Treinamento em natação com baixa intensidade não protege músculo esquelético contra lesões induzidas por exercício exaustivo em ratos

Resumos

While regular aerobic exercise promotes beneficial adaptations to the skeletal muscle, acute exhaustive exercise causes structural damage to the skeletal muscle cells. The aim of this study was to verify whether a low-intensity swimming program protects the skeletal muscles against damage induced by exhaustive exercise. Male Wistar rats (weight: 376.50 4.36g; age: 90 days) were randomly divided into four groups: sedentary control (SC, N=8); sedentary submitted to exhaustive test (SE, N=7); swimming trained (TN, N=7); swimming trained submitted to exhaustive test (TNE, N=7). Animals of TN and TNE groups were submitted to a swimming regimen without overload for 90 min/day, 5 days/wk, during 17 weeks. Forty-eight hours after the last training session, animals from SE and TNE groups were submitted to an exhaustive exercise protocol. At sacrifice, fragments of soleus and rectus femoris muscles were collected and submitted to histological analysis and heat shock protein (HSP70) expression measurement. The results showed that the time until exhaustion was greater in the STE than in SE group (125.0 6.00 vs. 90.0 8.48 min, respectively, P<0.05). The levels of blood lactate during exhaustive exercise were lower in animals from TNE than SE (5.31 ± 0.22 vs. 876 ± 0.59 mmol/L, respectively, P<0.05)The frequency of damaged fibers in the muscles was greater in SE (soleus: 34.86±0.04; rectus femoris: 37.57 ± 0.07) and STE (soleus: 41.57±0.08; rectus femoris: 39.57 ± 0.05), compared to groups SC (soleus: 13.88±0.81; rectus femoris: 16.75 ± 0.79) and ST (soleus: 24.14±0.06; rectus femoris: 24.0 ± 0.05), respectively (P<0.05). There was no significant difference at the HSP70 levels of the analyzed muscles among the four groups (P>0.05). In conclusion, although a low-intensity swimming training increased the animals' performance in the exhaustive exercise test, it did not protect their skeletal muscles against damage induced by exhaustive exercise

HSP70; physical exercise; muscle damage

ARTIGO ORIGINAL

CIÊNCIAS DO EXERCÍCIO E DO ESPORTE

Treinamento em natação com baixa intensidade não protege músculo esquelético contra lesões induzidas por exercício exaustivo em ratos

Edson da Silva^I,II; Izabel Regina dos Santos Costa Maldonado^I; Sérgio Luís Pinto da Matta^I; Giselle Carvalho Maia^I; Luíz Henrique Marchesi Bozi^I; Karina Ana da Silva^III; Cynthia Aparecida Castro^III; Antônio José Natali^III

^IDepartamento de Biologia Geral. Universidade Federal de Viçosa - UFV - Viçosa, Minas Gerais

^IIDepartamento de Ciências Básicas da Saúde. Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri - UFVJM - Diamantina, Minas Gerais

^IIIDepartamento de Educação Física. Universidade Federal de Viçosa - UFV - Viçosa, Minas Gerais

