Desenvolvimento e validação da metodologia de quantificação gravimétrica de resina glicosídica em fitoterápicos contendo Operculina macrocarpa (L.) Urban

Development and validation of the gravimetric quantification of the glucoside resin in phytomedicine containing Operculina macrocarpa (L.) Urban

ARTIGO

Desenvolvimento e validação da metodologia de quantificação gravimétrica de resina glicosídica em fitoterápicos contendo Operculina macrocarpa (L.) Urban

Development and validation of the gravimetric quantification of the glucoside resin in phytomedicine containing Operculina macrocarpa (L.) Urban

Luciana R. Lima^I; Haroudo S. Xavier^II; Juliana L. Meira^III; Pedro J. Rolim Neto^I,*

^ILaboratório de Tecnologia dos Medicamentos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50740-521, Recife, PE, Brasil

^IILaboratório de Farmacognosia, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50740-521, Recife, PE, Brasil

^IIINúcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco, Cidade Universitária, 50740-521, Recife, PE, Brasil

RESUMO

O extrato de tubérculos de Operculina macrocarpa (Jalapa do Brasil) é um produto fitoterápico, com eficácia no tratamento de constipação, como laxante. A resina quantificada é extraída com solução hidroalcóolica apresentando constituintes orgânicos e inorgânicos, podendo ser dividida em duas frações principais: uma solúvel em éter, chamada de jalapina e outra, mais polar, ainda pouco estudada, denominada convolvulina. O interesse principal deste trabalho foi propor uma otimização da metodologia gravimétrica para doseamento da resina descrita na Farmacopéia Brasileira primeira edição e sua validação com o objetivo de diminuir os custos e o tempo de partição das fases. Os resultados obtidos na validação foram tratados estatisticamente por análise de variância one-way (ANOVA) e teste t de Student. O método demonstrou atender aos requisitos de boas práticas em laboratórios exigidos pela legislação brasileira em vigor, RE n° 899 de 29 de maio de 2003 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, sendo, portanto, sensível, exato e preciso para o doseamento do extrato de Operculina macrocarpa, conhecida popularmente como Jalapa-do-Brasil.

Unitermos:Operculina macrocarpa, jalapa do Brasil, doseamento, validação, fitoterápico.

ABSTRACT

The tubercle extract of Operculina macrocarpa (Jalap of Brazil) is a phytomedicine, with effectiveness in the treatment of constipation, as laxative. The quantified resin is extracted with hydro-alcoholic solution, presenting organic and inorganic constituents, separable in two main fractions: one soluble in ether, called jalapina and other, more polar, still little studied, called convolvulina. The main objective of this work was to consider the optimization of the gravimetrical methodology for assay of the resin described in the Brazilian Pharmacopeia, First Edition and its validation, with the objective to diminish the costs and the partition time of the phases. The results achieved in the validation had been statistically treated by one-way Variance Analysis (ANOVA) and t test of Student. The method demonstrated to attend to the Good Manufacture Practice requirements for laboratories, demanded by actual brazilian law, RE n° 899 of May 29^th of 2003 from the National Agency of Sanitary Vigilance, being therefore, sensible, accurate and precise for the assay of the Operculina macrocarpa extract, known popularly as Jalap of Brazil.

Keywords:Operculina macrocarpa, Jalap of Brazil, assay, validation, phytomedicine.

INTRODUÇÃO

A Operculina macrocarpa (L.) Urban é uma Covolvulaceae anual, com hábitos de trepadeira, distribuída principalmente em regiões tropicais e subtropicais. Fazem parte também desta família as espécies do gênero Ipomoea , que produzem a conhecida raiz tuberosa de batata doce (Joly, 1975).

A jalapa é encontrada em regiões compreendidas entre Antilhas e o Brasil, além de regiões temperadas dos Andes Mexicanos, em regiões lamacentas e de solo profundo. (Planchon,1937). No Brasil é encontrada em vários estados recebendo assim diversas sinonímias populares, dentre as mais citadas na literatura estão: batata-de-purga, xalapa, jalapa-de-São Paulo, purga-do-Amaro Leite, jalapa-do-Brasil (Cruz, 1980; Michelin; Salgado 2004).

Dentre as várias utilizações populares, as mais freqüentes são como laxante e purgativo em prisão de ventre e constipação crônica. Emprega-se também como depurativo do sangue e na leucorréia, diarréia, disenteria, fraqueza geral. Esta planta tem também a propriedade de regularizar a menstruação (Cruz, 1980; Michelin; Salgado 2004).

Classicamente a constituição química de Convolvulaceae é definida por dois grupos resinosos principais, um deles solúvel em éter, denominado de jalapina e outro, mais polar, ainda pouco estudado, denominado de convolvulina (Noda, 1987). Ainda fazem parte da constituição das resinas outros compostos orgânicos e inorgânicos (Shellard,1961).

A grande utilização da Operculina macrocarpa levou à sua inclusão na primeira e segunda Farmacopéia Brasileira (Brandão et al., 2006).

