Metabolismo oxidativo de neutrófilos em ovelhas naturalmente infectadas por nematódeos gastrintestinais e correlação entre nível sérico de cortisol e carga parasitária

Neutrophils oxidative metabolism in sheep naturally infected by gastrointestinal nematodes and correlation between serum level of cortisol and parasitary burden

Metabolismo oxidativo de neutrófilos em ovelhas naturalmente infectadas por nematódeos gastrintestinais e correlação entre nível sérico de cortisol e carga parasitária

[Neutrophils oxidative metabolism in sheep naturally infected by gastrointestinal nematodes and correlation between serum level of cortisol and parasitary burden]

P.C. Ciarlini¹, L.D.R.P. Ciarlini², N.X. Alencar², A. Hohayagawa³, C.F.C. Rodrigues⁴

¹Curso Medicina Veterinária – UNESP – Araçatuba

Rua Clóvis Pestana, 793

18050-680 – Araçatuba, SP

2Doutorando pela UNESP - Botucatu

3Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP-Botucatu

4PECO- Instituto de Zootecnia de Itapetininga

Recebido para publicação em 3 de maio de 2000.

Recebido para publicação, após modificações, em 22 de fevereiro de 2002.

E-mail: [e-mail]

Apoio financeiro: FAPESP

RESUMO

Estudaram-se as relações entre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos, os níveis séricos de cortisol e a carga parasitária estimada pela contagem de ovos por grama de fezes (OPG) no final da gestação, durante a lactação e após o desmame de ovelhas naturalmente infectadas por nematódeos gastrintestinais. Utilizaram-se 22 ovelhas da raça Suffolk, homogêneas quanto à idade (três a quatro anos), número de parições (terceira) e época de parição. O cortisol sérico foi determinado por radioimunoensaio e o metabolismo oxidativo dos neutrófilos pelo teste de redução do tetrazólio nitroazul (NBT). Os maiores valores de OPG foram observados na quinta semana de lactação, e as maiores taxas de cortisol e de redução do NBT ocorreram na quarta semana pós-desmame. Verificou-se correlação positiva (r = 0,52; P<0,05) entre a capacidade dos neutrófilos reduzirem o NBT e a concentração sérica de cortisol no período pré-parto. Próximo ao parto o metabolismo oxidativo dos neutrófilos diminuiu. Após o desmame a correlação entre o OPG e o teste de redução do NBT foi negativa (r = -0,39; P<0,01). A diminuição do OPG observada após o desmame coincidiu com o aumento da capacidade de os neutrófilos reduzirem o NBT, indicando que animais com melhor resposta imune pós-desmame possuem neutrófilos com metabolismo oxidativo maior e menor carga parasitária.

Palavras-chave: Ovelha, metabolismo oxidativo, neutrófilo, cortisol, nematódeos gastrintestinais

ABSTRACT

The relationships between neutrophils oxidative metabolism, cortisol serum levels and worm burden, estimated by fecal egg count (EPG), were studied in sheep naturally infected by gastrointestinal parasites at the end of pregnancy, during lactation, and after weaning. Twenty-two Suffolk sheep three to four year-old, of same parity and season of parturition were used. Serum cortisol was determined by radioimmunoassay and the neutrophils oxidative metabolism by the nitroblue tetrazolium (NBT) reduction test. The highest EPG values were observed on the fifth week of lactation while the highest rates of cortisol and reduction of NBT occurred on the fourth week after weaning. A positive correlation (r = 0.52; P<0.01) was observed between the neutrophils capacity to reduce the NBT and the serum cortisol concentration in the pre-parturition period. Otherwise, the neutrophils oxidative metabolism decreased near to the parturition. A negative correlation (r = -0.39; P<0.01) between EPG and NBT reduction test was observed after weaning, which was coincident with the increase in the neutrophils capacity to reduce NBT, indicating that animals showing better immune response after weaning have neutrophils with higher oxidative metabolism and lower worm burden.

Keywords: Ewe, oxidative metabolism, neutrophil, cortisol, gastrointestinal nematodes

