Índice funcional do ciático nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos. Avaliação da reprodutibilidade do método entre examinadores

Resumos

The interpersonal reproducibility of the method for evaluating the Sciatic Functional Index (SFI) was measured by a computer-based program developed for this purpose. Twenty Wistar rats were used, and their right sciatic nerve was addressed using general anesthesia. Those nerves were subsequently smashed in a segment of 5 mm proximal to its trifurcation with a special device, with a fixed load of 5 kg for 10 minutes. Animals’ footprints were taken at preoperative phase and then in a weekly basis, from the 1st to the 8th week, in a gait track. Prints were digitalized, stored and assessed by predetermined parameter measures, by four examiners, always following the same sequence of parameters marking. Results were submitted to statistical analysis, which evidenced the existence of a high correlation among examiners at preoperative evaluation and on the 3rd, 4th, 5th, 7th, and 8th weeks (equal or higher than 0.82), with an eventual drop on 6th week, but still as significant as the others (pF<0.01). On the 1st and 2nd weeks, the correlation index was nearly zero, showing the low reproducibility of the method in that period, in which variation among animals did not differ from the variation among examiners (p=0.24 and 0.32, respectively), due to the poor sharpness of footprints.

Regeneration; Sciatic Nerve; Rats; Evaluation

ARTIGO ORIGINAL

Índice funcional do ciático nas lesões por esmagamento do nervo ciático de ratos. Avaliação da reprodutibilidade do método entre examinadores

Vanessa Vilela Monte-Raso^I; Cláudio Henrique Barbieri^II; Nilton Mazzer^III

^IFisioterapeuta, aluna do Curso de Doutorado do Programa de Pós-graduação Ortopedia, Traumatologia e Reabilitação

^IIProfessor titular (orientador)

^IIIProfessor associado (co-orientador)

^{Endereço para correspondencia}

RESUMO

Foi avaliada a reprodutibilidade inter-pessoal do método de avaliação do Índice Funcional do Ciático (IFC), medido por um programa de computação desenvolvido para este fim. Foram empregados 20 ratos Wistar, cujo nervo ciático direito era abordado sob anestesia geral e esmagado num segmento de 5 mm proximal à sua trifurcação com um dispositivo especial, com carga fixa de 5 Kg por 10 minutos. Impressões das pegadas dos animais foram obtidas na fase pré-operatória e, depois, semanalmente, da 1ª à 8ª semana, em uma pista de marcha. As impressões eram digitalizadas, armazenadas e avaliadas, pela medida de parâmetros predeterminados, por quatro examinadores, seguindo sempre a mesma seqüência de marcação dos parâmetros. Os resultados foram submetidos a análise estatística, que mostrou haver um alto índice de correlação entre examinadores na avaliação pré-operatória e nas 3a, 4a, 5a, 7a e 8a semanas (igual ou maior que 0,82), com queda casual na 6a semana, mas manteve significante como as demais (pF<0,01). Na 1a e 2a semanas, o índice de correlação foi próximo de zero, mostrando a pouca reprodutibilidade do método nesse período, em que a variabilidade entre os animais não diferiu da variabilidade entre os examinadores (p=0,24 e 0,32, respectivamente), devido à pouca definição das impressões das pegadas.

Descritores: Regeneração; Nervo ciático; Ratos; Avaliação.

INTRODUÇÃO

Em condições experimentais, a recuperação das lesões nervosas periféricas é estudada principalmente através de técnicas de eletrofisiologia, histologia e morfometria. Embora os parâmetros eletrofisiológicos e morfológicos sejam úteis, é importante conhecer o grau de recuperação funcional que eles implicam. A avaliação funcional de humanos é relativamente fácil, mas de animais é praticamente impossível com os mesmos métodos, o que motivou a busca por métodos específicos em condições experimentais.

