Ocorrência do subtipo B do vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do estado do Rio Grande do Sul, Brasil

Occurrence of subtype B of the feline immunodeficiency virus in domestic cats from the south region of Rio Grande do Sul state, Brazil

MEDICINA VETERINÁRIA

Ocorrência do subtipo B do vírus da imunodeficiência felina em gatos domésticos da região sul do estado do Rio Grande do Sul, Brasil

Occurrence of subtype B of the feline immunodeficiency virus in domestic cats from the south region of Rio Grande do Sul state, Brazil

F.S. Silva^I; C.C. Castro^I; P.F. Finger^I; D.S. Silva^I; S.A. Taniwaki^II; L.S. Ullmann^II; G. Fischer^I; G.D. Vargas^I; M. Lima^I; J.P. Araújo Jr^II; S.O. Hübner^I

^IFaculdade de Veterinária - Universidade Federal de Pelotas - Capão do Leão, RS

^IIInstituto de Biociências - Universidade Estadual Paulista - Botucatu, SP

RESUMO

No Brasil existem poucos estudos sobre a ocorrência da infecção pelo vírus da imunodeficiência felina (FIV), assim como a determinação dos subtipos circulantes, o que é indispensável para o desenvolvimento de vacinas e novos testes diagnósticos. O presente trabalho investigou a ocorrência da infecção pelo FIV entre os anos de 2010 e 2011 em gatos domésticos submetidos a atendimento clínico na cidade de Pelotas e região. Amostras de sangue total de 70 animais, incluindo suspeitos (28) ou não suspeitos (42) da infecção pelo FIV, foram submetidas à reação de PCR nested. Os resultados indicaram uma frequência de infecção de 15,7% (11/70) e a análise dos fatores associados (sexo, idade e condição clínica) evidenciou uma maior ocorrência em gatos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções crônicas e recidivantes. Oito amostras positivas na PCR nested foram submetidas a sequenciamento genômico e somente o subtipo B foi detectado na região estudada.

Palavras-chave: gato, vírus da imunodeficiência felina, PCR

ABSTRACT

In Brazil there are few studies on the occurrence of the feline immunodeficiency virus (FIV) infection and its subtypes, which are essential for the development of vaccines and new diagnostic tests. The present study investigated the occurrence of the FIV infection between 2010 and 2011 in domestic cats submitted to medical attendance in the city of Pelotas and nearby area. Total blood samples of seventy cats, suspected (28) or not (42) of infection by FIV were analyzed by nested PCR in order to perform a diagnosis. The results pointed to a FIV infection frequency of 15.7% (11/70) and the analysis of the risk factors related to infection (sex, age and clinical condition) evidenced a greater occurrence in cats up to 10 years of age with chronic and recurrent infections. Eight samples found positive by nested PCR were submitted to DNA sequencing indicating that only the subtype B was detected in the studied region.

Keywords: cat, feline immunodeficiency virus, PCR

INTRODUÇÃO

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um retrovírus do gênero Lentivirus, que apresenta estrutura molecular e patogenia similar ao HIV (Hosie et al., 2009). Os gatos infectados pelo FIV podem desenvolver disfunção imunológica caracterizada por hipergamaglobulinemia, elevação de linfócitos B CD21- e depleção de linfócitos T CD4+ (Takano et al., 2012). Os sinais clínicos observados são variáveis e inespecíficos. Em geral, os gatos podem manifestar gengivite, emaciação, linfoadenomegalia, insuficiência renal crônica, complicações neurológicas, diarreia crônica e infecções bacterianas (Zanutto et al., 2011), além de alterações hematológicas, como anemia, leucopenia e linfopenia (Arjona et al., 2000). Entretanto, em relação ao HIV, o vírus da imunodeficiência felina apresenta menor potencial de virulência, sendo que a maioria dos gatos infectados permanece assintomática por longos períodos, mesmo na ausência de tratamento antirretroviral (Hartmann, 2011; White e Norris, 2011).