INTRODUÇÃO

Próximo ao parto as ovelhas apresentam aumento da carga parasitária e elevada contagem de ovos de nematódeos por grama de fezes (OPG) que se mantêm durante a lactação e diminuem após o desmame. O aumento da carga parasitária em ovelhas foi descrito no Brasil por Amarante et al. (1992), o qual o denominou de "fenômeno do periparto" (FP). Os mecanismos pelos quais o FP ocorre ainda são desconhecidos, porém acredita-se que sejam provocadas por imunossupressão inespecífica de origem endócrina, decorrentes de variações hormonais que ocorrem próximas ao parto e durante a lactação (Soulsby, 1987). Há evidências de que as alterações hormonais no período do periparto inibem o metabolismo oxidativo dos neutrófilos, tornando as fêmeas bovinas mais susceptíveis à infecções neste período (Hodemaker et al., 1992;Gilbert et al., 1993; Cai et al., 1994). Talvez pelo fato de a maioria dos estudos sobre o efeito do cortisol na função dos neutrófilos terem sido realizados in vitro e/ou com concentrações suprafisiológicas, resultados contraditórios foram obtidos por diferentes autores, os quais verificaram correlação positiva entre os corticóides e o metabolismo oxidativo (Horan et al., 1982; Murata et al., 1987), ou correlação negativa (Chretien & Garagusi, 1972; Roth & Kaeberle; 1981). Se por um lado existem evidências de que o estresse do parto e da lactação podem inibir o metabolismo oxidativo dos neutrófilos, por outro há indícios de que os helmintos podem ativar o metabolismo oxidativo dos neutrófilos tanto "in vitro" (Leventhal & Soulsby, 1972; Mackenzie et al., 1981) como in vivo(Dennis et al., 1988; Jefferies et al., 1996).

Diante da escassez de informações sobre a função dos neutrófilos em ovelhas, especialmente durante o período de imunosupressão relacionado ao FP, este trabalho tem o objetivo de avaliar as correlações entre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos, o nível sérico de cortisol e a carga parasitária em ovelhas naturalmente infectadas por nematódeos gastrintestinais ao final da gestação, durante a lactação e após o desmame.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se 22 ovelhas da raça Suffolk pertencentes ao Posto Experimental de Caprinos e Ovinos (PECO) do Instituto de Zootecnia do Estado de São Paulo, homogêneas quanto à idade (três a quatro anos), número de gestação (terceira) e época de parição. As ovelhas foram mantidas juntas em sistema rotacional de pastagem (taxa de lotação de 10 cabeças/hectare). Um mês antes do parto todas as ovelhas foram tratadas com Closantel (Fatec A, São Paulo, SP, Brasil.) (10mg/kg peso vivo) e vacina tríplice (Polisinto – Vac, Solvay, Campinas, SP, Brasil) (carbúnculo/gangrena/enterotoxemia). A vacina contra aftosa (Pfizervac oleosa, Pzifer Ltda, Garulhos, SP, Brasil.) foi aplicada sete e três meses antes do parto.

Semanalmente e sempre no mesmo horário (8 e 10 horas), na primeira semana pré-parto (1PP), nas seis semanas de lactação (1LA, 2LA, 3LA, 4LA, 5LA e 6LA) e nas quatro semanas pós-desmame (1PD, 2PD, 3PD e 4PD) foram colhidas amostras de fezes para exames coproparasitológicos e de sangue para determinações hormonais e avaliação do metabolismo oxidativo dos neutrófilos.

A determinação da concentração sérica de cortisol foi feita pela técnica de radioimunoensaio (RIA) de fase sólida, utilizando-se conjunto de reagentes comerciais (Coat-a-Count Cortisol, Diagnostic Products Co., Los Angeles, CA, USA.). As contagens de radioatividades foram obtidas pela utilização de contador gama automático (Kinetic Count^Ò 48, Vitek Systems, Missouri, USA) calibrado para I¹²⁵ e tempo de contagem de um minuto. Os resultados foram obtidos pelo uso de programa específico do computador acoplado ao contador gama. Para avaliar o metabolismo oxidativo dos neutrófilos empregou-se o teste de redução espontânea do tetrazólio nitroazul (NBT) pelo método citoquímico descrito por Park & Good (1970), utilizando-se reativo comercial (NBT vial, catalog No. 840-10, Sigma Diagnostic, St.Louis, USA), tempo de incubação de 10 minutos à 37^oC e 10 minutos à temperatura ambiente. Das amostras de fezes colhidas diretamente da ampola retal determinou-se a contagem de ovos por grama de fezes (OPG) de cada indivíduo pela técnica modificada de Gordon & Whitlock (1939), e em cada momento do experimento realizou-se a coprocultura de um "pool" de fezes do grupo experimental utilizando a técnica descrita por Roberts & O’Sullivan (1950), identificando-se as larvas de acordo com Keith (1953).

Conforme preconizado por Zar (1984), as diferenças de cada variável nos diversos momentos experimentais foram avaliadas pelo teste de Friedman; as correlações entre as diferentes variáveis estudadas em cada momento (pré-parto, lactação e pós-desmame) foram estimadas pelo cálculo do coeficiente de Spearman.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da coprocultura revelaram que as ovelhas apresentaram infecção mista, sendo o gênero Haemonchus predominante, representando 89,4% das larvas infectantes. O gênero Trichostrongylus foi o segundo mais freqüente (8,24%), enquanto que os gêneros Oesophagostomum e Cooperia representaram 1,9 e 0,3%, respectivamente, das larvas identificadas.

