Validação de metodologia espectrofotométrica para quantificação dos flavonóides de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel

Validation of spectrophotometric methodology for quantify flavonoid content in Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel

TRABALHOS ORIGINAIS

Validação de metodologia espectrofotométrica para quantificação dos flavonóides de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel

Validation of spectrophotometric methodology for quantify flavonoid content in Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel

Tadeu José da Silva Peixoto Sobrinho^I; Carlos Henrique Tabosa Pereira da Silva^I; João Eudes do Nascimento^I; Júlio Marcelino Monteiro^II; Ulysses Paulino de Albuquerque^II; Elba Lúcia Cavalcanti de Amorim^I,*

^ILaboratório de Produtos Naturais, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco

^IILaboratório de Etnobotânica Aplicada, Departamento de Biologia, Área de Botânica, Universidade Federal Rural de Pernambuco

RESUMO

Os laboratórios de fitoterápicos necessitam de metodologias que assegurem o controle de qualidade de seus produtos quando os mesmos não constam em farmacopéias ou monografias oficiais. Baseando-se neste fato, o presente estudo visou validar uma metodologia analítica para quantificação de flavonóides contidos nos extratos da pata-de-vaca (Bauhinia cheilantha [Bongard] Steudel), através de espectrofotometria no visível, como equivalentes de Rutina (µg/mL). Todos os parâmetros exigidos pela ANVISA foram avaliados. No teste de especificidade, observou-se a existência de pico máximo a 420 nm. O método foi considerado linear e com alta sensibilidade de quantificação (2,51 µg/mL). O método também mostrou-se robusto e com elevada recuperação (98,36%). Os resultados obtidos para repetibilidade (intra-corrida), precisão intermediária (inter-corridas) e reprodutibilidade certificaram a precisão do método com valores entre 0,31 e 3,58%, sendo também considerado exato (95,71-105,50%). Com este estudo, o método proposto foi considerado específico, preciso, reprodutível, exato, de baixo custo e fácil execução.

Unitermos: Espectrofotometria/validação de método. Rutina/uso. Bauhinia Cheilautha/farmacognosia. Flavonóides/quantificação. Fitoterápicos/controle de qualidade

ABSTRACT

Phytotherapeutic laboratories require access to methodologies that guarantee quality control for their products when these items are not already registered in pharmacopeias or official monographs. As such, the present study sought to validate analytical methodologies for quantifying natural flavonoids contained in extracts of "pata-de-vaca" (Bauhinia cheilantha [Bong.] Steudel) using visible light spectrophotometry and a rutin standard (µg/ml). All of the parameters required by ANVISA were evaluated. The specificity test revealed a maximum absorption peak at 420 nm. The methodology was considered linear and of high quantification sensitivity (2.51 µg/ml). The methodology also proved to be robust, and had high recovery levels (98.36%). The results obtained for repeatability, intermediate precision (intra- and inter-day), and reproducibility all certified the precision of the method, with values between 0.31 and 3.58%; the methodology was also considered exact (95.71-105.50%). This study demonstrated that the proposed methodology can be considered specific, precise, reproducible, exact, of low cost, and easy to perform.

Uniterms: Spectrophotometry/method's validation. Rutin/use. Bauhinia cheilautha/pharmacognosia. Flavonoids/quantification. Phytotherapics/quality control

INTRODUÇÃO

O gênero Bauhinia (Caesalpiniaceae) possui aproximadamente 300 espécies e, no Brasil, podemos encontrar cerca de 20% destas em seu território (Haver, 2002; Silva, Cechinel Filho, 2002), muitas presentes na composição de diversos fitoterápicos ou comercializadas em feiras livres (Melo et al., 2004). Apesar de ser bastante empregada na medicina popular (Albuquerque, Andrade, 2002a,b; Albuquerque et al., 2005), o gênero Bauhinia até o momento não faz parte da Farmacopéia Brasileira (Melo et al., 2004).

Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel é uma espécie amplamente usada na medicina tradicional em diversas comunidades rurais, podendo ser encontrada em quintais agroflorestais ou em áreas de mata de caatinga (Albuquerque, Andrade, 2002a). É uma espécie de expressiva importância local sendo usada na produção de remédios tradicionais com ação antiinflamatória, antidiabética, para distúrbios digestivos, reumatismo e sedativa (Albuquerque et al., 2005; Almeida et al., 2005). Todavia, ainda são escassos os estudos que investiguem sua atividade biológica. Por exemplo, o efeito hipoglicemiante da fração butanólica do extrato foliar foi testado em ratos diabéticos induzidos por aloxano (Silva, Cechinel Filho, 2002).

