Resumos
O objetivo deste trabalho foi avaliar microcápsulas contendo Bifidobacterium animalis e Lactobacillus acidophilus, produzidas por spray drying. Ensaios de sobrevivência foram conduzidos para avaliar a resistência dos probióticos a condições gastrointestinais simuladas e a sua viabilidade durante 120 dias de armazenamento a 4ºC e 25ºC, além da análise morfológica das microcápsulas. A microencapsulação protegeu os probióticos das condições gastrointestinais simuladas, os quais permaneceram viáveis após 120 dias de armazenamento a 4ºC e 25ºC, sendo mais viáveis a 4ºC. As microcápsulas apresentaram forma esférica, com superfície contínua relativamente lisa e sem fissuras. O estudo indica que microcápsulas de B. animalis e L. acidophilus, produzidas por spray drying, sobrevivem a condições gastrointestinais simuladas e podem ser melhor armazenadas por 120 dias a 4ºC
Bifidobacterium animalis; Lactobacillus acidophilus; microcápsulas
The aim of this study was to evaluate microcapsules containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium animalis by spray drying. Survival assays were conducted to evaluate the resistance of probiotics to simulated gastrointestinal conditions and its availability during 120 days of storage at 4°C and 25°C, besides morphological analysis of the microcapsules. Microencapsulation protected the probiotics from simulated gastrointestinal conditions, which also remained viable after 120 days of storage at 4ºC and 25ºC, but more viable at 4ºC. The microcapsules showed spherical shape with relatively smooth continuous surface without cracks. The study indicates that microcapsules of B. animalis or L. acidophilus by spray drying survive in simulated gastrointestinal conditions and can be better stored for 120 days at 4°C
Bifidobacterium animalis; Lactobacillus acidophilus; microcapsules
INTRODUÇÃO
Os probióticos são definidos como micro-organismos vivos capazes de melhorar o
equilíbrio microbiano intestinal, produzindo efeitos benéficos à saúde do indivíduo
(BRASIL, 2002BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.
Alimentos com alegações de propriedades funcionais e ou de saúde, novos
alimentos/ingredientes, substâncias bioativas e probióticos: lista de alegações de
propriedade funcional aprovadas. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/alimentos/comissoes/tecno_lista_alega.htm>. Acesso
em: 07 jan. 2014.
http://www.anvisa.gov.br/alimentos/comis...
), dentre os quais podemos
destacar a prevenção de câncer de cólon; o aumento da resposta imune; o melhor trânsito
intestinal; a redução de episódios de diarreia; a redução do colesterol sanguíneo e o
alívio dos sintomas de intolerância à lactose (WEICHERT
et al., 2012WEICHERT, S. et al. The role of prebiotics and probiotics in prevention
and treatment of childhood infectious diseases. Pediatric Infectious Disease Journal,
v.31, n.8, p.859-862, 2012. Disponível em:
<http://journals.lww.com/pidj/Documents/Prebiotics_and_Probiotics%20ESPID%20Aug%2012.pdf>.
Acesso em: 07 jan. 2014. doi: 10.1097/INF.0b013e3182620e52.
http://journals.lww.com/pidj/Documents/P...
). Entretanto, para que os probióticos tenham sua ação eficaz, tem
sido sugerido que os produtos devam conter pelo menos 6log UFC.g-1
de micro-organismos vivos no momento do consumo (CHÁVEZ
& LEDEBOER, 2007CHÁVEZ, B.E.; LEDEBOER, A.M. Drying of probiotics: optimization of
formulation and process to enhance storage survival. Drying Technology, v.25, n.7-8,
p.1193-1201, 2007. Disponível em:
<http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/07373930701438576#.UtUtYPRDvT8>.
Acesso em: 07 jan. 2014. doi: 10.1080/07373930701438576.
http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1...
), diferentemente do que diz BRASIL (2008), o qual
estabelece o limite mínimo de 8log UFC g-1, com base na porção diária de
alimento. Além disso, os probióticos devem sobreviver a um ambiente totalmente adverso,
o trato gastrointestinal, tolerando ácidos, sais biliares e enzimas. Dessa forma, a
microencapsulação tem sido estudada como uma alternativa para manter a viabilidade
destes micro-organismos (YING et al., 2013YING, D. et al. Microencapsulated Lactobacillus rhamnosus GG in whey
protein and resistant starch matrices: Probiotic survival in fruit juice. Journal of
Functional Foods, v.5, n.1, p.98-105, 2013. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464612001351>. Acesso
em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/j.jff.2012.08.009.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
).
