Sexagem em tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) por meio do teste da reação em cadeia da polimerase

Polymerase chain reaction for sexing in giant anteater's (Myrmecophaga tridactyla)

RESUMO

Em tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) não há dimorfismo sexual, tornando-se necessária a diferenciação entre machos e fêmeas, em especial naqueles indivíduos com finalidade reprodutiva. Entre as diversas técnicas empregadas para a caracterização sexual, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é utilizada em mamíferos para identificar uma sequência genética especifica do cromossomo Y (SRY), sendo considerado um meio moderno e eficaz de determinação sexual. O objetivo deste trabalho é padronizar um protocolo para determinação sexual de tamanduá-bandeira por meio da técnica de PCR, utilizando material genético extraído do bulbo capilar desses animais. Mediante esse protocolo, foi possível determinar o sexo de sete animais testados, sendo compatível com o sexo de cada indivíduo. Conclui-se que o protocolo padronizado apresentou total eficácia, sendo possível determinar o sexo de tamanduás-bandeira utilizando material genético extraído do bulbo capilar.

Palavras-chave: pilosa; reprodução; conservação; determinação sexual; DNA

ABSTRACT

There is no sexual dimorphism in the giant anteater (Myrmecophaga tridactyla), so the distinction between males and females become necessary, especially in animals with reproductive purpose. The Polymerase Chain Reaction (PCR), among the various techniques used for characterization, is considered a modern and effective means of sex determination and used in mammals to identify the Y chromosome (SRY) specifies genetic sequence. The objective of this work is to standardize a protocol for sex determination of giant anteater by PCR technique, using genetic material extracted from the capillary bulb of these animals. With this protocol was possible the sex determination of seven tested animals, being compatible with the sex of each individual. In conclusion, this protocol showed total effectiveness, being possible to determine the giant anteater sex using genetic material extracted from the capillary bulb.

Keywords:  pilosa; reproduction; conservation; sexing determination; DNA

INTRODUÇÃO

Em mamíferos, a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction ou reação em cadeia da polimerase), usada para identificar uma sequência genética específica do cromossomo Y (SRY), é tida como um método eficaz na determinação sexual de diversas espécies (Luz et al., 2000; Takami et al., 1998). Sangue, pele, pelos (devendo este ser preferencialmente coletado com a raiz), entre outros tecidos e estruturas, fornecem material genético para a determinação sexual de animais (Wischral e Gomes Filho, 2009).

O tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) é um mamífero de grande porte, encontrado desde a Guatemala, na América Central, até o sul da América do Sul, sendo encontrado em todo o território brasileiro (Silveira et al., 1999; Miranda, 2004). Diversas causas, como a redução do seu habitat natural, queimadas, caça e morte por atropelamentos, ameaçam essa espécie (Medri e Mourão, 2008).

Em tamanduás-bandeira machos, os testículos estão localizados na cavidade pélvica e o pênis é pequeno, com pouca quantidade de tecido erétil e ausência de glande. Em tamanduás-bandeira fêmeas, a abertura vaginal central apresenta um diâmetro de 1,5 centímetro, útero simples e prega mucosa que separa o vestíbulo vulvar da vagina (Schauerte e Osmann, 2012; Rossi et al., 2013).

Nessa espécie, não há dimorfismo sexual, tornando necessário que se faça a diferenciação entre machos e fêmeas, especialmente naqueles indivíduos com finalidade reprodutiva mantidos em cativeiro ou até mesmo para controle em populações de vida livre, como forma de prevenção de efeitos deletérios já conhecidos que ameacem a conservação da espécie (Collevatti et al., 2007; Luna et al., 2014).

Em tamanduás-bandeira, o ciclo estral dura, em média, 51 dias, com gestação entre 183 e 190 dias, sendo concebido um único filhote (Patzl et al., 1998; Luna et al., 2014). Em indivíduos mantidos cativos, não há um consenso acerca da estacionalidade reprodutiva, sendo relatada essa condição em espécimes na Alemanha (Patzl et al., 1998) e na Colômbia (Romero et al., 2010). Outros aspectos da biologia dessa espécie devem ser considerados na formação de grupos mantidos em cativeiro, visto que o tamanduá-bandeira é um animal territorialista e solitário na maior parte do tempo, com exceção do encontro entre machos e fêmeas nos períodos de acasalamento, o que torna propenso o caso de brigas, principalmente entre machos (Miranda, 2014; Coelho, 2001).