Gutmann e Gutmann⁽¹⁾ demonstraram que a perda da capacidade de espalhar os dedos da pata traseira é um parâmetro confiável para avaliar o grau de lesão, bem como para seguir sua recuperação. Seu método, todavia, era muito rudimentar e não permitia quantificar nem uma coisa, nem outra. DeMedinaceli et al.^(2,3) desenvolveram um método quantitativo, confiável e reprodutível da condição funcional do nervo ciático de ratos, para a avaliação do grau de lesão e da recuperação, denominado de Índice Funcional do Ciático, e que foi posteriormente modificado por outros autores^(4,5).

Um programa de computador (software) foi desenvolvido em nosso laboratório^*, possibilitando a captura (digitalização com um scanner), armazenamento e análise das imagens das pegadas dos ratos, realizando os cálculos segundo as fórmulas matemáticas propostas e fornecendo os resultados dos índices funcionais de DeMedinaceli et al.^(2,3), de Carlton e Goldberg⁽⁴⁾ e de Bain et al.⁽⁵⁾. Este programa foi testado em diversas investigações em nosso grupo^(6,7,8,9), sempre demonstrando estreita correlação entre as alterações morfológicas e morfométricas do nervo ciático e as medidas do IFC, de modo que a perda funcional resultante das lesões produzidas no nervo ciático de rato pode ser monitorizada pelo IFC.

Entretanto, em todas as investigações ficou patente que a marcação dos parâmetros predeterminados nas impressões das pegadas nem sempre é fácil, as dificuldades sendo maiores nas impressões obtidas nas primeiras semanas após a lesão, diminuindo progressivamente à medida que ocorria a recuperação funcional. De modo geral, as impressões obtidas na primeira e na segunda semana mal permitiam definir a pegada, sendo praticamente impossível fazer a marcação dos parâmetros, fato responsável por grande variação nos valores iniciais do SFI, a ponto de lançar dúvida sobre sua confiabilidade nesse período. Foi o objetivo da presente investigação, então, avaliar a reprodutibilidade do método, utilizando vários avaliadores e um novo programa de computador, aperfeiçoado do anteriormente utilizado, procurando estabelecer a correlação interpessoal dos resultados.

MATERIAL E MÉTODO

Foram utilizados 20 ratos machos adultos da linhagem Wistar, com peso corporal variando entre 200 e 300 gramas (média: 250 g), obtidos de um único fornecedor e mantidos em gaiolas coletivas com cinco animais cada, com dieta à base de ração padronizada e água ad libitum. Antes de qualquer outro procedimento, os animais eram treinados a caminhar na passarela de marcha construída para esse fim conforme modelo de DeMedinaceli e colaboradores (Figura 1) e, tão logo tivessem aprendido, era obtida a impressão pré-operatória da pegada para cálculo do Índice Funcional do Ciático (IFC) normal.

Procedimento cirúrgico

Os ratos foram anestesiados com uma associação de medicamentos anestésicos (Ketamina 5%, Xilasina 2%, proporção 1:4, 0,13 ml/100 g de peso corporal). O nervo ciático era abordado através de uma incisão cutânea longitudinal retilínea de 3 cm de comprimento na face lateral da coxa, indo desde o trocânter maior até o joelho. Uma vez exposto, o nervo era submetido a uma lesão por esmagamento, circunscrita a um segmento de 5 mm de comprimento proximal à sua trifurcação, utilizando-se para isso uma pinça especialmente confeccionada para este fim, calibrada para uma carga estática de 5.000 g. Em seguida, o nervo era cuidadosamente destacado da pinça e reposto em seu leito original, a ferida cirúrgica sendo fechada por planos com pontos isolados de nylon de calibre 5/0 (Mononylon, Ethicon^®).

