Indução e desenvolvimento de calos e embriões somáticos em mamoeiro

Papaya callus and somatic embryo induction and development

INDUÇÃO E DESENVOLVIMENTO DE CALOS E EMBRIÕES SOMÁTICOS EM MAMOEIRO

Eliane Pires de Almeida¹; Roberto Pedroso de Oliveira²*; Jorge Luis Loyola Dantas³

¹Escola de Agronomia da Universidade Federal da Bahia, C.P. 82 - CEP: 44380-000 - Cruz das Almas, BA.

²Embrapa Clima Temperado, C.P. 403 - CEP: 96001-970 - Pelotas, RS.

³Embrapa Mandioca e Fruticultura, C.P. 7 - CEP: 44380-000 - Cruz das Almas, BA.

*Autor correspondente <[e-mail]>

RESUMO: Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo para a indução e desenvolvimento de calos e embriões somáticos em mamoeiro (Carica papaya L. cv. Tainung n.1). Foram utilizados quatro tipos de explantes (hipocótilo com folhas cotiledonares, hipocótilo, folhas cotiledonares e epicótilo) e duas condições de cultivo (escuro e 16 horas de luz). A indução e o desenvolvimento de calos foram avaliados nos meios de cultura ½MS2, ½MS10 e HMH e a indução e o desenvolvimento de embriões somáticos nos meios ½MS e HMH1. O cultivo de explantes de hipocótilo com folhas cotiledonares em meio de cultura ½MS10, por 20 dias, sob condições de escuro, foi o mais adequado para a indução (100%) e o crescimento de calos friáveis embriogênicos. O cultivo desses calos em meio ½MS, por duas subculturas de 30 dias, sob condições de escuro, foi o mais adequado para a indução (60%) e o desenvolvimento de embriões somáticos. O tipo de explante, meios de cultura e condições de cultivo foram definidos para a embriogênese somática em mamoeiro.

Palavras-chave:Carica papaya L. cv. Tainung n.1, embriogênese somática, epicótilo, hipocótilo com folhas cotiledonares, 2,4-D

PAPAYA CALLUS AND SOMATIC EMBRYO INDUCTION AND DEVELOPMENT

ABSTRACT: In order to establish a protocol for induction and development of callus and somatic embryos of papaya (Carica papaya L. cv. Tainung n.1) four explant types (hypocotyl with cotiledonary leaves, hypocotyl, cotiledonary leaves and epycotyl) and two light conditions (dark and 16 h photoperiod) were used. Callus induction and development were evaluated in ½MS2, ½MS10 and HMH media, and somatic embryo induction and development in ½MS and HMH1 media. In vitro culture of hypocotyl with cotiledonary leaves in ½MS10 medium, under dark condition for 20 days, was suitable for induction (100%) and growth of embryogenic friable callus. The culture of these callus in ½MS medium, under dark condition for two subcultures of 30 days, was suitable for induction (60%) and development of papaya somatic embryos. The explant type, culture media and culture conditions were defined for papaya somatic embryogenesis.

Key words:Carica papaya L. cv. Tainung n.1, epycotyl, somatic embryogenesis, hypocotyl with cotiledonary leaves, 2,4-D

INTRODUÇÃO

O mamoeiro (Carica papaya L.) é uma das fruteiras mais cultivadas e consumidas nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, sendo o Brasil o maior produtor com 1,65 milhões de toneladas (FAO, 1996). Os cultivares de mamoeiro mais utilizadas no país são a Sunrise Solo, Improved Sunrise Solo line 72/12 e o híbrido Tainung n.1. As sementes desse híbrido são importadas de Taiwan.

Nas últimas duas décadas, diversas técnicas de biotecnologia têm sido empregadas em apoio a programas de melhoramento do mamoeiro, tais como o resgate de embriões, cultura de anteras, isolamento e cultivo de protoplastos, produção de sementes artificiais, micropropagação, marcadores moleculares e transformação genética (Oliveira et al., 1996).

O estabelecimento de protocolos para a embriogênese somática do mamoeiro é importante por permitir a multiplicação massal de plantas hermafroditas, diminuindo a importação de sementes híbridas que apresentam preço elevado no mercado internacional. Ademais, existe uma demanda não satisfeita de protocolos para a indução de embriões somáticos e regeneração in vitro de mamoeiros geneticamente transformados.