A microencapsulação é uma técnica de encapsulação de substâncias ativas através de um
agente encapsulante, o qual as protege do ambiente adverso, evitando o efeito de sua
exposição inadequada. O agente encapsulante forma uma cápsula que se desfaz através de
estímulo específico, liberando as substâncias ativas no local ideal (SOHAIL et al., 2011SOHAIL, A. et al. Survivability of probiotics encapsulated in alginate
gel microbeads using a novel impinging aerosols method. International Journal of Food
Microbiology, v.145, n.1, p.162-168, 2011. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160510006975>. Acesso
em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2010.12.007.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
).
Alguns métodos têm sido usados para encapsulação de probióticos, dentre eles pode-se
destacar o método por spray drying. Este método envolve a atomização de
uma emulsão ou de uma suspensão de probióticos e agentes de encapsulação em uma câmara
de secagem por ar quente, resultando na rápida evaporação de água. As vantagens do
método por spray drying são a sua rapidez e custo relativamente baixo.
A técnica é altamente reprodutível e sua característica mais importante consiste na sua
adequação para aplicações industriais (BURGAIN et al.,
2011BURGAIN, J. et al. Encapsulation of probiotic living cells: From
laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering, v.104, n.4,
p.467-483, 2011. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S026087741000631X>. Acesso
em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2010.12.031.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
).
O objetivo do presente trabalho foi encapsular B. animalis e L. acidophilus por spray drying e avaliar a sobrevivência dos probióticos sob condições gastrointestinais simuladas e a viabilidade durante 120 dias de armazenamento a 4ºC e 25ºC, além da análise morfológica das microcápsulas.
MATERIAL E MÉTODOS
Ativação e produção do concentrado de micro-organismos probióticos
As culturas liofilizadas de B. animalis (BB12) e L.
acidophilus (LA05) (Christian Hansen) foram ativadas, em caldo MRS e leite em
pó integral 10% esterilizado, respectivamente, ambas a 37°C, por 24 horas. Os
desenvolvimentos bacterianos foram submetidos à centrifugação a 4670g, a 4ºC por 15
minutos e os precipitados foram lavados em solução salina (0,85%) e centrifugados
novamente por duas vezes (LISERRE et al.,
2007LISERRE, A.M. et al. Microencapsulation of Bifidobacterium animalis
subsp. lactis in modified alginate-chitosan beads and evaluation of survival in
simulated gastrointestinal conditions. Food Biotechnology, v.21, n.1, p.1-16, 2007.
Disponível em:
<http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08905430701191064#.UtZvRvRDvT8>.
Acesso em: 06 jan. 2014. doi: 10.1080/08905430701191064.
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.10...
).
Microencapsulação e contagem dos probióticos
Para a formulação do material de parede foram utilizados os seguintes agentes
encapsulantes: acetato ftalato de celulose, glicerol, leite em pó integral,
maltodextrina, trehalose, frutoligossacarídeo, hi-maize 260 e Tween 80. Os agentes
encapsulantes foram dissolvidos em solução tampão fosfato salino 0,05M, pH 7,6, sob
agitação. Ao final da dissolução, foi adicionado 1% dos probióticos ativados e
centrifugados de B. animalis e L. acidophilus, separadamente,
obtendo duas formulações (FÁVARO-TRINDADE & GROSSO,
2000FÁVARO-TRINDADE, C.S.; GROSSO, C.R.F. The effect of the immobilization
of L. acidophilus and B. lactis in alginate on their tolerance to gastrointestinal
secretions. Milchwissenschaft, v.55, n.9, p.496-499, 2000. Disponível em:
<http://www.cabdirect.org/abstracts/20000406005.html>. Acesso em: 06 jan. 2014.
ISSN: 0026-3788.
http://www.cabdirect.org/abstracts/20000...
).
Para a microencapsulação, foi utilizado um mini spray dryer LM, modelo MSD 1.0. As formulações probióticas secas foram coletadas do ciclone, colocadas em frascos de vidro hermeticamente fechados e armazenadas em dessecadores, contendo solução saturada LiCl, dentro de uma incubadora (25ºC) e sob refrigeração (4ºC).
A viabilidade das culturas de B. animalis e L. acidophilus foi
determinada pela contagem das microcápsulas. As microcápsulas foram desintegradas em
solução tampão fosfato salino 0,05M, pH 7,6, na proporção de
0,01g.mL-1. A solução tampão com as microcápsulas foram
submetidas à agitação de 150rpm, a 37ºC por 5 minutos. Após a desintegração, os
micro-organismos foram liberados e enumerados (GROSSO
& FÁVARO-TRINDADE, 2004GROSSO, C.R.F.; FÁVARO-TRINDADE, C.S. Stability of free and immobilized
Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis in acidified milk and of
immobilized B. lactis in yoghurt. Brazilian Journal of Microbiology, v.35, n.1-2,
p.151-156, 2004. Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S1517-83822004000100025&script=sci_arttext>.