^{Correspondência}

RESUMO

Enquanto o exercício aeróbico regular promove adaptações benéficas ao músculo esquelético, o exercício físico exaustivo induz lesões musculares. O objetivo deste estudo foi verificar se um programa de natação com baixa intensidade é capaz de proteger músculos esqueléticos contra lesões induzidas por exercício exaustivo. Ratos Wistar (peso: 376,50 ± 4,36g; idade: 90 dias) foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: controle sedentário (CS); sedentário submetido a teste de exaustão (SE); treinado em natação (TN); treinado em natação submetido a teste de exaustão (TNE). Animais dos grupos TN e TNE foram submetidos a um programa de natação sem sobrecarga por 90 minutos/dia, cinco dias/semana, durante 17 semanas. Após este período, os grupos SE e TNE foram submetidos a um teste de exaustão em natação. Após eutanásia, fragmentos dos músculos sóleo e reto femoral foram coletados e submetidos à análise histológica e de proteínas de choque térmico (HSP70). Os resultados mostraram que o tempo até a exaustão foi maior no grupo TNE que no SE (125,0 ± 6,0 vs. 90,0 ± 8,5min, respectivamente, P < 0,05). Os níveis de lactato sanguíneo durante o teste e exaustão foram menores no grupo TNE que no SE (5,31 ± 0,22 vs. 8,76 ± 0,59mmol/L, respectivamente, P < 0,05). A frequência de fibras lesadas nos músculos foi maior nos grupos SE (sóleo: 34,86 ± 0,04; reto femoral: 37,57 ± 0,07) e TNE (sóleo: 41,57 ± 0,08; reto femoral: 39,57 ± 0,05), comparada aos grupos CS (sóleo: 13,88 ± 0,81; reto femoral: 16,75 ± 0,79) e TN (sóleo: 24,14 ± 0,06; reto femoral: 24,0 ± 0,05), respectivamente (P < 0,05). Não houve diferença significativa nos níveis de HSP70 dos músculos analisados entre os quatro grupos. Concluimos que apesar do treinamento em natação melhorar o desempenho dos animais no teste de exaustão, não promoveu proteção aos seus músculos esqueléticos contra as lesões induzidas pelo exercício exaustivo.

Palavras-chave: HSP70, exercício físico, dano muscular.

INTRODUÇÃO

O exercício exaustivo pode induzir lesões nas fibras musculares^(1,2). Dentre os fatores propostos como responsáveis pelas lesões estão estresse mecânico, distúrbio na homeostase do cálcio intracelular, alteração do pH e da temperatura corporal, e resposta inflamatória^(3,4). Fatores mecânicos e oxidativos desencadeiam a lesão e alguns mediadores inflamatórios exacerbam esse quadro nos dias subsequentes ao exercício⁽⁵⁾. As fibras lesadas apresentam vacuolização citoplasmática, deslocamento dos núcleos celulares da periferia para o centro da fibra, ocorrência de núcleos picnóticos, necrose segmentar e a invasão de fagócitos^(1,2).

O estresse causado pelo exercício exaustivo pode determinar a morte celular em músculos esqueléticos por dois mecanismos distintos: necrose e apoptose⁽⁶⁾. Na necrose, há um aumento no volume total da célula e das organelas, seguindo-se a autólise, que envolve dissolução de seus subprodutos, os quais estimulam a inflamação exsudativa⁽⁷⁾. No processo de apoptose, há uma variedade de sinais intra e extracelulares que regulam a expressão de genes específicos os quais poderão expressar proteínas que iniciam a apoptose (ex.: Bax, Fas, p53) e proteínas que inibem a apoptose (ex.: Bcl2, Bcl-XL)⁽⁸⁾, assim como proteases proteicas (ex.: caspases)⁽⁹⁾.

Todavia, organismos multicelulares são dotados de um grupo de proteínas altamente conservadas, as chamadas heat shock proteins (HSPs), que auxiliam na manutenção das funções e na sobrevivência das células frente a diferentes tipos de estresse, incluindo alterações de pH e temperatura, e estresse oxidativo⁽¹⁰⁾. As famílias das HSPs com peso molecular de 70kDa (HSP 70) são encontradas no citoplasma e núcleo e compartilham a função de interagir com outras proteínas no curso da sua maturação e mantê-las no citoplasma, estabilizando e/ou prevenindo, desta forma, dobramentos prematuros até sua posterior importação pelas organelas apropriadas⁽¹¹⁾. Há evidências de que a HSP70 pode inibir a morte celular tanto pela via dependente de caspases quanto pela via independente de caspases⁽¹²⁾.

A atividade física moderada regular, em contrapartida, é capaz de aumentar a capacidade de defesa antioxidante do organismo⁽¹³⁾, assim como elevar a expressão de Hsp72, a forma induzível das HSP70^(14,15). Desta forma, o treinamento físico tem sido associado à proteção do organismo contra eventos estressantes^(16-18) e a atenuação de morte celular em músculos cardíaco e esquelético^(19,20). O objetivo deste estudo foi, portanto, verificar se um programa de natação com baixa intensidade é capaz de proteger os músculos esqueléticos contra lesões induzidas por exercício exaustivo.