A determinação sexual em tamanduás-bandeira pode ser realizada por meio da coleta de sangue para análise cromossômica ou da palpação da genitália externa, mas essas técnicas são pouco indicadas devido a riscos para o animal, como a necessidade de ser realizada contenção química, até a dificuldade de uma contenção física. A coleta de pelo juntamente com o bulbo por retirada mecânica é um método simples e, mediante este, é possível extrair material genético e, por meio da técnica molecular de PCR, amplificar uma sequência do gene SRY específico para macho (Luna et al., 2014).

Dessa forma, o objetivo deste trabalho é padronizar um protocolo para determinação sexual de tamanduá-bandeira pela técnica de PCR, utilizando material genético extraído do bulbo capilar desses animais.

MATERIAL E MÉTODOS

Os pelos utilizados neste experimento foram coletados juntamente com o bulbo em seis animais mantidos em cativeiro no Zoológico da Universidade Federal de Mato Grosso (Zoo-UFMT) e de um animal recebido para atendimento no Hospital Veterinário da Universidade Federal de Mato Grosso (Hovet-UFMT). O presente experimento teve autorização para atividades com finalidade didática no âmbito do ensino superior emitida pelo Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade - ICMBio, documento nº 23774-1.

Os animais mantidos em cativeiro no Zoológico da UFMT foram nomeados de T1, T2, T3, T4, T5 e T6, sendo o sexo conhecido (três machos e três fêmeas) por participarem de projetos de avaliação reprodutiva realizados anteriormente (Tsuneda et al., 2015; Lopes et al., 2015). O animal atendido no Hovet-UFMT tinha o sexo conhecido (macho) mediante avaliação externa da genitália e foi nomeado de T7. Os pelos foram coletados por meio do arranque manual (Fig. 1) utilizando-se luvas, trocadas a cada procedimento para evitar a contaminação do material, acondicionados em tubos Falcon estéril, congelados a -4ºC e enviados ao Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Federal de Mato Grosso.

Figura 1
Coleta de pelos de tamanduá-bandeira (Myrmecophaga tridactyla) juntamente com o bulbo por meio de arranque manual para realização de extração de material genético. No detalhe, é possível observar os pelos acondicionados em tubo Falcon estéril.

Para realização da extração de DNA, as hastes de 10 pelos de cada animal foram cortadas e, a partir do bulbo, foi feita a extração de DNA das amostras com base na técnica de fenol-clorofórmio descrita por Sambrook e Russell (2001).

O primer utilizado neste estudo foi obtido de acordo com a sequência da região pY53.3 do DNA humano (Sinclair et al., 1990) com os nucleotídeos da posição 591-621 (5'-AAGCGACCCATGAATGCATTCATGGTGTGGT-3') e 768-804 (5'-GAGGTCGATACTTATAGTTCGGGTATTTCTCTCTGTG-3') (Kageyama et al., 1992). Para a amplificação, foi utilizada uma reação com volume final de 25µL, contendo 4µL do DNA testado, 0,7µL de primer (20pmol), 5µL de DNTPs (1mM), 2,5µL de tampão PCR 10x (200mM Tris-HCl pH 8,4, 500mMKCl), 0,5µL de Taq DNA polimerase, 1µL de MgCl₂ e 11,3µL de água ultrapura. No controle negativo, os 4µL de DNA foram substituídos por 4µL de água ultrapura, a fim de completar o volume final da reação; este master mix foi todo preparado em capela estéril. Como controle positivo, foram utilizados 4µL de DNA do animal T4, por ser um macho com histórico de reprodução quando mantido com uma fêmea em cativeiro na instituição zoológica.

