Atividade antimicrobiana "in vitro" e determinação da concentração inibitória mínina (CIM) de fitoconstituintes e produtos sintéticos sobre bactérias e fungos leveduriformes

In vitro antimicrobial activity and determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of natural and synthetic compounds against bacteria and leveduriform fungi

Resumos

Diante da problemática da resistência microbiana as pesquisas apontam para o uso de novos antibióticos que sejam eficazes ante os patógenos emergentes. Este trabalho objetiva testar frente a bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus), bactérias gram-negativas (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) e fungos leveduriformes (Candida albicans), a atividade antimicrobiana e a concentração inibitória mínima (CIM) de fitoconstituintes de Ocotea duckei Vattimo, do lapachol, seus derivados semi-sintéticos, alfa-lapachona, beta-nor-lapachona, beta-lapachona, alfa-nor-lapachona, beta-3-iodo-lapachona e alfa-3-iodo-lapachona, assim como 07 derivados nitrogenados obtidos a partir do lapachol por semi-síntese e de imidas cíclicas similares ao alcalóide filantimida. Os resultados obtidos estimulam o aprofundamento dos estudos para algumas dessas substâncias a exemplo do lapachol e seus análogos que demonstraram atividade antimicrobiana, de modo que os produtos que se apresentaram ativos para S. aureus, foram lapachol e o extrato etanólico de Ocotea duckei, para E. coli foi a iangambina e para a Candida albicans foram as imidas. As demais substâncias não apresentaram atividade antimicrobiana para as cepas testadas.

Atividade antimicrobiana; fitoconstituintes; produtos de síntese; iangambina; lapachol; bactérias; leveduras

Regarding the problem of microbial resistance, the researches point to the use of new antibiotic which can be active against the emergent pathogens. This work aims to test the activity against Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus), Gram-negative bacteria (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) and leveduriform fungi (Candida albicans), and also the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the constituent of Ocotea duckei Vattimo, lapachol and its synthetic derivatives alpha-lapachone, beta-nor-lapachone, beta-lapachone, alpha-nor-lapachone, beta-3-iodin-lapachone and alpha-3-iodin-lapachone, as well as seven nitrogenated derivatives of lapachol obtained through semi synthesis. The achieved results stimulate the deepening of the studies for some of theses substances such as lapachol and its analogous which demonstrated antimicrobial activity. The substances which were active against S. aureus, were lapachol and the ethanolic extract of Ocotea duckei Vattimo, against Escherichia coli iangambin and against C. albicans the imides. The other substances did not show any activity against the tested bacteria.

Antimicrobial activity; phytoconstituents; synthetic substances; yangambin; lapachol; bacteria; yeast

ARTIGO

Atividade antimicrobiana "in vitro" e determinação da concentração inibitória mínina (CIM) de fitoconstituintes e produtos sintéticos sobre bactérias e fungos leveduriformes

In vitro antimicrobial activity and determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of natural and synthetic compounds against bacteria and leveduriform fungi

Rossana M. Pessoa Antunes^I; Edeltrudes O. Lima^II,*; Maria S.V. Pereira^III; Celso A. Camara^IV; Thúlio A. Arruda^I; Raissa M. Ramalho Catão^I; Ticiano P. Barbosa^V; Xirley P. Nunes^V; Celidarque S. Dias^V; Tânia M. Sarmento Silva^VI

^IDepartamento de Farmácia, Universidade Estadual da Paraíba, Campus Universitário, 58100-000, Campina Grande, Paraíba, Brasil

^IIDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal da Paraíba, Campus Universitário, 58051-970, João Pessoa, Paraíba, Brasil

^IIILaboratório de Genética, Universidade Federal da Paraíba, Campus Universitário, 58051-970, João Pessoa, Paraíba, Brasil

^IVDepartamento de Química, Universidade Rural de Pernambuco, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, Pernambuco, Brasil