Em vários cultivares, embriões somáticos de mamoeiro já foram induzidos a partir de explantes de pecíolos, caules, folhas, raízes e embriões zigóticos (Chen et al., 1987; Fitch & Manshardt, 1990; Yang & Ye, 1992; Fitch, 1993; Khatoom & Sultana, 1994; Mondal et al., 1994). Além da composição dos meios nutritivos e das condições de cultura, diversos fatores como o sexo, clone, idade da planta, época de coleta dos explantes e tipo de explante influenciam no desenvolvimnto in vitro dos explantes de mamoeiro (Litz & Conover, 1981; Oliveira et al., 1996). Por isso, uma das grandes limitações da cultura de tecidos consiste na necessidade de um exato ajuste no balanço de nutrientes, reguladores de crescimento e condições de cultura em função de cada cultivar e do estado fisiológico das plantas (Arora & Singh, 1978).

Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo para a indução e desenvolvimento de calos e embriões somáticos de mamoeiro (Carica papaya L. cv. Tainung n.1).

MATERIAL E MÉTODOS

Os explantes iniciais do mamoeiro ' Tainung n.1' foram obtidos de plântulas oriundas de germinação in vitro. Para a germinação foram utilizados três frutos hermafroditas provenientes de plantas do Banco de Germoplasma de Mamão da Embrapa Mandioca e Fruticultura. A desinfestação dos frutos foi realizada em solução de álcool 70% por dois minutos, solução comercial de hipoclorito de sódio com 2% de cloro ativo por 15 minutos, sendo, em seguida, lavados com água destilada esterilizada por três vezes. Os integumentos externo e interno das sementes foram removidos sob condições assépticas e as sementes cultivadas em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) suplementado com 500 mg L^-1 de extrato de malte, com pH 5,7. A germinação ocorreu em sala de crescimento, no escuro, à temperatura de 25 ± 2°C.

Para a indução de calos foram utilizados os explantes: a) hipocótilo com folhas cotiledonares totalmente expandidas com 15 mm de comprimento; b) folhas cotiledonares sem a nervura central; c) epicótilo (3 mm); d) secção de hipocótilo (5 mm), coletados, em média, 20 dias após a semeadura. Os explantes foram introduzidos individualmente em frascos (3,5 cm x 7,5 cm) contendo 15 mL dos seguintes meios de cultura: a) ½MS suplementado com 2 mg L^-1 2,4-D (ácido diclorofenoxiacético), 60 g L^-1 sacarose, 50 mg L^-1 meso-inositol, 2 mg L^-1 glicina, 0,5 mg L^-1 ácido nicotínico, 0,5 mg L^-1 piridoxina, 0,4 mg L^-1 tiamina, 400 mg L^-1 glutamina, 10 g L^-1 agar, pH 5,7 (½MS2); b) ½MS suplementado com 10 mg L^-1 2,4-D, 60 g L^-1 sacarose, 50 mg L^-1 myo-inositol, 2 mg L^-1 glicina, 0,5 mg L^-1 ácido nicotínico, 0,5 mg L^-1 piridoxina, 0,4 mg L^-1 tiamina, 400 mg L^-1 glutamina, 10 g L^-1 agar, pH 5,7 (½MS10); c) meio HMH (Alloufa, 1993) suplementado com 41 g L^-1 sacarose, 0,18 mg L^-1 AIA (ácido indol acético), 0,20 mg L^-1 AIB (ácido indol butírico), 0,19 mg L^-1 ANA (ácido naftaleno acético), 0,22 mg L^-1 2,4-D, 0,21 mg L^-1 cinetina e 0,23 mg L^-1 BAP (benzilaminopurina), pH 6,5 (HMH). Utilizou-se dois fotoperíodos: a) no escuro; b) 16 horas de luz (1500 lux), ambos com temperatura de 25 ± 2°C. O experimento foi inteiramente casualizado, contendo 24 tratamentos com 10 repetições cada um, constituindo um fatorial 4x3x2 (quatro tipos de explante, três meios de cultura e duas condições de cultivo). Foram realizadas avaliações visuais da indução e crescimento dos calos e das taxas de contaminação e oxidação a cada cinco dias por 30 dias.