O FIV é classificado em cinco subtipos bem caracterizados e filogeneticamente diferentes. Os subtipos A, B e C estão mundialmente distribuídos, o subtipo D é encontrado no Japão e Vietnã, e o subtipo E somente foi identificado na Argentina (Pecoraro et al., 1996; Teixeira et al., 2010b). Recentemente, foram descritos dois novos subtipos: o subtipo F, detectado nos Estados Unidos e Portugal, e o subtipo U-NZenv, encontrado na Nova Zelândia (Hayward e Rodrigo, 2010; Teixeira et al., 2010b). Além disso, recombinações entre os subtipos têm sido descritas (Bachmann et al., 1997). No Brasil, pouco se conhece sobre a diversidade genética do FIV. Até o momento, a caracterização molecular de isolados do FIV foi realizada somente nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro, onde apenas o subtipo B foi identificado (Caxito et al., 2006; Lara et al., 2007; Martins et al., 2008; Teixeira et al., 2010a).

O FIV é considerado um agente cosmopolita e apresenta prevalência variável de acordo com a área geográfica, com o comportamento e o estado de saúde dos gatos estudados. Nos Estados Unidos e Canadá, valores de prevalência de 1 a 7% foram encontrados, ao passo que no Japão a taxa de prevalência reportada foi de 44% (Hayward e Rodrigo, 2010). Um estudo realizado no estado de São Paulo, incluindo 454 felinos oriundos de 13 cidades, demonstrou que 14,7% (67/454) dos gatos estavam infectados (Lara et al., 2008). No Rio Grande do Sul, uma investigação epidemiológica referente à infecção pelo FIV, realizada na cidade de Porto Alegre, constatou uma taxa de infecção de 21,5% (14/65) (Silva, 2007).

Objetivou-se com o presente trabalho determinar a frequência de infecção pelo FIV na cidade de Pelotas, região sul do Rio Grande do Sul, mediante a detecção de DNA proviral pela técnica de PCR nested, além de realizar a caracterização molecular das amostras circulantes na região e analisar fatores associados à infecção.

MATERIAL E MÉTODOS

Durante o período de agosto de 2010 a agosto de 2011, foram colhidas 70 amostras de sangue de gatos submetidos a atendimento médico no Hospital de Clínicas Veterinária da Universidade Federal de Pelotas (UFPel) e Clínicas Veterinárias privadas, localizadas na cidade de Pelotas e região adjacente. Os animais testados foram classificados em dois grupos quanto à condição clínica: o grupo 1 foi representado por 28 gatos que apresentavam linfoadenomegalia, sinais neurológicos e/ou infecções crônicas ou recidivantes, sendo considerados suspeitos de imunodeficiência; no grupo 2 foram alocados 42 animais livres de sintomatologias descritas como relacionadas à infecção pelo FIV. Após o diagnóstico, todos os pacientes positivos receberam acompanhamento médico de no mínimo seis meses, com o objetivo de avaliar a evolução clínica e estabelecer a taxa de letalidade.

As amostras sanguíneas foram obtidas por punção venosa, acondicionadas em frascos contendo anticoagulante EDTA e armazenadas a 4ºC. A extração do DNA proviral foi obtida utilizando-se o kit QIAamp (QIAGEN^®), conforme especificações do fabricante, em até 30 dias após a colheita das amostras. Posteriormente, as amostras foram submetidas à reação de PCR nested, utilizando-se primers correspondentes à região p17 e p24 do gene gag, descritos por Hohdatsu et al. (1998). A primeira reação amplifica uma sequência de nucleotídeos de 658 pares de base (pb) e a segunda reação, uma sequência de 329 pb (Hohdatsu et al., 1998). Cada reação foi realizada num volume total de 25µl contendo: 1,25U de Taq DNA Polimerase (InvitrogenTM), 2,5µl de tampão de PCR 10X, 1,75mM de MgCl₂, 0,25mM de cada dNTP, 10 pmol de cada primer, l,5M de Betaine (Sigma-Aldrich^®) e 5µl do DNA extraído. Os ciclos padronizados para a amplificação do DNA foram: uma incubação inicial a 96ºC por 7 minutos, seguida de 45 ciclos, cada um consistindo em desnaturação a 94ºC por 60 segundos, anelamento a 45ºC por 60 segundos, extensão pela polimerase a 72ºC por 90 segundos e extensão final a 72ºC por 5 minutos. Ao final da reação, os produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (0,5 mg/ml), e comparados com marcadores de massa molecular de 100 pb (Ludwig Biotec). Incluíram-se em todas as reações amostras contendo água ultrapura como controle negativo e uma amostra de DNA, extraída de sangue total de um gato naturalmente infectado (gentilmente cedida pelo Laboratório de Virologia e Diagnóstico Molecular do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências da UNESP/Botucatu-SP), como controle positivo.

