Influência da via de inoculação sobre o estabelecimento e a evolução da leptospirose em hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorovar pomona

The influence of the route of inoculation on the development of the leptospiral infection in hamsters (Mesocricetus auratus) experimentally infected with Leptospira interrogans serovar pomona

Influência da via de inoculação sobre o estabelecimento e a evolução da leptospirose em hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorovar pomona

The influence of the route of inoculation on the development of the leptospiral infection in hamsters (Mesocricetus auratus) experimentally infected with Leptospira interrogans serovar pomona

Nicodemos Alves de Macedo^I; Zenáide Maria de Morais^II; Cláudio Roberto de Almeida Camargo^III; Clebert José Alves^IV; Sérgio Santos de Azevedo^II; Rodolfo Nümberger Júnior^V; Sílvio Arruda Vasconcellos^II

^ICentro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí, Teresina - PI

^IIDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo - SP

^IIIInstituto Butantã da Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo, São Paulo - SP

^IVDepartamento de Medicina Veterinária do Centro de Saúde e Tecnologia Rural da Universidade Federal de Campina Grande, Campina Grande - PB

^VDepartamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo - SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Foi investigada a influência da via de inoculação sobre o estabelecimento e a evolução da leptospirose em hamsters (Mesocricetus auratus) experimentalmente infectados com Leptospira interrogans sorovar pomona. As vias de inoculação ensaiadas foram: intraperitoneal, subcutânea, oral, conjuntival e escarificação cutânea. O inóculo infeccioso foi constituído por uma cultura em meio de Fletcher, com 20 a 30 leptospiras por campo microscópio no aumento de 200 vezes. Os animais controle foram inoculados apenas com meio de Fletcher. Foram colhidas amostras de soro sanguíneo e fragmentos de rins na fase agônica da doença ou no 21º dia pós-infecção, quando todos os animais foram sacrificados. Para a pesquisa de leptospiras, foi feito o exame direto com microscopia óptica em campo escuro e cultivo em meio de Fletcher, pela técnica das diluições seriadas. A detecção de aglutininas anti-leptospiras foi realizada pela técnica de soroaglutinação microscópica. A instalação e evolução da leptospirose foram afetadas pela via de inoculação. A via oral foi a menos efetiva em estabelecer a infecção. Não foi observada associação estatística entre a freqüência de portadores e a via de inoculação.

Palavras-chave: Via de inoculação. Hamsters. Sorovar pomona.

ABSTRACT

The influence of the route of inoculation on the development of the leptospiral infection was investigated in 60 hamsters (Mesocricetus auratos) experimentally infected with Leptospira interrogans serovar pomona. The routes of inoculation were intraperitoneal, subcutaneous, oral, conjuntival and scrapped skin. All animals received the leptospiral inoculum cultivated in Fletcher's medium, with 20 to 30 leptospires per field under 200x magnification. The controls were inoculated only with Fletcher's medium. Samples of blood sera and the kidney fragments were collected in the agonic stage of the disease or at 21^st experimental day, when all survivors were killed. The antibodies detection was done by the microscopic agglutination test and the bacteria detection by the dark field microscopic examination and culture in Fletcher's medium, by the tenfold dilutions technique. The presence and development of disease was affected by the route of infection. The oral route was the less effective for promoting the disease. There was no association between the frequency of carrier state and the route of infection.

Key-words: Rout of inoculation. Hamsters. Serovar pomona.

Introdução

O hamster (Mesocricetus auratus) tem sido a espécie de eleição para o estudo da etiopatogenia da leptospirose.^1,2 Infecções experimentais nestes animais foram efetuadas com diversos sorovares de Leptospira spp: canicola³, hardjo^4,5,6, icterohaemorrhagiae⁷, pomona^8,9,10,11,12, szwajizak⁵ e grippotyphosa e autumnalis.¹² As vias utilizadas para a aplicação do inóculo infeccioso também foram distintas: intraperitoneal^{3,4,5,8,9,10,11,12}, nasal e ocular¹³, subcutânea⁶, conjuntival, intracraneana e oral¹⁴ e escarificação cutânea.⁷ Os quadros obtidos nestas investigações variaram com a estirpe de leptospira e a via de inoculação adotada, tendo sido registrados casos de doença letal altamente aguda com mortes entre o quarto e o quinto dia pós-infecção, e outros crônicos caracterizados por nefrite intersticial.

A despeito do grande número de investigações já realizadas, nenhuma atentou para a análise comparativa do comportamento de um mesmo inóculo infeccioso aplicado simultaneamente por diferentes vias em grupos homogêneos de uma mesma espécie animal.