Obtenção e análise das impressões das pegadas

As impressões das pegadas das patas traseiras foram obtidas em tiras de papel embebidas com uma solução de azul de bromofenol em acetona a 1% e deixadas secar, de acordo com o método proposto por DeMedinaceli e colaboradores e modificado por Lowdon et al.⁽¹⁰⁾. O papel impregnado com o azul de bromofenol torna-se amarelo depois de seco, mas volta imediata e permanentemente ao azul quando em contato com a água ou qualquer solução aquosa. Ao invés de água, neste trabalho as patas traseiras dos animais foram imersas em detergente doméstico comum, o que impede a dispersão da impressão. Os animais, então, caminhavam sobre as tiras de papel impregnadas colocadas na passarela e deixavam, em média, três pegadas de cada pata. As tiras contendo as pegadas eram deixadas secar e copiadas em um scanner de alta resolução, e as imagens assim digitalizadas eram armazenadas e analisadas no computador, com o programa já mencionado⁽⁶⁾. Os dados referentes a cada animal eram identificados individualmente, de modo a permitir o seguimento ao longo do tempo. Os parâmetros medidos nas impressões tanto das patas normais (N) como das operadas (E) eram o comprimento da pegada (PL, de print length, ou distância longitudinal entre a ponta do dedo mais longo e o calcanhar), a abertura total dos dedos (TS, de toe spread, ou distância transversal entre o primeiro e o quinto dedos) e a abertura dos dedos intermediários (IT, de intermediate toes, ou distância transversal entre o segundo e o quarto dedos). Com a utilização do programa específico de computador (Figura 2), os pontos-chave de cada parâmetro eram simplesmente clicados com o mouse na tela do monitor, numa seqüência previamente estabelecida, e o IFC era automaticamente calculado, incluindo a geração de um gráfico com a curva de regeneração em função do tempo. A fórmula usada nos cálculos do IFC foi a proposta por Bain et al.⁽⁵⁾, como se segue:

As pegadas foram obtidas e analisadas semanalmente, da primeira à oitava semanas pós-operatórias, primeiramente por um examinador experiente com o método e, depois, por três examinadores a quem o método foi minuciosamente ensinado. Cada examinador fazia três avaliações de cada pegada em dias diferentes, extraindo daí um valor médio que era tomado para os cálculos posteriores e para a análise estatística.

Análise estatística

Para a análise estatística dos dados utilizou-se o modelo de efeitos aleatórios⁽¹¹⁾; primeiramente, procurou-se validar o método de avaliação, comparando-se a variação dos valores obtidos entre os ratos, para cada um dos examinadores, com a variação observada para cada rato dentre os examinadores, por meio do teste F com o nível de significância menor que 1% (p<0,01), em cada semana do período total de observação de oito semanas (nove avaliações, incluindo a pré-operatória). Se os valores de um mesmo rato fossem homogêneos para os quatro examinadores, então o método foi considerado eficiente para avaliar a recuperação da lesão. Para complementar esse estudo, calculou-se o coeficiente de correlação intra-classe, o qual mede a intensidade de reprodução de resultados homogêneos; quanto mais próximo da unidade, mais eficiente é o método.

RESULTADOS

Generalidades

Os animais toleraram bem a anestesia e o procedimento cirúrgico. De início, os animais não se apoiavam sobre a pata operada, apresentando o pé caído e os dedos em completa adução, como resultado da grave disfunção do nervo ciático. Eles gradualmente recuperaram a capacidade de fazer apoio sobre o membro operado e espalhar os dedos.

Análise Funcional da Marcha (IFC)

Foram avaliadas 180 (9 x 20) impressões de pegadas, totalizando 720 (4 x 180) avaliações. Na avaliação pré-operatória, o valor médio do IFC medido pelos quatro examinadores nos 20 animais foi de -5,72 (variação: -6,84 a -3,45). As diferenças entre os examinadores não foram significantes no período pré-operatório porém, as medidas correlacionaram entre si, de maneira altamente significativa (P_F<0,01) e o coeficiente de correlação intra-classes (r) foi de 0,84, indicando alta reprodutibilidade do método para os animais intactos (Tabela 1).

