides. Isso acontece quando os ovócitos são incubados com grande número de espermatozóides em um pequeno volume, como na FIV (Rehman et al., 1994). Portanto, é necessária uma concentração espermática ajustada ao período de incubação de maneira que não prejudique o desenvolvimento do ovócito e evite fecundações anormais. Sabendo-se da diferença que existe entre touros e entre raças européias quanto à fertilidade em sistemas de produção in vitro (Sumantri et al., 1996; Brackett & Keskintepe, 1996), torna-se desaconselhável extrapolar resultados obtidos de animais europeus para animais da raça Gir. Nas raças européias, a concentração espermática e o tempo de incubação têm variado entre 0,5 e 5´10⁶ espermatozóides/ml (Long et al., 1994; Parrish et al., 1995) e entre 16 e 24 horas (Hasler et al., 1995; Galli & Lazzari, 1996), respectivamente, porém não se encontram trabalhos semelhantes com touros Gir.

O objetivo deste trabalho foi testar a associação de diferentes concentrações espermáticas e tempos de incubação de sêmen de touros da raça Gir com ovócitos, verificando-se seus efeitos sobre a taxa de fecundação e clivagem in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizados ovócitos aspirados de ovários de fêmeas mestiças, coletados em matadouro e transportados para o laboratório em solução fisiológica (0,9% NaCl), acrescida de antibiótico (0,1 g/l de sulfato de estreptomicina), entre 31 e 34ºC, por um período de aproximadamente três horas.

Os folículos com diâmetro superior a 1,5mm foram puncionados com agulhas 25´7 adaptadas a seringas de 10ml, e o conteúdo aspirado, depositado em cálice cônico com 5ml de meio talp-hepes previamente aquecido a 37ºC. Após um período de decantação de cinco minutos, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento lavado com meio talp-hepes a 37ºC e depositado em placa de Petri mantida em placa aquecedora a 37ºC para classificação dos ovócitos. Foram considerados viáveis os ovócitos que apresentaram células do cumulus oophorus compacto com no mínimo três camadas de células e citoplasma homogêneo. Posteriormente, os ovócitos selecionados foram lavados por três vezes em meio talp-hepes a 37ºC.

A maturação in vitro foi realizada em placas de Petri com 3ml de TCM-199 acrescido de 10% de soro sangüíneo de vacas em cio e 20 mg/ml de FSH, conforme Costa (1994), em estufa incubadora à temperatura de 39ºC e 95% de umidade, com 5% de CO₂ em ar atmosférico, por 24 horas. Foram maturados in vitro 817 ovócitos, os quais foram levados para a fecundação in vitro.

O delineamento experimental foi o inteiramente ao acaso com quatro repetições. Os tratamentos consistiram de um fatorial 2´2´2 (touro, concentração espermática e período de incubação). As concentrações espermáticas foram 2,0 e 4,0´10⁶ espermatozóides/ml e os períodos de incubação 12 e 18h, utilizando-se dois touros (A e B). O sêmen foi descongelado em banho-maria a 37ºC por 30 segundos e colocado em 800ml de meio Sp-TL, em tubo com tampa, e levado à estufa de CO₂ a 39ºC por uma hora, onde ocorreu o swin-up. Após incubação, o sobrenadante foi aspirado e transferido para um tubo de 2ml para centrifugação. Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento ressuspendido com meio fert-talp acrescido de heparina (50 mg/ml). Antes do swin-up e após a centrifugação, foram realizadas contagens dos espermatozóides e avaliação da motilidade espermática.

A fecundação in vitro foi realizada em gotas de 100ml de meio fert-talp acrescido de heparina (50 mg/ml) cobertas com óleo mineral nas mesmas condições de maturação, por períodos de 12 e 18 horas.

Após o período de inseminação, cerca de 50% dos zigotos foram avaliados quanto à fecundação. O restante foi cultivado em TCM-199 com monocamada de células do oviduto, preparado segundo Costa (1994), em gotas de 100ml cobertas com óleo mineral, em incubadora com 5% de CO₂, 95% de ar atmosférico, 95% de umidade a 39ºC, durante 72 horas após a fecundação para avaliar a taxa de clivagem.

Considerou-se penetração quando os ovócitos fixados apresentavam no mínimo dois conjuntos cromossômicos e a cauda de um espermatozóide ou dois pronúcleos. Os ovócitos fixados que apresentavam somente dois conjuntos cromossômicos e a cauda de um espermatozóide ou dois pronúcleos foram classificados como tendo fecundação monoespermática, enquanto aqueles que possuíam mais de dois conjuntos cromossômicos e a cauda de um espermatozóide ou mais de dois pronúcleos foram considerados poliespermáticos (Xu & Greve, 1988; Costa, 1994; Long et al., 1994). A confecção das lâminas para avaliação da fecundação foi realizada segundo Costa (1994), nas quais os zigotos foram fixados em solução metanol:ácido acético (3:1) e corados com 2% de aceto-orceína.