Outras espécies do gênero Bauhinia, por sua vez, já foram os objetivos de diferentes investigações. Argolo et al. (2004) estudando a ação antioxidante das folhas de Bauhinia monandra Kurz., mostrou que os extratos clorofórmico e em acetato de etila, apresentaram excelente atividade, com concentração de inibição IC₅₀ de 2 mg/g de 1,1-difenil-2-picril-hidrazil (DPPH) e porcentagem de inibição IP de 60-65%. Esta atividade foi atribuída aos esteróides e flavonóides presentes nas folhas, indicando potente atividade antioxidante quando comparada ao grupo tratado com catequinas e com outros extratos vegetais.

A ação antidiabética de diferentes frações do extrato foliar de Bauhinia candicans Benth. foi avaliada por Fuentes et al. (2004). O tratamento utilizando doses de 8 mg/kg da fração III (Canferol-3-O-rutinosídeo) reduziu, significativamente, os níveis de glicemia, evidenciando uma atividade mais pronunciada. Estes resultados sugerem que os extratos de B. candicans aumentam o metabolismo da glicose e que podem conter princípios ativos com propriedades hipoglicemiantes.

Durante os últimos anos, diversos fitoterápicos que possuem em sua constituição plantas do gênero Bauhinia, tiveram seu registro indeferido por estar em desacordo com a legislação vigente (Brasil, 2007). Para a regularização de fitoterápicos, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) exige através de sua Resolução da Diretoria Colegiada (R.D.C) nº 48, de 16 de março de 2004 (Brasil, 2004), entre outras recomendações, a validação da metodologia analítica para registro do produto acabado.

A Resolução Específica (R.E.) nº 899, de 29 de maio de 2003, "Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos" (Brasil, 2003) da ANVISA e a norma Q2(R1), "Validation of analytical procedures: text and methodology" do International Conference on Harmonisation - ICH (ICH, 1996), determinam que para validar uma metodologia, faz-se necessário avaliar os seguintes parâmetros: especificidade, linearidade, robustez, limite de detecção (LD), limite de quantificação (LQ), precisão e exatidão. Por tanto, a validação de metodologias analíticas necessita ser específica, robusta, sensível, precisa e exata, constituindo fundamental importância para o controle de qualidade dos produtos e sendo parte das normas de Boas Práticas de Fabricação e Controle (Pimentel, Barros Neto, 1996; Barros Neto et al., 2002).

Em virtude das necessidades normativas no que se refere à regularização de fitoterápicos, o enfoque deste trabalho foi validar uma metodologia por espectrofotometria capaz de quantificar os constituintes flavônicos presentes nas folhas de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel, para que possa ser usada rotineiramente nos laboratórios de controle de qualidade.

MATERIAL E MÉTODOS

Equipamentos

Empregaram-se espectrofotômetro GBC UV/Visível 911A (Melbourne), cubeta de quartzo de 10 mm de caminho óptico (Equilab), placa de aquecimento (Tecnal TE-018) e triturador industrial (Bermar BM30) para validar o método proposto. Em todos os parâmetros foram utilizadas balanças e vidrarias analíticas.

Reagentes e padrão de referência

Os solventes usados para quantificar os flavonóides de B. cheilantha (Bongard) Steudel foram todos de grau analítico: metanol p.a. Cinética Reagentes & Soluções e Dinâmica Reagentes Analíticos, ácido acético glacial p.a. Merck, cloreto de alumínio 99,5% Vetec Química Fina e piridina Vetec Química Fina 99,0%. Como padrão para flavonóides, foi utilizado Rutina (Merck), com grau de pureza de 99,5%.

Amostra vegetal

As folhas de B. cheilantha foram obtidas na Estação Experimental do Instituto Agronômico de Pernambuco - IPA (08º14'18,2"S e 35º54'57,1"), situado no agreste pernambucano, sendo a identificação confirmada pelo Prof. Dr. Ulysses P. de Albuquerque, do Departamento de Biologia da Universidade Federal Rural de Pernambuco e a exsicata foi depositada no Herbário Prof. Vasconcelos Sobrinho do Departamento de Botânica, na Universidade Federal Rural de Pernambuco, sob o nº 49684. Após secagem à temperatura ambiente, as folhas foram pulverizadas em triturador industrial para subseqüente análise dos parâmetros de validação.

