Proteinograma sérico e do líquido peritoneal de equinos hígidos e daqueles submetidos à obstrução intestinal experimental

Serum and peritoneal protein profile of healthy horses and horses subjected to experimental intestinal obstruction

ARTIGOS CIENTÍFICO

CLÍNICA E CIRURGIA

Proteinograma sérico e do líquido peritoneal de equinos hígidos e daqueles submetidos à obstrução intestinal experimental

Serum and peritoneal protein profile of healthy horses and horses subjected to experimental intestinal obstruction

Andressa Francisca Silva Nogueira^I,1; Paula Alessandra Di Filippo^II; Letícia Abrahão Anai^I; Gener Tadeu Pereira^III; Aureo Evangelista Santana^I;

^IDepartamento de Clínica e Cirurgia Veterinária (DCCV), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IILaboratório de Clínica e Cirurgia Animal (LCCA), Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Campos dos Goytacazes, RJ, Brasil

^IIIDepartamento de Ciências Exatas (DCE), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal, SP, Brasil

RESUMO

Avaliou-se a resposta de fase aguda através da concentração das proteínas de fase aguda (PFA) no soro sanguíneo e no líquido peritoneal de vinte e um equinos, hígidos e submetidos à obstrução intestinal experimental, distribuídos em quatro grupos: obstrução de duodeno - GD (n=6), íleo - GI (n=6), cólon dorsal esquerdo - GM (n=6) e controle instrumentado - GC (n=3). Foram colhidas amostras de sangue e líquido peritoneal e, após centrifugação e fracionamento, as proteínas de fase aguda foram separadas por eletroforese em SDS-PAGE. Identificaram-se as proteínas IgA, ceruloplasmina, transferrina, albumina, IgG, haptoglobina, α₁-glicoproteína ácida e P24, no soro e no líquido peritoneal. Houve aumento nas concentrações sérica e peritoneal de todas as PFA, sendo mais evidente no líquido peritoneal e nos animais obstruídos. O fracionamento eletroforético das PFA no líquido peritoneal é mais eficaz no diagnóstico de processos inflamatórios abdominais, quando comparado ao sérico.

Palavras-chave: sangue, líquido peritoneal, equinos, cólica, proteínas de fase aguda.

ABSTRACT

It was evaluated the acute phase response over the concentration of acute phase proteins (APP) in serum and in peritoneal fluid of twenty-one healthy equines submitted to experimental intestinal obstruction distributed in groups: duodenal obstruction (GD), ileum obstruction (GI), left-dorsal colon (GM), and instrumentalized control (GC). Blood and peritoneal liquid samples were collected, after centrifugation and fractioning and the acute phase proteins were separated by electrophoresis in SDS-PAGE. The acute phase proteins (APP) identified were IgA, ceruloplasmin, transferrin, albumin, IgG, haptoglobin, α₁-acid glycoprotein and P24, in the serum and liquid peritoneal. There was anincrease in the serum and peritoneal proteins concentrations evidencing a higher response of the APP from the peritoneal fluid and of the obstructed groups. The electrophoretic separation of the proteins included in the peritoneal liquid is more effective when compared to the serum concentration in the diagnosis of abdominal inflammatory processes.

Key words: blood, peritoneal fluid, horses, colic, acute phase proteins.

INTRODUÇÃO

A síndrome cólica é uma das principais causas de urgência cirúrgica em equinos. O desencadeamento do quadro de cólica não depende, na maioria das vezes, de um único fator de risco (LARANJEIRA & ALMEIDA, 2008). Tais fatores, isolados ou combinados, internos ou externos, podem interagir de várias formas, dando início a alterações fisiológicas (TRAUB-DARGATZ, 2001) que repercutem diretamente na composição dos fluidos orgânicos (VALADÃO et al., 1996), modificando-os na dependência do tempo, localização e gravidade do processo de obstrução (NAPPERT & JOHNSON, 2001).