Para a obtenção de embriões somáticos, metade dos calos induzidos em cada meio de cultura foi transferida para meio ½MS sem reguladores de crescimento (½MS) e a outra metade para HMH com 0,2 mg L^-1 ANA e 2,0 mg L^-1 cinetina (HMH1), cultivados nas condições já mencionadas por dois subcultivos de 30 dias. Foram realizadas avaliações mensais de indução e desenvolvimento dos embriões.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A formação de calos iniciou-se de três a cinco dias após a cultura in vitro dos explantes, sendo atingido o maior nível de crescimento aos 20 dias. Em geral, os calos apresentaram coloração amarelo-pálida. Em função dos tratamentos utilizados, houve formação de calos friáveis que se mostraram altamente embriogênicos e de não friáveis que não formaram embriões. Resultados semelhantes foram obtidos por Oliveira et al. (1998) com o cultivar de mamoeiro Baixinho de Santa Amália.

Independentemente do meio de cultura e do fotoperíodo, foi obtida maior porcentagem de indução de calos utilizando os explantes hipocótilo com folhas cotiledonares (96,7%) e hipocótilo (95%) e de calos friáveis com os explantes hipocótilo (63%) e epicótilo (58,3%) (TABELA 1). Diferenças somente ocorreram na indução de calos. Oliveira et al. (1998) obtiveram diferenças significativas no comportamento in vitro dos explantes com a cv. Baixinho de Santa Amália, tendo o hipocótilo com folhas cotiledonares apresentado o melhor desempenho para a indução de calos. Os explantes folha cotiledonar e epicótilo apresentaram porcentagem elevada de oxidação (23,3%) ao contrário dos demais explantes (TABELA 1).

Independentemente do tipo de explante e do fotoperíodo, houve maior porcentagem de formação de calos (78%) no meio de cultura ½MS2 (TABELA 2) e de calos friáveis (71%) no meio ½MS10 (TABELA 3), não havendo, no entanto, diferenças estatísticas em relação aos outros meios. No meio HMH, Alloufa (1993) obteve indução de calos embriogênicos superior a 60%, porém utilizando embriões zigóticos como explante inicial.

Independentemente do tipo de explante e do meio de cultura, ocorreu maior indução de calos (76%) e de calos friáveis (59%), respectivamente sob 16 horas de luz e no escuro, porém sem haver diferenças estatísticas ao nível de 5% (TABELAS 2 e 3). No entanto, os calos mantidos no escuro apresentaram maior crescimento, confirmando os resultados de Winnaar (1987).

A análise das combinações explante/meio de cultura/fotoperíodo permitiu observar que em vários casos ocorreu 100% de indução de calos (TABELA 2). No entanto, quando foi analisada a porcentagem de calos friáveis houve 100% de indução apenas nas combinações hipocótilo com folhas cotiledonares em meio ½MS10 sob luz e no escuro, hipocótilo em meio ½MS2 sob escuro e hipocótilo em meio ½MS10 sob luz (TABELA 3). Esses resultados bem como os obtidos por Oliveira et al. (1998) demonstram que para cada explante e condição de cultura existe um melhor meio para induzir a formação de calos friáveis.

A indução de embriões somáticos ocorreu por meio de um processo de embriogênese indireta, tendo ocorrido a partir de calos dos explantes hipocótilo com folhas cotiledonares, folha cotiledonar e epicótilo no escuro. Essa potencialidade de indução de embriões somáticos a partir de diferentes tecidos de mamoeiro já havia sido descrita por Chen et al. (1987), Fitch & Manshardt (1990), Yang & Ye (1992), Fitch (1993), Khatoom & Sultana (1994) e Mondal et al. (1994).

Houve uma grande variação na indução de embriões somáticos em diferentes combinações de explante, meio de cultura e fotoperíodo (TABELA 4). Essas variações de respostas in vitro demonstram que para cada explante existe uma melhor combinação de meio de cultura e fotoperíodo para a obtenção de embriões somáticos. A porcentagem máxima de indução de embriões somáticos obtida (60%) foi superior a relatada por Fitch (1993) em meio ½MS com 2,4-D (45%) e idêntica a de Oliveira et al. (1998) obtida com o explante hipocótilo com folhas cotiledonares sob escuro em meio ½MS. Em outras três combinações houve indução de embriões somáticos, sempre sob condições de escuro. O meio de cultura ½MS mostrou-se o mais adequado para a indução de embriões somáticos.