Procedimentos Experimentais

O padrão (Rutina) foi preparado em balão volumétrico de 100,0 mL com metanol, obtendo-se concentração final de 0,5 mg/mL. A cada balão foram acrescentados 0,6 mL de ácido acético glacial, 10,0 mL da solução metanólica de piridina 20% e 2,5 mL do reagente cloreto de alumínio em metanol 50,0 mg/L, completando-se o volume com água destilada. Após 30 minutos em temperatura ambiente, foram realizadas as leituras em espectrofotômetro a 420 nm, utilizando-se todos os reagentes anteriores (exceto extrato ou padrão) como solução-branco para zerar o aparelho.

Da amostra vegetal seca e pulverizada, 500,0 mg foram pesados e transferidos para Erlenmeyers de 50,0 mL, sendo adicionados 25,0 mL de metanol e aquecidos sob ebulição branda em placa de aquecimento por 30 minutos. Os extratos foram filtrados em papel de filtro e transferidos quantitativamente para balões volumétricos de 50,0 mL. O resíduo do material foi lavado com 25,0 mL de metanol e novamente filtrado para o balão, tendo o volume completado com metanol. Do extrato, 1,0 mL foi transferido para balão volumétrico de 25,0 mL e, de forma semelhante ao procedimento empregado para a construção da curva com o padrão, foram acrescentados os mesmos reagentes. Após 30 minutos em temperatura ambiente foram realizadas as leituras em espectrofotômetro a 420 nm em cubetas de quartzo.

Parâmetros de validação

O ensaio de especificidade foi conduzido com os extratos metanólicos das amostras foliares de B. cheilantha pulverizadas e Rutina como padrão, ambos à concentração de 18,0 µg/mL, para verificação de possíveis interferentes. Os espectros de absorbância foram realizados na faixa compreendida entre 300-500 nm e forneceram os dados para construção do gráfico de especificidade.

Para a linearidade foi usada a média de três intervalos com repetições autênticas, que contemplavam seis concentrações da solução de Rutina 0,5 mg/mL (6,0, 8,0, 10,0, 12,0, 16,0 e 20,0 µg/mL). Após relação linear visual, os resultados foram analisados estatisticamente para definir o coeficiente de determinação (mínimo aceitável R² = 0.99), a equação de regressão, o ajuste linear e o desvio padrão relativo (Barros Neto et al., 2002; Brasil, 2003).

Os limites de detecção e quantificação foram estimados (em µg/mL) considerando o desvio padrão em razão ao coeficiente angular (inclinação da reta) obtidos pela linearidade, nos quais foram utilizadas as equações 1 e 2 para determinar o limite de detecção e quantificação, respectivamente (Brasil, 2003).

Em que o LD é o limite de detecção; LQ é o limite de quantificação; DPa é o desvio-padrão relativo; IC é a inclinação de curva de calibração.

O parâmetro recuperação foi realizado com três amostras em triplicata e o resultado foi obtido através da equação 3.

CTF compreende a concentração total de flavonóides (padrão Rutina adicionado ao extrato foliar de B. cheilantha), CFE compreende a concentração de flavonóides no extrato foliar e CFP a concentração de flavonóides do padrão Rutina. R (%) é a recuperação obtida(Brasil, 2003).

Os fatores a serem considerados para analisar a robustez foram: tempo de extração (20 e 40 minutos), estabilidade de leitura (20 e 40 minutos) e diferentes fabricantes de solventes (Marca 1 e Marca 2), o que está de acordo com o preconizado pela ANVISA (Brasil, 2003). Os resultados foram avaliados mediante comparação feita através da análise de variância.

Os ensaios de repetibilidade e precisão intermediária foram determinados por seis amostras de mesma concentração (18,0 µg/mL) executados no mesmo dia (intra-corrida) e dois dias consecutivos por analistas diferentes (inter-corrida) (Brasil, 2003). Os resultados foram expressos como desvio-padrão relativo (Equação 4). A reprodutibilidade foi realizada no Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos e compreendeu seis amostras de mesma concentração (18,0 µg/mL). A exatidão foi avaliada por três controles (em triplicata) de concentração baixa (9,0 µg/mL), média (18,0 µg/mL) e alta (27,0 µg/mL). A exatidão (Equação 5) foi calculada, individualmente para cada controle.