Com o intuito de identificar o subtipo de FIV presente nas amostras estudadas, realizou-se a amplificação da região V3-V4 do gene env, através de PCR nested com primers previamente descritos (Martins et al., 2008). A reação foi realizada num volume final de 25µl, contendo 12,5µl do GoTaq^® Green Master Mix 2x (Promega^®), 10 pmol de cada primer e 5µl do DNA extraído (reação de PCR) ou 1µl do produto de PCR (reação de nested). A amplificação foi realizada com uma etapa inicial de desnaturação a 94ºC por cinco minutos, seguida de 35 ciclos de 94ºC por um minuto, para desnaturação da fita de DNA, 51ºC por um minuto, para a hibridização dos primers, e 72ºC por um minuto e 30 segundos para a extensão das fitas, e uma fase de extensão final de 72ºC por cinco minutos. Os produtos da PCR nested foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com SYBR^® Safe DNA gel Stain (Invitrogen^TM) em comparação com o marcador de massa molecular GeneRuler^TM 100bp DNA Ladder (Fermentas^®). Os produtos de amplificação das amostras que apresentaram fragmento esperado de 554pb foram purificados com o kit Illustra GFX^TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare^®), e quantificados em gel de agarose 1,5% corado com SYBR^® Safe DNA gel Stain (Invitrogen^TM) em comparação com o Low DNA Mass Ladder (Invitrogen^TM). Em seguida, foram submetidos ao sequenciamento bidirecional direto utilizando o BigDye^® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) e o aparelho de sequenciamento automático ABI 3500 (Applied Biosystems), conforme orientação do fabricante. Apenas fragmentos com alta qualidade (Quality value >20) foram utilizados para a determinação da porcentagem de identidade de nucleotídeos no programa Bioedit Sequence Alignment Editor version 7.0.5.3 (Hall, 1999).

Variáveis, como condição clínica, faixa etária e sexo, foram analisadas como possíveis fatores de associação à infecção pelo FIV, mediante o tratamento estatístico do Qui-quadrado (x2), fixando-se o valor de 1% para o nível de rejeição da hipótese de nulidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das 70 amostras submetidas à PCR nested, 11 apresentaram resultado positivo, indicando uma frequência de infecção pelo FIV de 15,7% na população estudada. O valor encontrado é similar aos resultados descritos nos estados do Rio de Janeiro (16,7%) e São Paulo (14,7%) (Souza et al., 2002; Lara et al., 2008). Estudos de prevalência, realizados nos Estados Unidos e Canadá, detectaram 1% de infecção em gatos hígidos e 7% em animais doentes, dados esses muito inferiores aos do presente estudo. Contrastando com os valores da América do Norte, a prevalência encontrada no Japão, onde a população de gatos errantes é muito alta, foi de 44% (Hayward e Rodrigo, 2010), valor bem superior ao dos levantamentos epidemiológicos realizados no Brasil até o presente momento.

Em relação ao estado de higidez dos pacientes (Tab. 1), foi observado que a proporção de felinos positivos com sinais clínicos associados à FIV (10/28) foi estatisticamente superior (p<0,01) à proporção de felinos assintomáticos (1/42), estando de acordo com resultados encontrados em diversos levantamentos epidemiológicos (Caldas et al., 2000; Souza et al., 2002; Lara et al., 2008; Murray et al., 2008). Dos felinos positivos para FIV, 90,9% (10/11) já apresentavam sinais clínicos relacionados à infecção no momento do diagnóstico, caracterizados principalmente por infecções broncopulmonares (4/10) e cutâneas (3/10) secundárias. Outras alterações clínicas associadas à infecção por FIV, como gengivite, uveíte, anemia e icterícia, também foram detectadas nos animais positivos.