É exigência da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Resolução (RDC N° 48, 2004), que regula os medicamentos fitoterápicos, que para efeito de registro, se faz necessário a elaboração de um relatório de controle de qualidade, incluindo análises qualitativas e quantitativas dos princípios ativos e/ou marcadores, quando conhecidos, ou classes de compostos químicos característicos da espécie.

Sendo parte integrante da qualidade, a validação segundo normas da ANVISA (Resolução RE n° 899, 2003), tem como objetivo garantir, por meio de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade, linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade, limite de quantificação, exatidão, adequados à análise, demonstrando que o método é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos. O uso de ferramentas estatísticas adequadas, tais como teste T Student e teste F, análise de variância, regressão linear entre outras, estão indicadas para demonstração dessa evidência objetiva da validade do método (Barros, 2002).

O presente trabalho teve como objetivo desenvolver e validar uma metodologia de doseamento para o extrato de Jalapa do Brasil a partir de método gravimétrico.

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Foram coletadas amostras de Operculina Macrocarpa em São José de Espinhais no Estado da Paraíba, numa vegetação de caatinga, situada nas coordenadas:06°50’50’’S e 37°19’33’’W. A responsável pela identificação da espécie foi a prof. Maria Bernadete Costa e Silva, a exsicata se encontra depositada no IPA (Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária) sob n° de registro 66.300.

O material utilizado foi o extrato hidroalcóolico 50% de Jalapa do Brasil (Operculina macrocarpa ), clorofórmio (Nuclear^®), citrato de potássio (Nuclear^®), água destilada, acetato de etila (Nuclear^®), propanol (Merck^®), metaperiodato de sódio (Merck^®), benzidina (Merck^®), placas cromatográficas de gel de sílica Merck.

Preparação do extrato de jalapa

Foram pesados 400 g de batata de purga secas e trituradas com tamanho de partícula entre 400 – 840 µm e transferidas para um percolador de aço inox onde foi submetida a um processo de maceração por 24 horas utilizando 2000 mL de solução hidroalcóolica 50%.

Este processo foi definido a partir de ensaios em diferentes condições, fazendo variar o tamanho de partículas, o tempo de maceração e a proporção de solução hidroalcóolica.

O método gravimétrico (Farmacopéia Brasileira 1ª ed.,1926) determina que sejam tomados 20 mL de extrato e transferidos para um funil de separação, em seguida adiciona-se 10 mL de clorofómio, 12 g de citrato de potássio e 12 mL de água destilada, agita-se vigorosamente e deixa em repouso por 12 horas. Ocorre uma separação em duas fases: uma clorofórmica (superior) e uma aquosa (inferior). A fase inferior é descartada e a fase superior é transferida para uma cápsula previamente tarada e concentrada em banho-maria. O resíduo é seco a 100°C até peso constante.

Foi desenvolvida uma metodologia na qual o citrato de potássio foi retirado e a fase quantificada passou a ser a inferior. Também foi viabilizada uma redução no tempo de partição das fases que passou de 12 para 2 horas sem redução na capacidade de partição das duas fases. Esta avaliação ocorreu a partir da observação da qualidade da partição em diferentes tempos.

Estudo da validação

Os parâmetros avaliados foram a Robustez, Linearidade, Especificidade, Precisão, Limite de Detecção (LD), Limite de Quantificação (LQ) e Exatidão.

Linearidade

A linearidade foi avaliada através do tratamento dos dados por regressão linear pelo método dos mínimos quadrados dos pontos médios de 3 (três) curvas de calibração autênticas, contendo cinco concentrações equivalentes a 5; 7,5; 10; 12,5 e 15 mg/mL da resina de Jalapa.

Limite de detecção (LD) e Limite de quantificação (LQ)

Os limites de detecção e o de quantificação foram calculados pela divisão do desvio padrão dos coeficientes lineares das três curvas de calibração do ensaio de linearidade pela média dos coeficientes angulares destas respectivas curvas e multiplicado por 3,0 e 10,0 respectivamente. (Resolução RE n° 899, 2003)

Robustez

A robustez do método avaliou as seguintes variáveis: presença ou ausência de citrato, presença ou ausência de luz e tempo de partição das fases. A avaliação dos resultados foi realizada através da análise de variância one-way (ANOVA) e teste t de Student.

Especificidade

Foi avaliada a partir da análise do placebo solução hidroalcóolica 50% em cromatografia de camada delgada, utilizando como fase móvel: acetato de etila/propanol/água (5,7:3,2:1,3), fase fixa: placa cromatográfica de gel de sílica Merck e substância reveladora: metaperiodato de sódio/benzidina

Precisão

A precisão foi avaliada nos níveis: repetitividade e precisão intermediária. A repetitividade foi determinada pela análise de seis amostras individuais (sextuplicata). A precisão intermediária foi determinada em dois dias por dois analistas diferentes.