A reação foi realizada em termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por cinco minutos; 40 ciclos de 30 segundos a 95ºC, anelamento dos oligonucleotídeos a 56ºC por 30 segundos, extensão por 30 segundos a 72ºC; e uma extensão final de 10 minutos a 72ºC. O produto de amplificação, corado com GelRedTm (NucleicAcid gel stain, Biotium), foi fracionado por eletroforese em gel de agarose (2,0%) e analisado em sistema de fotodocumentação ChemiDocTm XRS+(Bio-Rad).

RESULTADOS

Por meio do protocolo utilizado neste experimento, foi possível determinar o sexo dos animais testados, e os resultados confirmaram o sexo já conhecido de cada indivíduo. Nos animais T1, T2, T4 e T7, visualizou-se amplificação de um fragmento de 212pb, confirmando que esses indivíduos são machos. Nos demais animais, T3, T5 e T6, não se observou amplificação, confirmando que esses indivíduos são fêmeas (Fig. 2).

Figura 2
Gel de agarose 2% com amplificação de 212pb em DNA de tamanduás-bandeira submetidos à sexagem por meio de técnica de PCR. (M: marcador Ladder 100pb; CN: controle negativo; CP: controle positivo; T1: tamanduá 1; T2: tamanduá 2; T3: tamanduá 3; T4: tamanduá 4; T5: tamanduá 5; T6: tamanduá 6; T7: tamanduá 7).

DISCUSSÃO

Conforme observado, o protocolo utilizado mostrou-se eficaz na determinação sexual dos indivíduos testados, sendo sensível, de rápida identificação e confiável. A amplificação de um produto de 212pb ocorreu apenas nos indivíduos conhecidamente machos, como o animal T4, ao contrário das fêmeas em que não houve amplificação, como o animal T3, mantido na instituição zoológica e com histórico de crias. Assim como nos resultados obtidos neste experimento, em estudo realizado por Takami et al. (1998) para a determinação sexual de tamanduás-bandeira, houve a amplificação de um produto de 212pb apenas em animais machos, pois utiliza-se um primer formado por uma sequência de oligonucleotídeos presente no gene SRY, enquanto nas fêmeas não se observa a amplificação por elas não conterem esse gene. O gene SRY é específico do cromossomo Y, localizando-se em uma pequena região do braço curto distal deste, e possui um papel importante no determinismo dos testículos, o que justifica a amplificação de um produto na PCR apenas nos indivíduos machos (Damiani et al., 2000).

Ainda que a coleta de sangue para análise cromossômica e a análise da genitália externa por meio de palpação sejam métodos eficientes para determinação sexual de tamanduás-bandeira, a realização desses procedimentos requer contenção física e/ou química, gerando estresse ao animal. Em muitos casos, a contenção química desses animais é realizada com base em um peso estimado, possibilitando uma sub ou sobredosagem do fármaco, podendo levar, por exemplo, à overdose anestésica e à morte (Brainard et al., 2008). As particularidades anatômicas dessa espécie, como o focinho longo e a boca pequena, impossibilitam procedimentos de emergência comuns a outras espécies; em quadros de apneia durante anestesia em tamanduás-bandeira, o tamanho limitado da cavidade oral dificulta a realização de entubação orotraqueal, sendo necessário que se realize traqueostomia (Brainard et al., 2008; Carregaro et al., 2009), o que representa um risco maior ao animal.

A simples coleta de pelos, devendo esses conter o bulbo, possibilita que se extraia o DNA desses animais para determinação sexual por meio da PCR. Estudos realizados com humanos indicam que a concentração de DNA é maior no bulbo capilar, sendo este o ideal a ser utilizado na extração de material genético, visto que, ainda que o processo de queratinização dos fios não degrade o DNA, a concentração de material genético na haste é bem menor (Heywood et al., 2003). Parte dos pelos utilizados neste estudo permaneceram congelados a -4ºC por um período de cinco anos, mostrando que esse material pode ser mantido por um tempo considerável nessas condições e, por meio dele, pode-se obter material genético que possibilite a realização da sexagem pela técnica de PCR.