MÉTODOS

Animais - Foram utilizados ratos (Rattus norvegicus, albinus) Wistar, adultos, com 90 dias de idade. Os animais foram alojados em gaiolas coletivas (quatro animais por gaiola), recebendo água e ração própria ad libitum e mantidos em ambiente com temperatura média de 24ºC e regime de luminosidade de 12 horas de escuridão por 12 horas de claridade.

Os animais foram alocados aleatoriamente em quatro grupos com oito animais cada: controle sedentário (CS); sedentário submetido a teste de exaustão (SE); treinado em natação (TN); treinado em natação e submetido teste de exaustão (TNE). Os grupos SE, TN e TNE perderam um animal cada por motivo de afogamento.

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal elaborados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA), seguem as resoluções específicas (Lei nº 6.638, de 8 de maio de 1979; e Decreto nº 24.645 de 10 de julho de 1934) e foram aprovados pela comissão de ética em experimentação animal da Universidade Federal de Viçosa.

Programa de natação - A natação foi realizada em um tanque de alvenaria (largura: 65cm, comprimento: 75cm, altura: 85cm), a altura da água a 45cm. A temperatura da água foi mantida em 30ºC ± 1ºC. Nadaram simultaneamente oito animais em cada tanque. O programa de treinamento foi adaptado de Bolter e Gordon⁽²¹⁾. As sessões de treinamento começaram com duração de 10 minutos, sendo aumentados 10 minutos a cada dia, chegando aos 90 minutos no nono dia, e mantidas assim até o final do experimento. O programa foi composto de uma sessão diária, cinco dias por semana, com duração de 17 semanas. Os animais nadaram livremente, sem adição de sobrecarga. Este modelo caracteriza-se como exercício aeróbico de baixa intensidade, pois os animais exercitam abaixo do limiar de lactato⁽²²⁾. Os animais do grupo SE foram colocados no tanque de natação por 10 minutos, uma vez por semana, para se familiarizarem com a água.

Teste de exaustão - Quarenta e oito horas após a última sessão de treinamento, os animais dos grupos SE e TNE foram submetidos a um teste exaustivo em natação. Os animais nadaram até a exaustão, suportando um peso de 4% do peso corporal fixo ao corpo⁽²³⁾. A exaustão foi definida como o ponto onde o rato permaneceu 10 segundos sob a superfície da água⁽²⁴⁾ e o tempo até a exaustão foi cronometrado.

Ao realizar o teste de exaustão, amostras de sangue (uma gota) foram coletadas da extremidade da cauda dos animais em três momentos: antes do teste (repouso) e após 15 minutos de esforço. Para evitar diluição com a água, os animais foram rapidamente secados com uma toalha antes da coleta sanguínea. A concentração de lactato foi determinada utilizando-se o analisador automático de lactato sanguíneo Accutrend Check (Accusport, Roche).

Coleta de amostras - Quarenta e oito horas após a última sessão de treinamento, para os grupos CS e TN, e 48 horas após o teste de exaustão, para os grupos SE e TNE, os animais sofreram eutanásia (CO₂). Um músculo de contração lenta (sóleo) e um de contração rápida (reto femoral, porção branca) dos membros direito e esquerdo de cada animal foram removidos e armazenados para análise histológica e de HSP70. Para análise histológica as amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,2-7,4. Para análise de HSP70, as amostras foram envolvidas em papel alumínio, congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a - 80ºC.

Análise morfométrica - Após desidratação, os músculos foram incluídos em hidroxietil metacrilato (Historesin^® Leica) e seccionados com espessura de 4µm em micrótomo rotativo (Reichert-Jung 2045 Multicut, Alemanha). As secções obtidas foram coradas com azul de toluidina-pironina e analisadas em microscópio de luz (Olympus BX-50). A análise morfométrica foi realizada utilizando o programa de análise de imagem (Image Pro Plus, versão 4.5 para Windows 98). Determinou-se a frequência de fibras lesadas, sendo que para cada parâmetro foram capturadas 10 imagens de cada animal, utilizando-se o programa SPOT, versão 3.5.9, e objetiva com aumento de 20x e zoom de 1,25x.