Do ponto de vista de modelo biológico experimental para estudos de etiopatogenia e epidemiologia da leptospirose, seria de grande valia a reprodução em condições controladas das modalidades de fontes de infecção apresentadas nos casos de infecção natural (doentes, portadores convalescentes e portadores sadios)¹⁵. O esclarecimento destas indagações poderá ser obtido a partir da análise da resposta de uma espécie de hospedeiro a um mesmo inóculo infeccioso aplicado por vias distintas.

Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a possível influência da via de inoculação sobre o estabelecimento e evolução da leptospirose em hamsters jovens machos, infectados com uma estirpe virulenta do sorovar pomona.

Materiais e Métodos

Foram utilizados 60 hamsters (Mesocricetus auratus) criados em biotério convencional, com peso corpóreo entre 80 e 100 gramas, machos, com estado geral de saúde aparentemente bom, mantidos em gaiolas individuais forradas com maravalha autoclavada e alimentados com ração comercial ad libitum e água da rede pública.

O inóculo infeccioso foi constituído por uma cultura pura de Leptospira interrogans sorovar pomona, tipificada pela prova de adsorção de aglutininas, obtida a partir de macerado de rim de hamster, previamente inoculado pela via intraperitoneal, com 0,5 mL de cultura de referência e sacrificado no quinto dia pós-infecção. A diluição de trabalho foi a que apresentava de 20 a 30 leptospiras por campo microscópio no aumento de 200 vezes.

O experimento foi conduzido em dez repetições, de modo que em cada etapa um mesmo inóculo infeccioso foi aplicado nas cinco vias ensaiadas: intraperitoneal, subcutânea, escarificação cutânea, oral e conjuntival, sendo um hamster para cada via. Os animais inoculados pela via conjuntival receberam 0,3 mL do inóculo infeccioso, sendo 0,15 mL em cada olho. Para as demais vias, o volume de inóculo infeccioso foi sempre de 0,5 mL. No caso dos animais que foram inoculados por escarificação cutânea, 0,25 mL do inóculo infeccioso foi depositado na face interna dos membros posteriores. Para cada grupo experimental, houve sempre um animal testemunha, no qual o inóculo infeccioso foi substituído pelo placebo (meio de Fletcher), pela via intraperitoneal.

Durante 21 dias pós-infecção, todos os animais foram observados diariamente, duas vezes ao dia. Os animais que vieram a apresentar sintomas clínicos durante esse período foram sacrificados em fase agônica, necropsiados e examinados macroscopicamente. Foram colhidos fragmentos de rim dos quais foram preparadas suspensões a 10% (peso-volume), para a pesquisa direta de leptospiras à microscopia óptica em campo escuro. A seguir, no caso de resultado negativo, foi realizada a cultura em meio de Fletcher, pela técnica das diluições seriadas.¹⁶ Por ocasião da necrópsia, a partir do coágulo existente no interior do coração, foi obtida uma amostra de soro sangüíneo destinada à pesquisa de aglutininas anti-leptospiras. No 21º dia da inoculação experimental, todos os animais sobreviventes foram sacrificados e submetidos aos procedimentos anteriormente citados. Para a pesquisa de aglutininas séricas anti-leptospiras, utilizou-se a técnica de soroaglutinação microscópica, conforme descrito por Galton et al..¹⁷

Na análise estatística dos resultados, as variáveis qualitativas foram submetidas aos testes de Cochran ou binomial, para amostras relacionadas, e as variáveis quantitativas (tempo de observação) foram submetidas à prova de Friedman¹⁸. O nível de significância adotado foi de 0,05.

Resultados

A tabela 1 apresenta os informes clínicos e laboratoriais segundo as 60 unidades e os dez grupos experimentais utilizados. Salienta-se o comportamento dos animais inoculados pela via intraperitoneal, em que todos morreram entre o 5º e o 9º dias pós-inoculação, com confirmação clínica e laboratorial da doença. Destaque-se também a ausência de qualquer sintoma clínico e a negatividade dos exames post morten nos animais inoculados com placebo (grupo controle), pela via intraperitoneal. Constatou-se que, entre os 40 hamsters inoculados experimentalmente com leptospiras, por outras vias que não a intraperitoneal, todos os 25 que vieram a óbito durante os 21 dias de observação tiveram a confirmação da doença pelos sintomas clínicos e exame post morten. Os sintomas mais freqüentes foram: apatia, prostração, adinamia, anorexia, desidratação e hemorragias. As lesões macroscópicas predominantes foram hemorragias e icterícia. Especial destaque deve ser dado ao quadro de panoftalmia purulenta unilateral no animal de número 51 (inoculado pela via conjuntival).