A diferenciação dos embriões somáticos ocorreu na superfície dos calos. Ao longo de dois subcultivos de 30 dias houve formação de zero a 15 embriões somáticos por calo, inicialmente globulares, passando, em seguida, para as formas cordiforme, torpedo e cotiledonar. Num mesmo calo embriogênico pôde-se observar embriões em estágios distintos. Os embriões cotiledonares formaram pequenas plântulas (<2 mm). Fitch (1993) obteve resultados semelhantes, ou seja, em três semanas, formaram-se dois a 20 embriões somáticos de calos originados a partir de hipocótilos dos cultivares Kapoho, Sunset, Sunrise e Waimanalo. A maioria das plântulas regeneradas apresentavam fenótipo normal, porém foram comuns os casos de alterações na morfologia das folhas e no caule das plântulas, que se apresentava mais largo e com freqüente produção de calos na base. Esses variantes somaclonais ocorreram tanto em plantas regeneradas a partir de calos obtidos dos explantes epicótilo e epicótilo com folhas cotiledonares quanto de folhas, onde são relatados maiores índices de variação.

CONCLUSÕES

• O cultivo in vitro do explante hipocótilo com folhas cotiledonares em meio de cultura ½MS10, por 20 dias, sob condições de escuro, é recomendado para a indução e crescimento de calos friáveis embriogênicos de mamoeiro cv. Tainung n.1.

• O cultivo de calos em meio ½MS, por duas subculturas de 30 dias, sob condições de escuro, é recomendado para a indução e desenvolvimento de embriões somáticos de mamoeiro cv. Tainung n.1.

Recebido em 27.06.00

• ALLOUFA, M.A.I. Effect of some growth regulators on embryo culture of Carica papaya L. in vitro Revista Brasileira de Fruticultura, v.15, p.27-32, 1993.
• ARORA, I.K.; SINGH, R.N. Growth hormones and in vitro callus formation of papaya. Scientia Horticulturae, v.8, p.357-361, 1978.
• CHEN, M.H.; WANG, P.J.; MAEDA, E. Somatic embryogenesis and plant regeneration in Carica papaya L. tissue culture derived from root explants. Plant Cell Report, v.6, p.348-351, 1987.
• FAO QUARTERLY BULLETINS OF STATISTICS. Rome, v.9, n.3/4, 1996. 144p.
• FITCH, M.M.M. High frequency somatic embryogenesis and plant regeneration from papaya hypocotyl callus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v.32, p.205-212, 1993.
• FITCH, M.M.M.; MANSHARDT, R.M. Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature zygotic embryos of papaya (Carica papaya L.). Plant Cell Report, v.9, p.320-324, 1990.
• KHATOOM, K.; SULTANA, R. Plant regeneration from Carica papaya cv. Malir grown in tissue culture. Pakistan Journal of Botany, v.26, p.191-195, 1994.
• LITZ, R.E.; CONOVER, R.A. Effect of sex type, season and other factors on in vitro establishment and culture of Carica papaya L. explants. Journal of the American Society for Horticultural Science, v.106, p.792-794, 1981.
• MONDAL, M.; GUPTA, S.; MUKHERJEE, B.B. Callus culture and plantlet production in Carica papaya (var. Honey Dew). Plant Cell Reports, v.13, p.390-393, 1994.
• MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, v.15, p.437-497, 1962.
• OLIVEIRA, R.P.; ALMEIDA, E.P.; DANTAS, J.L.L.; NICKEL, O. Papaya somatic embryogenic protocol (Carica papaya L. cv. Baixinho de Santa Amália). In: LATIN-AMERICAN MEETING ON PLANT BIOTECHNOLOGY, 3., Havana, 1998. Abstracts. Havana, 1998. p.123.
• OLIVEIRA, R.P.; DANTAS, J.L.L.; ALMEIDA, E.P.; NICKEL, O.; VILARINHOS, A.D.; MORALES, C.F.G. Uso da biotecnologia no melhoramento genético e propagaçăo do mamoeiro. In: MENDES, L.G.; DANTAS, J.L.L.; MORALES, C.F.G. Mamăo no Brasil Cruz das Almas: EAUFBA; EMBRAPA, CNPMF, 1996. 179p.
• WINNAAR, W. First plants from papaw callus. Information Bulletin of Citrus and Subtropical Fruits Research Institute, n.177, p.1-2, 1987.
• YAMAMOTO, H.; TABATA, M. Correlation of papaya and enzyme production with laticifer formation in somatic embryos of papaya. Plant Cell Report, v.8, p.251-254, 1989.
• YANG, J.S.; YE, C.A. Plant regeneration from petioles of in vitro regenerated (Carica papaya L.) shoots. Botanical Bulletin of Academia Sinica, v.33, p.375-381, 1992.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Fev 2001
• Data do Fascículo
  Mar 2001

Histórico

• Recebido
  27 Jun 2000