Em que o DPR (%) é a precisão; DP é o desvio-padrão; CMD é a concentração média determinada; E (%) é a exatidão; CME é a concentração média experimental; e CT é a concentração teórica.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Especificidade

Na Figura 1, podemos observar o espectro obtido para o extrato de B. cheilantha (18,0 µg/mL) e para a Rutina (18,0 µg/mL), na faixa compreendida entre 300-500 nm, sendo evidenciado apenas um pico de absorção máxima a 420 nm. Com isso, confirmamos que neste comprimento de onda é possível quantificar especificamente o padrão para flavonóide e os contidos no extrato, mesmo na presença de impurezas.

Linearidade e Limites de Detecção (LD) e Quantificação (LQ)

O método espectrofotométrico apresentou linearidade a 420 nm para as concentrações estudadas (6,0-20,0 µg/mL). A equação da regressão linear média obtida a partir de três curvas de calibração, foi y = 0,0256x + 0,0141, em que y é a absorbância (nm) e x a concentração (µg/mL) em equivalentes de Rutina (Figura 2). O coeficiente de determinação obtido foi R² = 0,9994, comprovando a adequação do método ao intervalo avaliado (Brasil, 2003). Os dados de precisão (DPR) e exatidão (E) do intervalo do método são apresentados na Tabela I.

Os valores dos limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) estimados pelas equações 1 e 2, foram 0,75 e 2,51 µg/mL, respectivamente. Com esses resultados, verificamos que o método possui alta sensibilidade para detectar e quantificar o padrão, sem sofrer alteração de fatores intrínsecos do equipamento.

A análise de variância ANOVA (um critério) confirmou que o método proposto foi considerado linear e indica que não há falta de ajuste (p<0,05) (Pimentel, Barros Neto, 2002), como pode ser visto na Tabela II.

Recuperação e Robustez

A recuperação que mede a eficiência do procedimento de extração do método proposto foi 98,36%, atestando este valor como aceitável (Brasil, 2003).

Os fatores da robustez (tempo de extração, estabilidade e diferentes fabricantes de solventes) foram avaliados em triplicata (Brasil, 2003): intrafatores (parâmetro individual) e interfatores (todos os parâmetros conjuntamente). Os resultados receberam tratamento estatístico pela Análise de Variância ANOVA (dois critério) fator duplo e esta análise se encontra na Tabela III.

O método mostrou que não há diferença estatística significativa (p < 0,05), já que encontrou valores de F menores que os valores de F_crítico, demonstrando assim ser um método robusto em todos os fatores analisados.

Precisão e Exatidão

Os dados da repetibilidade (intra-corrida), precisão intermediária (inter-corridas), reprodutibilidade e exatidão do método encontram-se na Tabela IV, cujos valores encontraram-se compreendidos entre 0,44% e 3,58%. Para o ensaio de exatidão foram encontrados resultados entre 95,71-105,50%. A ANVISA regulamenta que os resultados da precisão não podem ultrapassar 5% e, para exatidão, não deve ser inferior a 95% (Brasil, 2003). Estes dados confirmam que o método de quantificação por espectrofotometria proposto encontra-se em conformidade com a legislação vigente e apresenta confiabilidade dos resultados.

CONCLUSÃO

O método proposto apresenta alta especificidade a 420 nm para o extrato foliar de Bauhinia cheilantha (Bongard) Steudel o que confere confiabilidade na quantificação de flavonóides. A linearidade confirma que o método é linear e possui alta sensibilidade de quantificação. É um método robusto para os fatores exigidos pela legislação vigente e encontra-se dentro do limite para a recuperação. Os resultados de precisão e exatidão obtidos atestam confiabilidade necessária para o uso desta metodologia em laboratórios de controle de qualidade. O método de quantificação por espectrofotometria a 420 nm, mostrou-se preciso, exato e reprodutível, aliado à acessibilidade e facilidade de execução.

AGRADECIMENTOS

Os autores gradecem à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo apoio financeiro, ao Instituto Agronômico de Pernambuco (IPA), à Profa. Dra. Miracy M. de Albuquerque do Núcleo de Controle de Qualidade de Medicamentos e Correlatos (NQCMC-UFPE) pelos resultados da especificidade, ao Prof. Dr. Pedro José Rolim Neto do Laboratório de Tecnologia dos Medicamentos (LTM-UFPE) pelas análises de reprodutibilidade.

Recebido para publicação em 23 de outubro de 2007

Aceito para publicação em 30 de julho de 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Jan 2009
• Data do Fascículo
  Dez 2008

Histórico

• Aceito
  30 Jul 2008
• Recebido
  23 Out 2007