Acesso em: 06 jan. 2014. doi: 10.1590/S1517-83822004000100025.
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S151...
). A enumeração foi realizada em ágar MRS pela
técnica de semeadura em profundidade e incubação a 37ºC, em anaerobiose
(GaspakTM EZ Anaerobe, BD), por 72 horas (VINDEROLA & REINHEIMER, 2000VINDEROLA, C.G.; REINHEIMER, J.A. Enumeration of Lactobacillus casei in
the presence of L. acidophilus, bifidobacteria and lactic starter bacteria in
fermented dairy products. International Dairy Journal, v.10, n.4, p.271-275, 2000.
Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694600000455>. Acesso
em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/S0958-6946(00)00045-5.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
).
A avaliação da viabilidade dos probióticos durante o armazenamento foi realizada para determinar o prazo de validade das microcápsulas obtidas. As contagens ocorreram após 1, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 dias de armazenamento a 4ºC e 25ºC.
Sobrevivência dos probióticos às condições gastrointestinais simuladas
A sobrevivência das microcápsulas de B. animalis e L.
acidophilus submetida às condições gastrointestinais simuladas foram avaliadas
de acordo com método descrito por LISERRE et al.
(2007LISERRE, A.M. et al. Microencapsulation of Bifidobacterium animalis
subsp. lactis in modified alginate-chitosan beads and evaluation of survival in
simulated gastrointestinal conditions. Food Biotechnology, v.21, n.1, p.1-16, 2007.
Disponível em:
<http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08905430701191064#.UtZvRvRDvT8>.
Acesso em: 06 jan. 2014. doi: 10.1080/08905430701191064.
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.10...
), com modificações. Separadamente, alíquotas de 5g de microcápsulas
desidratadas de B. animalis e L. acidophilus foram adicionadas
de HCl 1M até atingir pH de 1,4-1,9 e de soluções de pepsina (P7000, Sigma-Aldrich) e
lipase (L3126, Sigma-Aldrich) até a obtenção de concentração de
3g.L-1 e de 0,9mg.L-1,
respectivamente. As amostras foram incubadas a 37ºC, sob agitação contínua, durante duas
horas. Na etapa seguinte, o pH das amostras foi aumentado para 4,3-5,2, usando uma
solução alcalina (150mL de NaOH 1M, 12,38g de
NaH2PO4.H2O e água destilada até 1 L). Bile (B8381,
Sigma-Aldrich) e pancreatina (P3292, Sigma-Aldrich) foram adicionadas até a obtenção de
uma concentração de 10g.L-1 e de 1g.L-1,
respectivamente. As amostras foram incubadas novamente a 37ºC por duas horas, sob
agitação contínua. Na última etapa, o pH foi aumentado para 6,7-7,5, usando a mesma
solução alcalina descrita acima. As concentrações de bile e pancreatina foram ajustadas
para 10g.L-1 e 1g.L-1, respectivamente,
e as amostras foram incubadas novamente a 37ºC por duas horas sob agitação contínua,
finalizando um total de 6 horas de análise. As contagens foram realizadas após 30
minutos, 2 horas, 4 horas e 6 horas de incubação.
Análise morfológica das microcápsulas
As amostras foram fixadas em suportes de alumínio, com auxílio de fita carbono dupla face e metalizadas em metalizador de fluxo iônico DENTON, modelo Desk II. A análise morfológica das microcápsulas foi obtida através de imagens de microscópio eletrônico de varredura JEOL, modelo JSM 6360.
Análise estatística
Os dados foram avaliados através de Análise de Variância (ANOVA), sendo que as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, considerando o nível de significância de 5% (P<0,05), utilizando o software SAS (Statistic Analysis System, versão 9).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliação da viabilidade dos probióticos microencapsulados durante armazenamento
O dano celular e a perda de atividade podem ocorrer durante o processamento e/ou
armazenamento dos micro-organismos. Portanto, a microencapsulação adequada assegura que
os micro-organismos sobrevivam ao processamento e que permaneçam viáveis durante o
armazenamento (OLIVEIRA et al., 2007OLIVEIRA, A.C. et al. Microencapsulation of B. lactis (BI 01) and L.
acidophilus (LAC 4) by complex coacervation followed by spouted-bed drying. Drying
Technology, v.25, n.10, p.1687-1693, 2007. Disponível em:
<http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/07373930701590939#.UuaCaxBTvDc>.