Na primeira semana pós-operatória, o valor médio do IFC foi de -78,88 (variação: -93,91 a -61,55), passando a -77,9 (variação: -96,22 a -62,9) na segunda, -33,72 (variação: -35,47 a -31,89) na terceira, -25,5 (variação: -26,68 a -24,88) na quarta, -21,86 (variação: -22,4 a -21,22) na quinta, -19,79 (variação: -22,8 a -19,19) na sexta, -13,7 (variação: -14,36 a -13,09) na sétima, e -11,46 (variação: -11,86 a -10,94) na oitava.

As diferenças entre os valores medidos pelos examinadores individualmente foram significantes na primeira e na segunda semanas pós operatória, e as medidas não correlacionaram entre si (P_F=0,24 e P_F=0,32, respectivamente), mas não mais em nenhuma das semanas subseqüentes (<0,01) (Tabela 1).

O coeficiente de correlação intra-classes foi de 0,06 e 0,04 nas duas primeiras semanas, demonstrando muito baixa correlação entre os valores medidos pelos examinadores. Já nas semanas subseqüentes variou de 0,74 a 0,89, demonstrando maior homogeneidade entre as medidas (Figura 3).

DISCUSSÃO

A regeneração de nervos periféricos observada em estudos experimentais apresenta aspectos controversos, porque nem sempre é possível estabelecer uma correlação clara entre os resultados obtidos por diferentes métodos numa mesma investigação, nem entre os resultados obtidos por um mesmo método empregado em investigações diferentes ou conduzidas por autores diferentes. A maioria dos estudos sobre a regeneração dos nervos periféricos emprega métodos histo-morfométricos e eletrofisiológicos, os quais, embora essenciais, não adiantam nenhuma informação sobre a recuperação funcional correspondente, o que seria do maior interesse. Avaliações funcionais são muito difíceis em animais, por motivos óbvios, mas De Medinaceli et al.^(2,3), introduziram o método do IFC de ratos, modificado por outros autores^(4,5) que permite avaliar satisfatoriamente a recuperação do nervo ciático lesado em função do tempo. Estudos anteriormente conduzidos pelo nosso grupo mostraram haver clara correlação entre a regeneração morfológica, avaliada pela morfometria dos nervos, e a recuperação funcional, medida pelo IFC ^(6,7,8,9,12).

Apesar dos empecilhos, o método do IFC parece ser ainda o mais versátil, pois é de fácil aplicação e de custo baixo em relação a outros métodos propostos, prováveis motivos de sua mais ampla aplicação. Brown et al.⁽¹³⁾, realizaram um estudo da confiabilidade do método do IFC, em que quatro examinadores analisaram as medidas em seqüências diferentes e em três ocasiões diferentes, concluindo que se trata de um bom método não invasivo. Basso et al.⁽¹⁴⁾, desenvolveram uma escala de avaliação qualitativa (BBB) para avaliar a recuperação após lesão medular; os animais portadores dessas lesões eram deixados livres para caminhar em uma arena, alguns parâmetros sendo utilizados para a qualificação do grau de lesão e da recuperação dos movimentos, mas não se trata de um método quantitativo, como o IFC. Entretanto, já foi demonstrada alta correlação entre o método do IFC e o BBB⁽¹⁵⁾. Varejão et al.⁽¹⁶⁾, desenvolveram um método cinemático quantitativo de avaliação da regeneração nervosa, baseado na medida de um ângulo do pé do animal (TOA, de toe-out-angle), usando como pontos de referência o calcâneo e o quinto e o terceiro dedos, conforme avaliados através de análises computadorizadas. Segundo os autores, este método teve boa correlação com o IFC, mas é de difícil aplicação. Bervar⁽¹⁷⁾ comparou um método de avaliação por vídeo-análise com o IFC e também encontrou correlação positiva entre ambos, concluindo, todavia, que o método de vídeo-análise oferece a vantagem de disponibilizar imagens digitalizadas.