O conhecimento da variabilidade genética do FIV é fundamental no desenvolvimento de vacinas que induzem imunidade protetora a subtipos específicos de uma determinada área. Além disso, também possibilita a associação de subtipos do FIV com determinados padrões clínicos específicos (Teixeira et al., 2010b). No Brasil, até o momento, foi descrita apenas a ocorrência do subtipo B (Caxito et al., 2006; Lara et al., 2007; Martins et al., 2008; Teixeira et al., 2010a). O presente estudo foi realizado em região relativamente próxima à Argentina, onde foi identificado o subtipo E (Pecoraro et al., 1996). Contudo, das 11 amostras com resultado positivo na PCR nested específica para o gene gag, oito foram submetidas ao sequenciamento e identificadas como subtipo B, uma vez que demonstraram identidade de nucleotídeos de 92,8 a 98,1% numa sequência de 323pb em comparação com sequência identificada em Minas Gerais (número de acesso GenBank DQ641682; Caxito et al., 2006). Os resultados deste estudo indicam que o subtipo B é predominante na região analisada, sugerindo que possivelmente ainda não tenha sido introduzida outra variante do vírus na região.

Dos felinos com sinais clínicos de FIV, 30% (3/10) vieram a óbito durante o período de seis meses de observação após o diagnóstico. Possivelmente, a baixa taxa de letalidade verificada no estudo está relacionada ao subtipo B, que apresenta como característica a baixa virulência (Bachmann et al., 1997), ao contrário do subtipo C, que está associado à enfermidade aguda e de acentuada imunodeficiência, chegando a 60% de mortalidade 18 semanas pós infecção (De Rozìeres e Thompson, 2008).

A categoria sênior (Tab. 1) apresentou de maneira significativa (p<0,01) a maior proporção de felinos diagnosticados com FIV (6/9). Esse resultado era esperado devido ao fato de a infecção pelo FIV apresentar fase assintomática de período prolongado, determinando o aparecimento tardio dos sinais clínicos, mesmo que a infecção tenha ocorrido em idade jovem (Hartmann, 2011; White e Norris, 2011). Contudo, diferentemente de outros estudos que apontam os machos inteiros como os mais suscetíveis à infecção pelo FIV (Lara et al., 2008; Murray et al., 2008; Samman et al., 2011), não foi observada diferença estatística entre sexos. Sabe-se que gatos machos não castrados e com acesso à rua geralmente exibem um repertório comportamental distinto, com uma tendência a entrar constantemente em conflitos por acasalamento, facilitando a transmissão do FIV por meio de mordeduras, sendo que gatos domiciliados que apresentam contato com outros da mesma espécie estabelecem conflitos principalmente por local de repouso, uso da caixa de dejeto e obtenção de alimento (Crowell-Davis et al., 2004). Considerando que a maioria dos animais do estudo eram domiciliados, o contágio de gatos machos a partir de conflitos por acasalamento foi provavelmente infrequente. E, alternativamente, o fato de gatos machos inteiros não apresentarem maior proporção de infecção pode também estar atribuído a um número insuficiente de amostras analisadas.

CONCLUSÃO

Os resultados apontam uma frequência de infecção pelo FIV de 15,7% e permitem afirmar que o subtipo B do FIV circula na população de felinos domésticos da região sul do Rio Grande do Sul. Os dados mostram ainda que gatos com idade superior a 10 anos e acometidos por infecções crônicas ou recidivantes apresentam a maior proporção de animais positivos para o FIV.

Recebido em 21 de fevereiro de 2013

Aceito em 30 de setembro de 2013

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Mar 2014
• Data do Fascículo
  Fev 2014

Histórico

• Aceito
  30 Set 2013
• Recebido
  21 Fev 2013