^VLaboratório de Tecnologia Farmacêutica, Universidade Federal da Paraíba, Campus Universitário, 58051-970, João Pessoa, Paraíba, Brasil

^VIInstituto Multidisciplinar de Saúde, Campus Avançado Anísio Teixeira, Universidade Federal da Bahia, 45055-090, Vitória da Conquista, Bahia, Brasil

RESUMO

Diante da problemática da resistência microbiana as pesquisas apontam para o uso de novos antibióticos que sejam eficazes ante os patógenos emergentes. Este trabalho objetiva testar frente a bactérias gram-positivas (Staphylococcus aureus), bactérias gram-negativas (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) e fungos leveduriformes (Candida albicans), a atividade antimicrobiana e a concentração inibitória mínima (CIM) de fitoconstituintes de Ocotea duckei Vattimo, do lapachol, seus derivados semi-sintéticos, a-lapachona, b-nor-lapachona, b-lapachona, a-nor-lapachona, b-3-iodo-lapachona e a-3-iodo–lapachona, assim como 07 derivados nitrogenados obtidos a partir do lapachol por semi-síntese e de imidas cíclicas similares ao alcalóide filantimida. Os resultados obtidos estimulam o aprofundamento dos estudos para algumas dessas substâncias a exemplo do lapachol e seus análogos que demonstraram atividade antimicrobiana, de modo que os produtos que se apresentaram ativos para S. aureus, foram lapachol e o extrato etanólico de Ocotea duckei, para E. coli foi a iangambina e para a Candida albicans foram as imidas. As demais substâncias não apresentaram atividade antimicrobiana para as cepas testadas.

Unitermos: Atividade antimicrobiana, fitoconstituintes, produtos de síntese, iangambina, lapachol, bactérias, leveduras.

ABSTRACT

Regarding the problem of microbial resistance, the researches point to the use of new antibiotic which can be active against the emergent pathogens. This work aims to test the activity against Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus), Gram-negative bacteria (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) and leveduriform fungi (Candida albicans), and also the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of the constituent of Ocotea duckei Vattimo, lapachol and its synthetic derivatives a-lapachone, b-nor-lapachone, b-lapachone, a-nor-lapachone, b-3-iodin-lapachone and a-3-iodin–lapachone, as well as seven nitrogenated derivatives of lapachol obtained through semi synthesis. The achieved results stimulate the deepening of the studies for some of theses substances such as lapachol and its analogous which demonstrated antimicrobial activity. The substances which were active against S. aureus, were lapachol and the ethanolic extract of Ocotea duckei Vattimo, against Escherichia coli iangambin and against C. albicans the imides. The other substances did not show any activity against the tested bacteria.

Keywords: Antimicrobial activity, phytoconstituents, synthetic substances, yangambin, lapachol, bacteria, yeast.

INTRODUÇÃO

O uso constante de antibióticos tem provocado uma série de problemas dentre os quais se destacam o desequilíbrio da ecologia humana e a resistência microbiana, fazendo com que se busquem novos antibióticos que sejam eficazes, abrindo caminhos para a evolução das pesquisas, pois o desenvolvimento de qualquer novo antimicrobiano vem acompanhado pela resistência dos microrganismos. A emergência de patógenos resistentes é uma ameaça a esses avanços (Moellering Jr 2000).

Esta vertente na pesquisa de novos compostos com ação antimicrobiana tem levado a comunidade científica a investigar a corrida medicamento x microrganismos, pois desde o início dos anos 80 o número de antimicrobianos em fase de desenvolvimento diminuiu consideravelmente enquanto que a resistência dos microrganismos aos mesmos tem crescido de forma imensurável, porque eles estão cada vez mais desenvolvendo uma série de novos mecanismos de resistência (File Jr 2000). O estudo da resistência bacteriana, geralmente é baseado em microrganismos de importância epidemiológica, tais como S. aureus, E. coli, P. aeruginosa e fungos leveduriformes, responsáveis por diferentes processos etiológicos tanto em pacientes imunocompetentes quanto em pacientes imunodeprimidos (Michelin et al., 316; Oliveira et al., 2006; Lima et al., 2006a; Lima et al., 2006b).