Na tabela 2 é apresentada a freqüência de óbito, segundo a via de inoculação e o grupo experimental. Observou-se que os extremos de efetividade na instalação da doença de 3/10 e 10/10 estão respectivamente associados às vias oral e intraperitoneal. Dentre os 10 grupos experimentais ensaiados, o número cinco apresentou um comportamento bastante peculiar com a ocorrência de apenas um óbito por leptospirose, para o animal inoculado pela via intraperitoneal (animal número 25). A análise estatística, segundo o teste de Cochran, não revelou diferenças significativas, no entanto, a análise pareada das combinações de vias (duas a duas), através do teste binomial, só conferiu significado estatístico para os valores observados nas vias intraperitoneal e oral.

A tabela 3 apresenta as freqüências de sobreviventes no 21º dia pós-inoculação, segundo a via de inoculação e o grupo experimental. Houve variação na confirmação da infecção, segundo a via de inoculação. Enquanto para as vias intraperitoneal, subcutânea e escarificação cutânea existiu 100% de confirmação da infecção (isolamento da bactéria ou conversão sorológica), para a via conjuntival, este valor foi de apenas 80%, e para a oral, de 40%. Constata-se, ainda, na tabela 3, que cinco animais caracterizaram-se como portadores sadios (um no grupo 01, três no grupo 05 e um no grupo 09). O estudo da freqüência de portadores, segundo a via de inoculação, pelo teste de Cochran, não revelou a existência de associação estatística. Salienta-se ainda que, dentre estes cinco animais caracterizados como portadores, houve quatro não reatores na pesquisa de aglutininas anti-leptospiras.

Discussão

A confirmação clínica e laboratorial da leptospirose em todos os 25 animais que morreram de infecção, excluídos os inoculados pela via intraperitoneal, durante o período de observação, permite a avaliação comparativa da influência da via de inoculação sobre a instalação e evolução da doença.

Do ponto de vista da instalação da infecção, a via menos eficaz foi a oral. Apenas 40% dos infectados por esta via tiveram a infecção confirmada. Stavitsky¹⁴, obteve resultado semelhante em hamsters inoculados com o sorotipo icterohaemorrhagiae e Burnstein e Baker¹⁹, referiram o mesmo quando da inoculação oral do sorotipo pomona em suínos.

A ocorrência de 80% de animais infectados dentre os inoculados pela via conjuntival, quando comparados com os 100% obtidos pelas vias intraperitoneal, subcutânea e escarificação cutânea, pode ser interpretada como conseqüência dos mecanismos inespecíficos de defesa existentes nesta porta de entrada.

No que se refere à freqüência de óbitos por leptospirose, dentre os inoculados, segundo as diferentes vias, observou-se significância estatística apenas para as vias intraperitoneal (10/10) e oral (3/10). Estes resultados concordam com os obtidos por Abdu e Sleight⁸, Andreani⁴, Badiola, J., Thiermann e Cheville⁵, Kronhaus, Barriola e Savari⁹, Miller e Wilson¹⁰, Sanger et al.¹¹, Sapp et al.³, e, no relativo à via intraperitoneal, e com Stavitsky¹⁵, quanto à via oral. A constatação de valores variando entre 70 e 80% para as demais vias sugere a existência de mecanismos inespecíficos de defesa na conjuntiva ocular, pele e tecido subcutâneo, mais eficazes do que os mecanismos existentes no peritôneo.

Todos os animais que sucumbiram por leptospirose durante o período de observação apresentaram um quadro de evolução aguda. A variação na duração do tempo de observação após a infecção é outro indicador da existência de diferentes tipos de interação estabelecidos entre o agente e o hospedeiro: para as vias intraperitoneal e subcutânea, foram obtidos valores médios 40% a 50% menores que os verificados para as outras vias. As bactérias devem ter encontrado maior dificuldade para ganhar a circulação sangüínea ou linfática quando da instalação através daquelas vias.

Conclusões

A instalação e evolução da leptospirose em hamsters foram influenciadas pela via de inoculação. A via oral foi a menos efetiva em estabelecer a infecção. Não foi possível estabelecer relação entre a condição de portador e a via de inoculação.

Recebido para publicação: 02/12/2003

Aprovado para publicação: 25/03/2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Ago 2005
• Data do Fascículo
  Jun 2004

Histórico

• Aceito
  25 Mar 2004
• Recebido
  02 Dez 2003