Em consequência a processos inflamatórios decorrentes de injúria, trauma ou infecção de um tecido, há síntese e liberação das proteínas de fase aguda (PFA), que surgem precocemente na circulação sanguínea. Suas concentrações séricas relacionam-se à severidade da afecção e à extensão das lesões teciduais. Na espécie equina, a Amiloide A sérica (SAA) é considerada a PFA mais sensível, mudando suas concentrações séricas rapidamente perante um dano tecidual ou inflamação aguda (CYWINSKA et al., 2010). Dessa forma, suas qualiquantificações podem prover informações diagnósticas e prognósticas importantes, se mensuradas em tempo ideal (MURATA et al., 2004). A eletroforese de proteínas de fase aguda auxilia no diagnóstico precoce de processos inflamatórios (DI FILIPPO et al., 2010), fornecendo informações sobre elevações ou diminuições nas concentrações de tais proteínas de fase aguda (THOMAS, 2000). Assim, objetivou-se avaliar e comparar as concentrações séricas e peritoneais das proteínas de fase aguda em equinos submetidos à obstrução experimental do duodeno, íleo e/ou cólon maior.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se vinte e um equinos adultos, sem raça definida, divididos em quatro grupos. Uma semana antes do experimento, foi realizado exame clínico, hemograma e vermifugação, com intuito de garantir que os animais apresentavam-se saudáveis. Três grupos de seis animais tiveram um segmento intestinal diferente obstruído: duodeno (GD), íleo (GI) ou cólon maior (GM), e três animais compuseram o grupo controle (GC), e foram submetidos aos mesmos procedimentos anestésicos e cirúrgicos realizados para os animais dos demais grupos, porém, sem a realização da obstrução de um segmento intestinal.

Com os animais em estação, foi realizada sedação com acepromazina 1% (Acepran - 0,025mg kg^-1, IV)^a, cloridrato de xilazina 2% (Virbaxil - 0,5mg kg^-1, IV)^b e meperidina (Dolosal - 4mg kg^-1, IM)^c. Ato contínuo, procedeu-se à anestesia local infiltrativa, utilizando-se da associação (1:1) de lidocaína 2% (Lidovet)^d e de bupivacaína 0,75% (Neocaína)^e, ambas sem vasoconstritor. Conduziu-se então, por meio da laparotomia, flanco direito para duodeno e íleo, e esquerdo para cólon maior, a obstrução do segmento intestinal, com dreno de Penrose n° 3, segundo modelo descrito por Datt & Usenik (1975). Nesse exato momento, os animais receberam cloridrato de tramadol (Tramal - 1,5mg kg^-1, IV)^f. As obstruções foram mantidas por três horas e então removidas, permanecendo assim por mais três horas. No pós-operatório, instituiu-se terapia antimicrobiana a base de penicilina benzatina (Pentabiótico Veterinário Reforçado - 30.000UI kg^-1, IM)^g a cada 48 horas, perfazendo três aplicações. Como analgésico e anti-inflamatório, administrou-se flunixin meglumine (Flunexina Injetável - 0,5mg kg^-1, IV)^h a cada 24 horas, durante dois dias. As feridas cirúrgicas foram tratadas com polivinilpirrolidona-iodo tópica a 1%, duas vezes ao dia, até a retirada dos pontos no 10° dia pós-operatório.

As amostras de soro foram colhidas por punção da veia jugular e as de líquido peritoneal foram colhidas por paracentese abdominal nos períodos pré-cirúrgico (T0), três horas após a obstrução (T3), três horas após a desobstrução (T6) e no 1°, 4° e 7° dias do pós-operatório (T30, T102 e T174).

As concentrações de proteínas totais foram obtidas pelo método do Biureto, com o auxílio de um conjunto de reagentesⁱ e leituras espectrofotométricas^j.

Para o fracionamento das proteínas, procedeu-se à eletroforese em gel de poliacrilamida, contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Os pesos moleculares e as concentrações das frações proteicas foram determinados por densitometria computadorizada^k. Para o cálculo do peso molecular, foram utilizados marcadores^l de pesos moleculares de 200, 116, 97, 66, 55, 45, 36, 29, 24 e 20kDa, além das proteínas purificadasl albumina, α₁-antitripsina, haptoglobina, ceruloplasmina, transferrina e imunoglobulina G (IgG).