Acesso em: 27 jan. 2014. doi: 10.1080/07373930701590939.
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.10...
).
De acordo com os resultados apresentados na tabela 1, houve diferença significativa
tanto para B. animalis quanto para L. acidophilus armazenados
a 4ºC e 25ºC, durante os 120 dias de análises, verificando um decréscimo nas contagens
com o passar dos dias. Isso pode ser explicado, pois os micro-organismos são
metabolicamente ativos dentro das microcápsulas, produzindo ácidos metabólicos e
bacteriocinas e/ou a perda de substratos (PEDROSO et
al., 2012PEDROSO, D.L. et al. Protection of Bifidobacterium lactis and
Lactobacillus acidophilus by microencapsulation using spray-chilling. International
Dairy Journal, v.26, n.2, p.127-132, 2012. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694612001021>. Acesso
em: 27 jan. 2014. doi: 10.1016/j.idairyj.2012.04.008.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
). Entretanto, ao final dos 120 dias, as contagens foram superiores a
6log UFC.g-1, sendo este o mínimo aceitável para efeito probiótico
em produtos (ROY, 2005ROY, D. Technological aspects related to the use of bifidobacteria in
dairy products. Lait, v.85, n.1-2, p.39-56, 2005. Disponível em:
<http://hal.archives-ouvertes.fr/docs/00/89/55/93/PDF/hal-00895593.pdf>. Acesso
em: 07 jan. 2014. doi: 10.1051/lait:2004026.
http://hal.archives-ouvertes.fr/docs/00/...
), contrariamente ao que
diz BRASIL (2008), o qual estabelece o limite mínimo de 8log UFC.g-1 com base
na porção diária de alimento.
De acordo com RODRIGUES et al. (2011RODRIGUES, D. et al. Influence of L-cysteine, oxygen and relative
humidity upon survival throughout storage of probiotic bacteria in whey protein-based
microcapsules. International Dairy Journal, v.21, n.11, p.869-876, 2011. Disponível
em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095869461100152X>.
Acesso em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/j.idairyj.2011.05.005.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
), a umidade
relativa elevada, a alta temperatura e longos períodos de armazenamento são prejudiciais
para a sobrevivência de probióticos.
Também pode ser verificado, na tabela 1, que
houve diferença significativa quando da comparação de B. animalis e
L. acidophilus, armazenados a 4ºC com 25ºC. Resultados semelhantes foram
encontrados por OKURO et al. (2013OKURO, P.K. et al. Co-encapsulation of Lactobacillus acidophilus with
inulin or polydextrose in solid lipid microparticles provides protection and improves
stability. Food Research International, v.53, n.1, p.96-103, 2013. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996913002172>. Acesso
em: 27 jan. 2014. doi: 10.1016/J.FOODRES.2013.03.042.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
). Estes
resultados sugerem que a estabilidade dos probióticos microencapsulados aumenta com a
diminuição da temperatura. Tal fenômeno ocorre pois os micro-organismos são mantidos num
estado latente, evitando rearranjos no material de parede, impedindo, dessa forma, a
exposição inadequada dos micro-organismos, promovendo um aumento da vida útil das
microcápsulas (ALBERTINI et al., 2010ALBERTINI, B. et al. Development of microparticulate systems for
intestinal delivery of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis. European
Journal of Pharmaceutical Sciences, v.40, n.4, p.359-366, 2010. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928098710001569>. Acesso
em: 28 jan. 2014. doi: 10.1016/j.ejps.2010.04.011.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
).
Temperaturas próximas a 0°C melhoram os índices de viabilidade celular, pois
temperaturas mais baixas reduzem as taxas de reações químicas que são prejudiciais para
os micro-organismos, tais como oxidação (NAG et al.,
2011NAG, A. et al. Microencapsulation of probiotic bacteria using pH-induced
gelation of sodium caseinate and gellan gum. International Dairy Journal, v.21, n.4,
p.247-253, 2011. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958694610002505>. Acesso
em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/j.idairyj.2010.11.002.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
).
Sobrevivência dos probióticos às condições gastrointestinais simuladas
Um dos principais problemas dos probióticos é a baixa taxa de sobrevivência destes em pH
gástrico e altas concentrações de sais biliares no intestino (SABIKHI et al., 2010SABIKHI, L. et al. Resistance of microencapsulated Lactobacillus
acidophilus LA1 to processing treatments and simulated gut conditions. Food and
Bioprocess Technology, v.3, n.4, p.586-593, 2010. Disponível em:
<http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs11947-008-0135-1>. Acesso em: 27
jan. 2014. doi: 10.1007/s11947-008-0135-1.
http://link.springer.com/article/10.1007...