Apesar da confiabilidade do método do IFC, em todos os nossos trabalhos anteriores ficou patente a dificuldade de avaliação nas primeiras semanas após a produção da lesão do nervo ciático, porque as impressões das pegadas eram invariavelmente de má qualidade, visto que a paralisia imposta ao membro do animal impedia a pisada bem marcada. Com a regeneração subseqüente do nervo e a recuperação funcional do animal, as pegadas tornavam-se mais claras, permitindo a marcação mais adequada dos pontos-chave das pegadas. As dificuldades observadas, então, nas semanas iniciais após a produção da lesão lançaram dúvidas sobre a fidelidade do método nessa fase, motivo da presente investigação.

A metodologia empregada aqui seguiu a mesma linha dos trabalhos anteriores, com o modelo da lesão por esmagamento do nervo ciático, que apresenta a vantagem de preservar pelo menos em parte o arcabouço do nervo e não requerer treinamento específico nem técnicas e materiais de reparo, como no caso da secção seguida de sutura^{(2,3,6,7,8,9)}. A lesão por esmagamento foi produzida em todos os animais com um pinça especialmente confeccionada para esse fim, calibrada regularmente com uma célula de carga; assim, sua aplicação era controlada e a lesão produzida, mais homogênea, semelhante ao que já havia sido obtido nos nossos trabalhos anteriores, com o uso de uma máquina universal de ensaio, e bem diferente dos métodos descritos por outros autores, com pinças hemostáticas ou de relojoeiro⁽¹⁸⁾. Além disso, as lesões foram produzidas sempre pelo mesmo autor (VVMR), que foi também o primeiro examinador, por ser o mais experiente com o método. Dos outros três examinadores, um já dominava o método, mas os dois restantes não, apesar de terem ampla vivência com o uso de computadores. Para esses, o método foi exaustivamente explicado e a rotina do exame foi demonstrada várias vezes, até que se sentissem seguros para realizá-lo. Além disso, os exames por eles realizados foram observados pelo mais experiente, sem interferência deste, nem mesmo quando um deles incidiu em erro que alterou a média de suas medidas, na sexta semana, causando queda no índice de correlação interexaminadores.

Dentro do rigor da investigação, os resultados obtidos foram altamente confiáveis e confirmaram a suspeita de que a má qualidade das pegadas das duas primeiras semanas praticamente tornava impossível uma avaliação adequada. Tal fato foi evidenciado pela ausência de correlação intra-classe nessa fase, com índices próximo de zero (0,06 e 0,04), muito abaixo dos que se observaram a partir da terceira semana (acima de 0,82). No período pré-operatório, bem como a partir da terceira semana pós-operatória, com a melhor qualidade das pegadas, as avaliações tornaram-se mais fáceis e os valores das medidas, mais homogêneos. Também, a variabilidade entre ratos não diferiu da variabilidade entre examinadores nas duas primeiras semanas (p=0,24 e 0,32, respectivamente).

CONCLUSÃO

Os autores concluem que o método de avaliação funcional experimental pelo Índice Funcional do Ciático, em ratos, é plenamente reprodutível e confiável quando aplicado após a segunda semana da produção de uma lesão por esmagamento do nervo.

Agradecimentos

Agradeçemos ao engenheiro Alexandre Yamazita, ao veterinário Giuliano Barbieri, aos meus alunos do curso de fisioterapia da UNIFENAS Ana Paula Ribeiro e Francis Trombini, e ao estatístico Prof. Luiz de Souza, pela valiosa colaboração nas diferentes fases do desenvolvimento do trabalho. Também, ao Prof. José Batista Volpon e aos funcionários do Laboratório de Bioengenharia da FMRP-USP de Ribeirão Preto, onde foi realizada esta pesquisa, e à CAPES, pela concessão de bolsa de doutorado.

Trabalho recebido em: 01/08/05 aprovado em 03/02/06

Trabalho realizado no Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  31 Ago 2006
• Data do Fascículo
  2006

Histórico

• Aceito
  03 Fev 2006
• Recebido
  01 Ago 2005