A análise estatística dos dados foi estabelecida por meio do teste de Tukey, fixando-se a variância em P<0,05 para comparação das médias, através do programa estatístico SAS.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos proteinogramas sérico e do líquido peritoneal, verificaram-se a presença de 20 a 63 frações proteicas, cujos pesos moleculares variaram de 15 a 318kDa. Destas, destacam-se importantes PFA: imunoglobulina A com peso molecular igual a 175kDa, ceruloplasmina 110kDa, transferrina 80kDa, albumina 65kDa, imunoglobulina G (cadeia pesada com 55kDa e cadeia leve com 29kDa), haptoglobina 42kDa, α₁-glicoproteína ácida 39kDa e uma proteína considerada como de fase aguda, com peso molecular correspondente a 24kDa (P24) e não identificada nominalmente na literatura. Essa técnica não permite a qualiquantificação da proteína SAA, que, segundo ECKERSALL (2000), para a espécie equina, é avaliada através da técnica de ELISA, utilizando-se substrato quimioluminescente, de difícil mensuração, o que torna o método menos popularizado.

As concentrações das proteínas séricas totais encontradas nos animais (Tabela 1) assemelharam-se aos valores de referência para espécie, descritos na literatura (KRAMER, 2000), no intervalo de 5,8-8,7g dL^-1. No líquido peritoneal, as concentrações elevaram-se significativamente ao longo do período experimental (Tabela 2). Esse aumento, se analisado isoladamente, poderia indicar comprometimento da integridade da parede intestinal, o que acarretaria alteração vascular e consequente extravasamento de fluidos e de elementos plasmáticos para o interior da alça intestinal e/ou cavidade peritoneal, como explicaram VALADÃO et al. (1996). Porém, quando analisado em conjunto com as concentrações obtidas para as proteínas séricas totais, conclui-se que ocorreu resposta inflamatória estimulada pelo ato cirúrgico e pela própria lesão entérica (THOMASSIAN, 1996; LOPES et al., 1999; FAGLIARI & SILVA, 2002).

À análise do eletroforetograma sérico e peritoneal, constatou-se aumento nos valores das α-globulinas (α₁-glicoproteína ácida, ceruloplasmina e haptoglobina) no decorrer do tempo (Tabelas 1, 2, 3 e 4). De acordo com MURATA et al (2004), a concentração de haptoglobina aumenta em processos inflamatórios agudos, estresse, procedimentos cirúrgicos, processos inflamatórios experimentais, bem como a ceruloplasmina aumenta significativamente após processos inflamatórios, infecciosos, virais e parasitários (JACOBSEN, 2007). Por sua vez, α₁-glicoproteína ácida é capaz de auxiliar na remoção de lipopolissacarídeos (LPS) da circulação através da ligação direta com o LPS e, assim, neutralizar sua toxicidade, como explicaram MOORE et al. (1997). Tal assertiva adquire grande relevância quando se avaliam equinos com cólica, visto que os distúrbios gastrintestinais favorecem a transferência de bactérias e toxinas do lúmen intestinal para a corrente sanguínea, contribuindo para o desencadeamento do choque séptico. DI FILIPPO et al, 2011, também encontraram concentrações elevadas de α₁-glicoproteína ácida e haptoglobina em cavalos naturalmente obstruídos, mas não de ceruloplasmina.

Ademais, pode-se inferir que a proteína de peso molecular 24kDa (P24), encontrada no traçado eletroforético do sangue e do líquido peritoneal, comportou-se como uma PFA positiva, classificada na fração α₂-globulina; isso porque os valores das concentrações peritoneais dessa proteína aumentaram progressivamente durante toda a fase experimental, alcançando picos de concentração entre o primeiro e o quinto dia pós-operatório (Tabelas 3 e 4), sendo condizente com o comportamento das α₂-globulinas, descrito por MURATA et al. (2004).