A avaliação estatística baseou-se na análise de variância, utilizando o Statistical Analisys System (SAS, 1985) em modelo que incluiu os efeitos touro, concentração espermática, período de incubação e as interações entre esses fatores. As comparações entre médias foram feitas pelo teste de comparação múltipla de Newman Keuls.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Penetração espermática e clivagem somente foram afetadas (P<0,05) pelo efeito touro, enquanto polispermia apresentou apenas tendência (P=0,07) a ser diferente entre touros (Tab. 1). As taxas de penetração espermática, fecundação monoespermática, polispermia e clivagem segundo a concentração espermática e o período de incubação estão na Tab. 2. Tempo de incubação e concentração espermática não afetaram a taxa de penetração dos espermatozóides Há relatos de que o aumento do tempo de exposição promove aumento na penetração espermática. Segundo Xu & Greve (1988) e Tajik & Niwa (1998), o aumento ocorre proporcionalmente ao tempo entre 16 e 22 horas de exposição.

A taxa de fecundação monoespermática também não apresentou diferença significativa entre tratamentos (P>0,05; Tab. 1) enquanto que a taxa de polispermia mesmo não apresentando diferença entre tratamentos mostrou que há aumento à medida que a concentração espermática e o tempo de incubação aumentam (Tab. 2). Long et al. (1994) demonstraram que o aumento do tempo de incubação ou da concentração espermática, embora aumente a taxa de penetração, eleva a fecundação polispermática, com posterior aumento da taxa de clivagem. A taxa de clivagem também não diferiu entre tratamentos.

A elevação simultânea da concentração espermática e do tempo de incubação pode levar a um aumento da taxa de polispermia, com tendência a diminuir a taxa de fecundação monoespermática e aumentar a taxa de clivagem, o que é indesejável, uma vez que embriões clivados provenientes de fecundação polispermática podem não desenvolver a blastocisto, por serem oriundos de fecundação anormal. A presença de espermatozóides acessórios poderia produzir um efeito estimulante no desenvolvimento embrionário posterior (DeJanette et al., 1992; Nadir et al., 1993).

O aumento do tempo de incubação para 18h pode afetar a integridade dos ovócitos, pelo decréscimo na efetividade do exsudato dos grânulos corticais e/ou alteração da zona pelúcida, e de sua resposta ao exsudato dos grânulos corticais, o que levaria a uma diminuição na eficiência da reação cortical e, conseqüentemente, do bloqueio da polispermia (Long et al., 1994). Isso, associado à elevação no número de espermatozóides, levaria a um aumento na taxa de polispermia. Em altas concentrações espermáticas possivelmente existe alto teor de enzimas hidrolíticas no meio de fecundação, liberadas pela presença de espermatozóides a mais do que seria necessário, o que também pode provocar polispermia, uma vez que essas enzimas em excesso podem facilitar a penetração de mais de um espermatozóide.

Apesar de não haver diferença nas taxas de fecundação monoespermática, clivagem e polispermia entre os tratamentos, sugere-se um ponto de equilíbrio entre concentração espermática e período de incubação para que haja diminuição na freqüência de polispermia. Assim, para um período de incubação de 18h com sêmen de touros da raça Gir não é aconselhável utilizar altas concentrações espermáticas (4,0´10⁶ espermatozóides/ml). Para um período de incubação menor (12h), essa mesma concentração espermática não seria prejudicial, indicando que o maior período de incubação pode ser compensado pela menor concentração espermática.

Houve diferença entre touros com relação às taxas de penetração e clivagem (P<0,05), mas não houve diferença (P>0.05) na fecundação monoespermática (Tab. 1). Provavelmente, as maiores percentagens de penetração e clivagem apresentadas com o sêmen do touro B sejam decorrentes da tendência de esse touro apresentar maior percentagem de polispermia (P<0,07; Tab. 3). Diversos estudos evidenciam que espermatozóides de diferentes touros diferem nas taxas de fecundação (Rehmam et al., 1994; Saeki et al., 1995) e de clivagem (Kurtu et al., 1996; Watanabe et al., 1996), semelhante ao verificado neste trabalho. A variação de machos no potencial de fecundação e, conseqüentemente, nas taxas de clivagem e de polispermia, pode dever-se a diferenças nas características metabólicas das células espermáticas (Gibbons et al., 1994) e no número de receptores aos agentes capacitadores no espermatozóide e/ou no conteúdo do plasma seminal (Bellin et al., 1996). Essas diferenças levariam a respostas variadas na indução da capacitação espermática in vitro e, por conseguinte, na penetração em ovócitos.