), o que pode ser verificado na figura 1, em que B. animalis e L.
acidophilus livres não resistiram às condições gastrointestinais simuladas,
não havendo contagem de ambos após 120 e 240 minutos de incubação, respectivamente.
PÁEZ et al. (2012PÁEZ, R. et al. Effect of heat treatment and spray drying on
lactobacilli viability and resistance to simulated gastrointestinal digestion. Food
Research International, v.48, n.2, p.748-754, 2012. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996912002104>. Acesso
em: 28 jan. 2014. doi: 10.1016/j.foodres.2012.06.018.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
) e RANADHEERA et al. (2012RANADHEERA, C.S. et al. In vitro analysis of gastrointestinal tolerance
and intestinal cell adhesion of probiotics in goat's milk ice cream and yogurt. Food
Research International, v.49, n.2, p.619-625, 2012. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996912003663>. Acesso
em: 27 jan. 2014. doi: 10.1016/j.foodres.2012.09.007.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
) obtiveram resultados semelhantes.
: Sobrevivência dos micro-organismos B. animalis (BA) e L. acidophilus (LA) livres e encapsulados às condições gastrointestinais simuladas.
O mesmo resultado não foi verificado nos micro-organismos B. animalis
e L. acidophilus encapsulados, figura 1, os quais, após 360
minutos de incubação, possuíam 9,86 e 9,03log UFC.g-1,
respectivamente, demonstrando que a microencapsulação protege os micro-organismos das
condições gastrointestinais simuladas. A baixa contagem após 30 minutos de incubação e
crescimento posterior deve-se à utilização de acetato ftalato de celulose como material
de parede, o qual é gastrorresistente, ou seja, somente dissolve-se em pH acima de 6,0,
retardando a liberação dos micro-organismos probióticos. A liberação será sempre no
intestino e não no estômago, promovendo proteção aos micro-organismos probióticos
durante o trânsito gastrointestinal (HEIDEBACH et al.,
2012HEIDEBACH, T. et al. Microencapsulation of probiotic cells for food
applications. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, v.52, n.4, p.291-311,
2012. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22332594>. Acesso em:
06 jan. 2014. doi: 10.1080/10408398.2010.499801.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22332...
). Estudos de GEBARA et al. (2013GEBARA, C. et al. Viability of Lactobacillus acidophilus La5 in
pectin-whey protein microparticles during exposure to simulated gastrointestinal
conditions. Food Research International, v.51, n.2, p.872-878, 2013. Disponível em:
<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996913001014>. Acesso
em: 06 jan. 2014. doi: 10.1016/j.foodres.2013.02.008.
http://www.sciencedirect.com/science/art...
),
confirmam o aumento da resistência de probióticos microencapsulados quando expostos às
condições gastrointestinais simuladas, comparando com a sobrevivência de células
livres.
Análise morfológica das microcápsulas
As imagens capturadas através de microscopia eletrônica de varredura, figura 2, demonstraram a forma esférica das microcápsulas, com superfície contínua relativamente lisa, sem fissuras ou poros pronunciados, o que facilita o escoamento e a dispersão do material. Microcápsulas semelhantes foram encontradas por FÁVARO-TRINDADE & GROSSO (2002).
: Imagens do microscópio eletrônico de varredura para microcápsulas de B. animalis (A, 2000x) e L. acidophilus (B, 2000x).
CONCLUSÃO
O presente estudo mostrou que a microencapsulação de B. animalis ou L. acidophilus por spray drying produziu microcápsulas esféricas e sem fissuras, que foram eficientes na proteção dos micro-organismos contra condições gastrointestinais simuladas. Além disso, podem ser armazenados, com melhores resultados, a 4ºC por 120 dias.
- ALBERTINI, B. et al. Development of microparticulate systems for intestinal delivery of Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium lactis. European Journal of Pharmaceutical Sciences, v.40, n.4, p.359-366, 2010. Disponível em: <http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0928098710001569>. Acesso em: 28 jan. 2014. doi: 10.1016/j.ejps.2010.04.011.
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Datas de Publicação
-
Publicação nesta coleção
14 Abr 2015 -
Data do Fascículo
Jul 2015
Histórico
-
Recebido
11 Fev 2014 -
Aceito
14 Out 2014