Neste contexto, esta investigação objetiva submeter à análise da atividade antimicrobiana, adotando para realização do screening o método de difusão em placas de Mueller-Hinton (para bactérias) e de agar Sabouraud (para fungos), tomando-se como referencial, o método de difusão em agar, segundo Bauer et al. (1966), bem como sua concentração inibitória mínima (CIM).

Dentre as substâncias utilizadas estão o extrato etanólico bruto de Ocotea duckei Vattimo, seus lignóides totais e seu composto majoritário, a iangambina (Figura 1), uma lignana furofurânica com potencial atividades biológicas (Castro-Faria-Neto et al., 1995a,b; Morais et al., 1996; Ribeiro et al., 1996; Tibiriçá et al., 1996; Herbert et al., 1997; Serra et al., 1997; Morais et al., 1998a,b; Barbosa-Filho et al., 1999; Morais et al., 1999Araújo et al., 2001; Marques et al., 2003; Sousa et al., 2005). De O. duckei também foram isolados vários alcalóides com atividades biológicas (Morais et al., 1998b; Silva et al., 2002; Dias et al., 2003).

O lapachol é uma hidroxi-naftoquinona substituída, 2-hidroxi-3-(3-metil-2 butenil)-1,4-naftalenodiona, descoberto e estudado desde o século passado, e isolado pela primeira vez do lenho da árvore argentina "Lapacho" Tabebuia avellanedae , Lar. (Bignoniaceae). Posteriormente o lapachol também foi encontrado em várias outras espécies como, por exemplo, no pau-d’arco-roxo (Tabebuia sp) (Fonseca et al., 2003). Neste trabalho estudamos o lapachol e seus derivados semi-sintéticos: a-lapachona, b-nor-lapachona, b-lapachona, a-nor-lapachona (Barbosa, 2006), 3-iodo-b-lapachona, 3-iodo-a–lapachona (Barbosa-Filho et al, 2006), assim como os derivados nitrogenados obtidos por semi-síntese, 2-amino-1,4-naftalenodiona (L-01), 2-(2,2-dimetoxietilamino)-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftalenodiona (L-02), 1-(2,2-dimetoxi-etil)-2,2-dimetil-1,2-diidro-benzo[g]quinolina-5,10-diona (L-03), 1-benzil-2,2-dimetil-1,2-diidro-benzo[g]quinolina-5,10-diona (L-04), 2-(2-hidroxietilamino)-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftalenodiona (L-05), 4-(1-hidroxi-1-metil-etil)-4,5-diidro-1H-nafto[2,3-b]azepina-6,11-diona (L-06), N -[1,4-diidro-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-dioxo-2-naftalenil]-glicina (L-07), 2-amino-3-(3-metil-2-butenil)-1,4-naftalenodiona (L-08) (Figura 2) (Camara et al., 2001; Camara et al., 2002; Barbosa et al., 2005; Silva et al., 2005), e as imidas cíclicas que são substâncias similares ao alcalóide filantimida obtido de Phylanthus sellowianus (Euphorbiaceae) com importante atividade biológica (Figura 3) (Lima et al., 1999).

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Neste trabalho foi utilizado o extrato etanólico bruto obtido das cascas do caule e folhas de Ocotea duckei Vattimo, a fração de lignóides totais e o composto purificado iangambina (Figura 1), gentilmente cedidos pelo Prof. J.M. Barbosa Filho, obtidos de acordo com o procedimento descrito por Barbosa-Filho et al (1999). Uma exsicata da espécie encontra-se depositada no Herbário Lauro Pires Xavier - DSE/UFPB - sob nº: 4.309.