CONCLUSÕES

O período de incubação e a concentração espermática estudados na raça Gir não têm efeito durante a fecundação in vitro em animais da raça Gir. Há necessidade de se avaliar a capacidade de fecundação dos espermatozóides antes da utilização do sêmen na FIV, em razão da diferença observada entre touros quanto a taxas de penetração e clivagem.

Referências bibliográficas

• BELLIN, N.E., HAWKINS, H.E., OYARZO, J.N. et al. Monoclonal antibody detection of heparin-binding proteins on sperm corresponds to increased fertility of bulls. J. Anim. Sci., v.74, p.173-182, 1996.
• BRACKETT, B.W., KESKINTEPE, L. Defined sperm treatments and insemination conditions are enable to improve bovine embryos production in vitro. Theriogenology, v.45, p.259, 1996.
• CHIAN, R.C., NAKAHARA, H., KIWA, K. et al. Fertilization and early cleavage in vitro of ageing bovine oocytes after maturation in culture. Theriogenology, v.37, p.665-672, 1992
• COSTA, E.P. Aspectos morfológicos (citológicos e ultra-estruturais) e desenvolvimento de ovócitos bovinos in vitro. Belo Horizonte: Escola de Veterinária da UFMG, 1994. 155p. Dissertaçăo (Tese, Doutorado).
• DeJANETTE, J.M., SAACKE, R.G., BAME, J. et al. Accessory sperm: their importance to fertility and embryo quality, and attempts to alter their numbers in artificially inseminated cattle. J. Anim. Sci., v.70, p.484-491, 1992.
• GALLI, C., LAZZARI, G. Practical aspects of IVM/IVF in cattle. Anim. Reprod. Sci., v.42, p.371-379, 1996.
• GIBBONS, J.R., BEAL, W.E., KRISHEER, R.L. et al. Effects on once-versus twice-weekly transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and embryo development. Theriogenology, v.42, p.405-419, 1994.
• HASLER, J.F., HENDERSON, W.B., HURTGEM, P.J. et al. Production, freezing and transfer of bovine IVF embryos and subsequent calving results. Theriogenology, v.43, p.141-152, 1995.
• KURTU, J.M., AMBROSE, J.D., RAJAMAHENDRAN, R. Clevage rate of bovine oocytes is affected by bulls but not sperm concentrations. Theriogenology, v.45, p.257, 1996.
• LONG, C.R., DMIANI, P., PINTO-CORREIA, R.A. et al. Morphology and subsequent development in culture of bovine oocytes matured in vitro under varius conditions of fertilization . J. Reprod. Fert., v.102, p.361-369, 1994.
• NADIR, S., SAACKE, R.G., BAME, J. et al. Effects of freezing semen and dosage of sperm number of accessory sperm, fertility and embryo quality in artificially inseminated cattle. J. Anim. Sci., v.71, p.199-204, 1993.
• REHMAN, N., COLLINS, A.R., SUH, T.K. et al. Effect of exposure time on in vitro fertilization and embryo development of oocytes matured in vitro. Theriogenology, v.41, p.1447-1452, 1994.
• PARRISH J.J., KROGENAES A., SUSKO-PARRISH J.L. Effect of bovine sperm separation by either swim-up or Percoll method on success of in vitro fertilization and early embryonic development. Theriogenology, v.44, p.859-869, 1995.
• SAEKI, K., KATO, H., HOSOI, Y. et al. Early morphological events of in vitro fertilized bovine oocytes with frozen-thawed spermatozoa. Theriogenology, v.35, p.1051-1058, 1991.
• SAEKI, K., NAGAO, Y., HOSHI, M. et al. Efects of heparin, sperm concentration and bull variation on in vitro fertilization of bovine oocytes in protein-free medium. Theriogenology, v.44, p.859-869, 1995.
• SAS. User’s guide: statistics 5.ed. Cary: SAS Inst., 1985. 956p.
• SUMANTRI, C., OOE, M., SAHA, S. et al. The influence of sperm incubation time and breed of bull on in vitro embryo development in cattle. Theriogenology, v.45, p.264, 1996.
• WATANABE, Y.F., AZAMBUJA, R.M., PERIPATO, A.C. et al. Efeito de touros na produçăo in vitro de embriőes com diferentes concentraçőes de heparina e de espermatozóides. Arq. Fac. Vet. UFRGS, v.24, p.250, 1996.
• TAJIK, P., NIWA, K. Effects of caffeine and/or heparin in chemically defined medium with or without glucose on in vitro penetration of bovine oocytes and their subsequent development. Theriogenology, v.49, p.771-777, 1998.
• XU, K., GREVE, T. A Detailed analysis of early events during in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. J. Reprod. Fert., v.82, p.127-134, 1988.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Set 2000
• Data do Fascículo
  Ago 2000

Histórico

• Recebido
  04 Abr 2000