As concentrações séricas de transferrina e albumina variaram ao longo do período experimental (Tabela 1). De acordo com MURATA et al. (2004), a resposta de fase aguda inclui alterações na concentração das PFA. Algumas delas diminuem sua concentração (PFA negativas), tais como a albumina e a β-globulina transferrina, enquanto outras aumentam (PFA positivas). O mecanismo pelo qual as PFA negativas diminuem sua concentração não está definido, mas esse processo pode ser rápido, com redução significativa após 24 horas, ou mais gradual, decrescendo ao longo de dias (ECKERSALL, 2008), sendo mais notável em doenças inflamatórias crônicas (ECKERSALL, 2006). Porém, a transferrina e albumina apresentaram elevações nas suas concentrações, no líquido peritoneal, ao longo do tempo (Tabela 2). Essas elevações observadas nas concentrações peritoneais de albumina, de acordo com THOMASSIAN (1996), LOPES et al. (1999) e FAGLIARI & SILVA (2002), revelam que ocorreu resposta inflamatória estimulada pelo ato cirúrgico e pela própria lesão entérica.

Para as concentrações de gamaglobulinas IgA e IgG, foram observadas oscilações, tanto no soro como no líquido peritoneal, ao longo do tempo experimentado (Tabelas 3 e 4). Segundo ECKERSALL (2008), o aumento das concentrações de gamaglobulinas pode estar relacionado ao aumento da produção de IL-6 e de outras interleucinas, o que pode causar ativação policlonal inespecífica das células B, resultando na produção de anticorpos de origens diferentes. Ademais, as proteínas da fração γ, nos animais domésticos, incluem, principalmente, imunoglobulinas IgA, IgM, IgG e IgE sintetizadas pelo sistema imunológico em resposta a estímulos antigênicos e virais (THOMAS, 2000; ECKERSALL, 2008).

As diferenças entre os resultados obtidos nos proteinogramas sérico e peritoneal, muito provavelmente deveram-se à síntese extra-hepática das proteínas de fase aguda a partir de tipos celulares heterogêneos de órgãos ou tecidos, incluindo leucócitos (FOURNIER et al., 2000) e, especialmente, por células endoteliais e epiteliais de órgãos que se comunicam com o meio externo, tais como glândula mamária, sistema respiratório e trato gastrintestinal. Segundo JACOBSEN (2007), a determinação das concentrações locais das PFA, por fornecer informações sobre o estado inflamatório/infeccioso de um órgão de particular interesse, aumenta a precisão na instituição do diagnóstico.

CONCLUSÃO

O aumento nas concentrações peritoneais de proteína total, α₁-glicoproteína ácida, ceruloplasmina, haptoglobina, P24, transferrina, albumina, IgA e IgG mostram que o proteinograma do líquido peritoneal, em equinos com cólica, é mais sensível e eficaz no diagnóstico de processos inflamatórios abdominais do que o proteinograma sérico. Esse aumento também pode auxiliar na identificação do estado inflamatório, diagnóstico e na elaboração do prognóstico de equinos com cólica.

FONTES DE AQUISIÇÃO

a - Acepran 1% ( Univet S.A.)

b - Virbaxil 2% ( Virbac)

c - Dolosal (Cristália)

d - Lidovet ( Bravet)

e- Neocaína 0,75% ( Cristália)

f - Tramal (Cristália)

g - Pentabiótico Veterinário Reforçado ( Fort Dodge)

h - Flunixina Injetável (UCB S.A)

i - Labtest (Sistema de Diagnósticos Ltda. - Lagoa Santa, Brasil)

j - Labquest (CELM, modelo E-225-D)

k - Fotodyne, (Fotodyne Inc, Houston, TX, USA)

l - Marcador (Sigma Marker 6.500 - 200.000)

COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA

Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA), da Universidade Estadual Paulista (UNESP), conforme protocolo n° 023232-05.

Recebido 24.09.12

Aprovado 12.06.13

Devolvido pelo autor 03.09.13

CR-2012-0890.R2

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Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Nov 2013
• Data do Fascículo
  Nov 2013

Histórico

• Recebido
  24 Set 2012
• Aceito
  12 Jun 2013