Para a realização de sexagem em animais, a escolha da técnica de extração do DNA, bem como o tempo de conservação desse material em laboratório, é de grande valia, visto que este pode ser usado no controle para a determinação sexual de outras espécies e para a realização de contraprovas, quando preciso (Vieira et al., 2010). No presente estudo, a técnica de fenol-clorofórmio mostrou-se efetiva na extração do DNA no bulbo capilar, sendo possível utilizar esse material na determinação sexual dos tamanduás-bandeira, além de possibilitar o armazenamento deste em um banco de dados do laboratório. Em estudos feitos comparando diferentes protocolos de extração de DNA em pena e sangue para a determinação sexual de aves, a técnica de fenol-clorofórmio mostrou-se eficiente, podendo esse material genético extraído ser armazenado por até oito meses a 4ºC e por até nove meses a -20ºC (Coelho, 2001; Sambrook et al., 1989; Vieira et al., 2010).

O uso de tecnologias reprodutivas aplicadas a animais silvestres, como coleta e criopreservação de sêmen, inseminação artificial e clonagem, por exemplo, associadas a estudos endócrinos e de variabilidade genética, é cada vez mais crescente (Luna et al., 2014). Em tamanduás-bandeira, estudos acerca do comportamento e da ecologia, bem como o desenvolvimento de técnicas de diagnóstico gestacional e do clico estral pouco invasivas, são importantes a fim de se otimizarem as técnicas de reprodução e a taxa de natalidade em indivíduos in situ e ex situ (Rezende et al., 2013). Dessa forma, a extração de material genético aqui realizada, além de pouco invasiva, contribui para a eficiência de técnicas reprodutivas e consequente conservação dessa espécie, seja utilizando esse material genético para a realização de sexagem ou para outras técnicas de biologia molecular voltadas à reprodução e conservação.

A reação utilizada bem como o protocolo usado no termociclador foram feitos com base em trabalho de Takami et al. (1998), com adequações. Esses autores utilizaram uma reação com volume total de 50µL, composta por 2µL de DNA, 2µL de upstream primer, 2µL de downstream primer, 5µL de DNTP, 5µL de tampão PCR 10x, 1µL de Taq DNA polimerase e 33µL de água destilada. O protocolo utilizado no termociclador foi composto por 32 ciclos: desnaturação inicial a 93ºC por um minuto; anelamento dos oligonucleotídeos a 55ºC por dois minutos; extensão por três minutos a 72ºC; e uma extensão final de sete minutos a 72ºC. O produto de amplificação foi fracionado por eletroforese em gel de agarose (2,5%) e analisado em sistema de fotodocumentação não informado pelos autores. Segundo eles, dos 10 animais com sexo desconhecido testados nesse experimento, foi possível confirmar o sexo por meio desse protocolo em apenas dois indivíduos, que vieram a óbito e foram submetidos à necropsia, não sendo possível confirmar se o resultado da PCR era semelhante ao sexo real nos demais animais.

As adequações feitas nesse protocolo mostraram-se efetivas, possibilitando determinar, com base nele, o sexo de todos os animais testados e sendo o resultado compatível com o sexo previamente conhecido de cada indivíduo.

CONCLUSÃO

Conclui-se que o protocolo utilizado no presente estudo mostrou-se efetivo, sendo possível determinar o sexo de tamanduás-bandeira. Dessa forma, esse protocolo mostra-se como uma eficiente ferramenta na conservação dessa espécie, como meio de determinação sexual de indivíduos com finalidade reprodutiva, possibilitando a formação de casais em populações cativas e o estudo da correlação macho-fêmea em vida livre. Além disso, nos animais mantidos em cativeiro que não possuem finalidade reprodutiva, a determinação sexual pode auxiliar na formação de grupos, com o objetivo de evitar conflitos, principalmente no caso de machos que tendem a brigar devido ao aspecto territorialista e solitário dessa espécie.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à equipe do Laboratório de Microbiologia e Biologia Molecular da UFMT, pela concessão do espaço para realização dessa pesquisa, bem como à equipe do Zoológico da UFMT e do Setor de Medicina de Animais Silvestres do Hovet-UFMT, pelo fornecimento do material para realização deste estudo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Jun 2019
• Data do Fascículo
  Mar-Apr 2019

Histórico

• Recebido
  12 Abr 2017
• Aceito
  31 Ago 2018