A repetitividade foi expressa através do coeficiente de variação entre as amostras (CV) e a precisão intermediária, além do CV, foi avaliada pelo teste t de Student.

Exatidão

A exatidão do método foi avaliada a partir da análise de amostras em concentrações conhecidas do extrato de Jalapa equivalentes a 50, 100 e 150% da concentração teórica analisada. Os resultados foram avaliados através do teste t de Student pareado, comparando-se os resultados em relação ao valor teórico definido para cada concentração analisada.

Todas as análises foram realizadas em triplicatas e para cada parâmetro avaliado foram preparadas curvas controles diárias com as concentrações de 5, 10 e 15 mg/mL.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir do extrato fluido obtido e otimizado no processo, controlando-se as variáveis: tamanho de partícula, tempo de maceração e proporção da solução extrativa, foi desenvolvida e validada a metodologia analítica de tal maneira que o citrato de potássio, que tinha a função na metodologia de tornar a fase aquosa mais densa que a clorofórmica, foi retirado e a fase quantificada passou a ser a inferior.

O tempo de partição das fases (clorofórmica e aquosa) foi reduzido de 12 para 2 horas, na ausência de citrato.

A cápsula de porcelana e o banho-maria foram substituídos por placa de petri e chapa de aquecimento reduzindo, assim, o tempo de análise sem com isso prejudicar o teor do analito.

Com a retirada do citrato de potássio e a redução do tempo de partição, foram reduzidos os custos analíticos tornando a metodologia mais viável para aplicação na rotina industrial.

Para o parâmetro de linearidade, os resultados apresentados estão ilustrados (Figura 1) e demonstraram que o método é linear, tendo regressão linear estatística significativa, com equação da reta: Y = 1,4867(±0,0521)X – 1,2667 (± 1,1073), correlacionando concentração do extrato (X) e porcentagem de resina obtida (Y), onde R² = 0,9935, o que sugere que 99,35 % dos valores são explicados em torno da média, sendo minimizado os resíduos.

A partir da análise de variância (Tabela 1) podemos verificar a linearidade do método e a significância estatística da curva ajustada. As análises de variância dos dados demonstraram que o método é linear, na faixa de concentração testada (5 – 15 mg/mL) e que não há falta de ajuste do modelo com 95% de confiança.

Os limites de detecção (1,2816 mg/mL) e de quantificação (1,9418 mg/mL) obtidos de acordo com o tratamento descrito na RE nº 899, ANVISA, mostram que o método é bastante sensível à resina.

Os resultados da avaliação dos parâmetros da robustez foram avaliados por teste t de Student e análise de variância one-way e estão apresentados na tabela 2.

Como os valores calculados foram menores que os tabelados comprovou-se que não há diferença estatisticamente significativa entre variáveis dos diferentes parâmetros analisados, com um intervalo de confiança de 95%.

O método apresentou-se preciso nos dois níveis avaliados. A repetitividade realizada em sextuplicata com concentração a 100%, apresentou um coeficiente de variação (CV) de 4,43% inferior ao especificado pela Resolução vigente, que é de 5 % (Tabela 3).

Na precisão intermediária, não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas entre analistas e dias diferentes, empregando-se o teste t de Student , com 95% de confiança, como observado nas Tabelas 4 e 5, onde o t _calculado é inferior ao t _tabelado.

Na análise do placebo (solução hidroalcóolica 50%), não foi detectada a presença de açucares característicos da resina da Jalapa comprovando-se a especificidade do método (Figura 2).

A exatidão do método foi comprovada pelo estudo de três concentrações diferentes (50%, 100%, 150%). Os resultados foram tratados pelo teste t de Student , o qual demonstrou que o t_calculado foi inferior ao t_tabelado comprovando que não houve diferença estatisticamente significativa entre os valores médios obtidos e os esperados das três concentrações analisadas, com um intervalo de 95% de confiança (Tabela 6). Para as concentrações de 50%, 100% e 150%, foram encontrados os respectivos percentuais de recuperação: 51,67%, 103,5% e 153,33%.

CONCLUSÃO

O método apresentado foi desenvolvido e validado com a finalidade de disponibilizar uma metodologia alternativa para a quantificação da resina de Operculina macrocarpa. Os resultados obtidos mostram que o método atende aos requisitos de boas práticas de laboratório, pois apresenta a confiabilidade requerida para um método analítico.

Além de ser uma alternativa rápida, segura e de baixo custo para a rotina de uma indústria farmacêutica, evidencia a vital importância dessa ferramenta de qualidade no desenvolvimento de metodologias analíticas voltadas para a realidade de cada empresa no segmento de produtos fitoterápicos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem pelo financiamento à CAPES, PRONEX, CNPq e ao Laboratório Industrial Farmacêutico Sobral.

Recebido em 13/01/06. Aceito em 20/07/06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Maio 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Recebido
  13 Jan 2006
• Aceito
  20 Jul 2006