A Tab. 1 registra os valores medianos, a amplitude e os contrastes entre momentos do pré-parto (PP), da lactação (LA) e do pós-desmame (PD) da contagem de ovos por grama de fezes, da concentração sérica de cortisol e da porcentagem de neutrófilos redutores de NBT. Os resultados das análises de correlações entre o percentual de neutrófilos redutores de NBT, os níveis séricos de cortisol e o OPG no pré-parto, lactação e pós-desmame são apresentados na Tab. 2.

O aumento de OPG a partir da primeira semana pré-parto (1PP) e sua diminuição após os desmame (Tab. 1) caracterizou a ocorrência do FP em todos os animais estudados. A manutenção da alta contagem de OPG durante a lactação e sua diminuição acentuada após o desmame fortalece a hipótese de Soulsby (1987) de que durante o FP o efeito imunosupressor da lactação promove o aumento da carga parasitária e que o desmame permite rápido restabelecimento da imunidade contra os nematódeos.

Após o desmame as taxas de cortisol aumentaram gradualmente, apresentando valores na quarta semana pós-desmame (4PD) significativamente superiores do que os da maioria dos outros momentos estudados. Esse aumento de cortisol após o desmame deve-se provavelmente ao restabelecimento da função adrenal após o término do prolongado efeito de estresse da lactação. Essa hipótese encontra sustentação nos estudos de Gwazdauskas et al. (1980) e Przekop et al. (1985) que observaram, em ovelhas, hipofunção ou decréscimo de atividade adrenal e diminuição de cortisol sangüíneo em condições de estresse prolongado.

Os valores medianos do percentual de neutrófilos sangüíneos redutores de NBT ficaram dentro dos limites de normalidade (14%) considerados por Poli & Mantelli (1974) e o aumento da carga parasitária ocorrido durante a lactação não implicou em aumento da taxa de neutrófilos redutores de NBT. Esta observação difere de estudos realizados em outras espécies que sugerem a possibilidade de infecções por nematódeos aumentarem a capacidade de os neutrófilos reduzirem o NBT "in vitro" (Leventhal & Soulsby, 1972; Mackenzie et al., 1981) e "in vivo" (Dennis et al., 1988; Jefferies et al., 1996).

A Tab.1 mostra que os valores de neutrófilos redutores de NBT da primeira, terceira e quarta semanas de lactação (1LA, 3LA e 4LA) foram significativamente inferiores aos de alguns momentos do período pós-desmame (2PD, 3PD e 4PD), indicando que o metabolismo oxidativo dos neutrófilos no início da lactação ficou diminuído, o que está de acordo com as observações realizadas em fêmeas bovinas (Gilbert et al., 1993; Cai et al., 1994; Detilleaux et al., 1995). Embora ainda desconhecido na espécie bovina, acredita-se que o mecanismo de inibição do metabolismo oxidativo dos neutrófilos no início da lactação esteja relacionada ao balanço negativo de proteína e energia neste período (Kehrli et al.,1989), fruto do aumento do cortisol (Hoedemaker et al.,1992), ou se dê por um complexo mecanismo que envolva as variações de hormônios como cortisol, progesterona e estradiol, além das variações na produção de anticorpos e no metabolismo do ácido araquidônico (Cai et al., 1994).

A correlação entre contagem de neutrófilos redutores de NBT e concentração sérica de cortisol foi positiva (r = 0,52) no período pré-parto. Os resultados confirmam as observações de Horan et al. (1982) e Murata et al. (1987) de que o cortisol aumenta a capacidade do neutrófilo reduzir o NBT, mas diferem dos resultados de Chretien & Gararusi (1972) e Roth & Kaerbele (1981) os quais verificaram ação inibidora dos glicocorticóides sobre o metabolismo oxidativo e de Matula & Paterson (1971) e Wollman et al. (1972) que não constataram ação sobre a capacidade de os neutrófilos reduzirem o NBT.

O aumento do percentual de neutrófilos redutores de NBT após o término do efeito imunossupressor da lactação coincidiu com a acentuada queda dos valores da contagem de OPG pós-desmame, que segundo Soulsby (1987) está relacionada ao pronto restabelecimento da resposta imune anti-helmíntica das ovelhas nesse período. No pós-desmame não se verificou correlação entre o percentual de neutrófilos NBT positivos e a concentração sérica de cortisol, mas observou-se correlação negativa (r = -0,39) entre porcentagem de neutrófilos NBT positivos e contagem de OPG, indicando que os neutrófilos de animais com maior carga parasitária na fase de imunossupressão da lactação possuem menor capacidade de reduzir o NBT, enquanto que animais com melhor resposta imune pós-desmame possuem menor carga parasitária e neutrófilos com maior capacidade de redução do NBT.

AGRADECIMENTOS

À técnica Maria Ângela B. Gomes do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biociências da UNESP-Botucatu, pelo auxílio na realização dos exames parasitológicos das fezes.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Dez 2002
• Data do Fascículo
  Jun 2002

Histórico

• Recebido
  22 Fev 2002