O lapachol e todos os seus derivados (Figura 2) foram gentilmente cedidos pelo Prof. Celso Amorim Camara conforme procedimentos descritos na literatura (Barbosa, 2006; Barbosa-Filho et al, 2006; Camara et al., 2001; Camara et al., 2002; Barbosa et al., 2005; Silva et al., 2005).

As imidas cíclicas foram gentilmente cedidas pelo Prof. Valdir Cechinel-Filho, obtidas de acordo com o procedimento descrito por Lima et al (1999).

Além das substâncias em teste também foram utilizadas o DMSO (dimetilsulfóxido), o Tween 80 e água destilada estéril. Os meios de cultura utilizados foram Agar Mueller-Hinton (Difco), Agar Sabouraud (Difco) e caldo BHI (Difco).

Os microrganismos utilizados foram: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Candida albicans ATCC 76645, além de 14 cepas de E. coli , 11 cepas de S. aureus de origem humana e 07 cepas de fungos leveduriformes da coleção do Laboratório de Micologia da UFPB e 01 cepa de S. aureus resistent-meticilin (MRSA) do laboratório de genética do CCEN/UFPB.

Métodos

Método de difusão em placas com meio sólido Mueller-Hinton (para bactérias) e Agar Sabouraud (para fungos). Tomando-se como referencial, o método de difusão em agar, segundo Bauer et al. (1966) e as recomendações do National Committee for Clinical Laboratory Standart (NCCLS, 2002).

Concentração Inibitória Mínima (CIM) – Os testes foram realizados segundo as normas do NCCLS ( 2002).

Inóculo – Os microrganismos foram inoculados em caldo BHI e incubados a 37 ºC/24h, a fim de se obter uma turvação equivalente a 0,5 de McFarland.

Semeio – O inóculo microbiano foi semeado, na superfície das placas de Agar Mueller Hinton e/ou Agar Sabouraud, com auxílio de swabs estéreis. Em seguida foram realizadas perfurações de 6 mm de diâmetro

A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada observando-se a formação de halos de inibição ao redor das cavidades padronizadas. O volume de distribuição do meio de cultura nas placas de Petri, 90 x 15 mm, corresponde a 20 mL. Foram depositados 50 µL do produto em teste em cada cavidade. A CIM representa a mais alta diluição da substância em teste que conseguiu inibir o crescimento dos microrganismos.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Tabela 1 apresenta o comportamento das cepas de S. aureus testadas frente ao extrato etanólico bruto de Ocotea duckei Vattimo, seus lignóides totais e iangambina pura, em função do tamanho do halo de inibição de crescimento. Nesse estudo, foi considerado, produto ativo, aquele com atividade antimicrobiana, apenas pela presença de halo de inibição de crescimento, independentemente do seu tamanho. Todos os produtos foram testados na concentração de 200 µg/mL. De acordo com os resultados obtidos verificou-se que o extrato bruto de O. duckei foi o único produto que apresentou atividade sobre 6 (50%) das cepas de S. aureus ensaiadas apresentando halos de inibição de crescimento que variaram de 7 a 10 mm de diâmetro.

A Tabela 2 apresenta o comportamento desses mesmos produtos, frente a cepas de E. coli , observando-se que a iangambina foi o único produto do grupo estudado, que apresentou halo de inibição de crescimento para 15 (100%) das cepas testadas. Os lignóides totais, não apresentaram atividade antimicrobiana para nenhuma das cepas de S. aureus nem de E. coli testadas.

A Tabela 3 apresenta os resultados da avaliação da atividade antimicrobiana do lapachol e seus análogos. Esses produtos foram avaliados frente a Candida albicans ATCC 76645 e a 10 outras cepas de Candida provenientes de pacientes ambulatoriais (coleção do Laboratório de Micologia da UFPB). Esses produtos também foram testados frente às cepas Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, usadas rotineiramente como padrão em estudos de atividade antimicrobiana, de acordo com o NCCLS (2002).

Os resultados demonstraram que o lapachol e seus análogos foram mais ativos para S. aureus ATCC 25923 e P. aeruginosa ATCC 27853.

A maioria das substâncias derivadas do lapachol mostrou potencial antimicrobiano diante das cepas testadas, excetuando-se as leveduras.

Para os derivados nitrogenados obtidos a partir do lapachol, observou-se halos de inibição de crescimento apenas para L-04 (12 mm) e para L-08 (15 mm), frente a S. aureus ATCC 25923. As demais substâncias desse grupo não apresentaram atividade antimicrobiana para nenhuma das cepas testadas.

Em relação às leveduras, apenas o b-norlapachona e o b-lapachona apresentaram halo de inibição de crescimento de 13 mm e 10 mm, respectivamente, evidenciando atividade antifúngica frente a uma cepa de Saccharomices cerevisae.

Nos testes com as imidas, observou-se que houve uma predominância na formação de halos de inibição de crescimento para os fungos leveduriformes exceto para as imidas 422, 424, 425, e 426. Não se observou o mesmo comportamento para as cepas bacterianas, levando a crer que essas substâncias têm ação antifúngica e não antibacteriana como mostra a Tabela 4.

Observa-se que houve uma predominância na formação de halos de inibição de crescimento para fungos leveduriformes. Não se observa o mesmo comportamento para as cepas bacterianas. Testes posteriores, com maior número de microrganismos podem confirmar esta tendência na atividade antimicrobiana das imidas.

Em relação à avaliação da concentração inibitória mínima (CIM), foram utilizadas apenas as substâncias mais ativas, que foram testadas frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, cepas recomendadas pelo NCCLS (2002), quando se avalia o perfil de atividade de antibióticos. Incluiu-se também uma cepa de S. aureus multirresistente (S. aureus 171c MRSA) de origem humana, doada pelo Laboratório de Genética do CCEN/UFPB.

Em relação aos produtos derivados nitrogenados obtidos a partir do lapachol por semi-síntese, apenas o L-08 apresentou atividade antimicrobiana, sendo esta limitada aos S. aureus. A CIM deste produto foi de 50 µg/mL. A iangambina, apresentou discreto halo (7 mm) apenas na concentração de 200 µg/mL para a cepa de E. coli ATCC. Este resultado deve ser melhor investigado, incluindo-se outras cepas de E. coli (origem humana), além das cepas cujos testes não foram realizados. (Tabela 5).

Observou-se que as substâncias lapachol, a-lapachona, b-lapachona e a-I-lapachona tiveram CIM de 100 µg/mL para as cepas analizadas, excetuando a E. coli. A concentração de 50 µg/mL pode ser considerada como a CIM para os produtos b-lapachona, a-lapachona e b-I-lapachona, quando estudados apenas para S. aureus.

É importante ressaltar que o produto b-nor-lapachona apresentou a menor CIM (50 µg/mL) para todos os microrganismos testados, exceto a E. coli. Provavelmente esse produto derivado do lapachol pode ser o mais eficaz da série.

CONCLUSÃO

De acordo com estes resultados pode-se afirmar que existe a necessidade de se padronizar e aprofundar as técnicas de determinação de atividade antimicrobiana, de novas substâncias.

É importante lembrar que outras metodologias podem ser utilizadas, com o intuito de corroborar e assegurar estes resultados.

Pode-se dizer, no entanto, que o lapachol e seus derivados possuem atividade antibacteriana e as imidas possuem atividade antifúngica.

A b-nor-lapachona pode ser o produto de maior potencial antimicrobiano da série em teste neste trabalho.

Diante do aprofundamento deste estudo estas substâncias podem se apresentar como agentes antimicrobianos em potencial.

Recebido em 05/04/06. Aceito em 08/09/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Recebido
  05 Abr 2006
• Aceito
  08 Set 2006