Análise de HSP70 - As amostras foram retiradas do freezer e, depois de pesadas, foram maceradas para obtenção de um extrato tecidual ao qual foi adicionado o respectivo tampão (composição: 15mM Tris HCL; 600mM de NaCl; 1mM PMSF, pH 7,5). Em 60mg de extrato foram adicionados 1.200µl de tampão de extração (relação de 1:20). Em seguida, colocaram-se as amostras em Eppendorfs, as quais foram identificadas e mantidas em gelo por aproximadamente cinco minutos. Após este período de incubação, os restos celulares foram descartados por centrifugação a 14.000g, a 4ºC, durante 20 minutos e o sobrenadante foi armazenado a -20º C. Os extratos de proteínas totais foram quantificados de acordo com o método de Bradford⁽²⁵⁾, utilizando-se as três réplicas preconizadas.

Eletroforese em géis de poliacrilamida (PAGE) contendo detergente dodecil sulfato sódio (SDS) foi realizada essencialmente como descrita por Laemmli⁽²⁶⁾. O extrato de proteína foi incubado por cinco minutos, a 100ºC, em tampão da amostra [glicerol 10% (v/v), SDS 2,3%, azul de bromofenol 0,25%, 2-mercaptoetanol 5% (v/v) e Tris-HCl 0,0625mol/L, pH 6,8] antes de ser aplicado no gel. A eletroforese foi conduzida por aproximadamente 16 horas, a 48V, no tampão de corrida (Tris-HCl 0,025mol/L, glicina 0,2mol/L, EDTA 1mmol/L e SDS 3,5mmol/L). Este procedimento foi realizado para obtenção de três géis. Um destes foi corado com solução corante [metanol 40% (v/v), CH₃COOH 7,5% (v/v) e coomassie brilhant blue R-250 0,01%], por aproximadamente 12 horas, e descorado em solução descorante [metanol 10% (v/v) e ácido acético 7,5% (v/v)]. Os outros dois géis foram submetidos à técnica de imunoblotting, para verificar se o anticorpo Monoclonal Anti-Heat Shock Protein 70 contra HSP70 de ratos era capaz de reconhecer a proteína de interesse.

As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, usando-se o sistema de transferência da Biorad (EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Após a transferência (em aproximadamente uma hora a 0,70 amperes constantes), a membrana de nitrocelulose foi imersa em solução de bloqueio (caseína - Non-fat Dry Milk, Biorad) por uma hora. Em seguida, foram feitas quatro lavagens, por 15 minutos cada, à temperatura ambiente, com TBS-T [Tris-HCl 0,01mol/L, NaCl 1,5mmol/L, Tween-20 0,1% (v/v), pH 7,6]. A membrana foi incubada com o anticorpo Monoclonal Anti-Heat Shock Protein 70 (Sigma), em uma diluição 1:5.000 por três horas sob agitação. Após o período de incubação, a membrana foi lavada com TBS-T quatro vezes, por 15 minutos cada e, em seguida, incubada com o anticorpo Anti-Mouse IgG (fosfatase alcalina - Sigma), em uma diluição de 1:10.000, por aproximadamente duas horas. A membrana foi lavada extensivamente com TBS-T, novamente por quatro vezes de 15 minutos cada e, subsequentemente, incubada com tampão da enzima (Tris-HCl 0,1mol/L, pH 9,8, NaCl 0,1mol/L, MgCl₂ 0,5mol/L) por 10 minutos. A atividade da fosfatase alcalina foi detectada, usando-se os substratos NBT (azul-nitro-tetrazolium, Gibco/Brl) e BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, Gibco/Brl). As bandas dos imunoblottings foram quantificadas por meio de densitometria computadorizada utilizando-se o Personal Densitometer equipado com o programa Image Quant, versão 5.2 (Molecular Dinamics - EUA).

Análise estatística - As médias referentes aos valores das variáveis foram comparadas entre os grupos por meio de análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de Duncan. Foi utilizado o software Statistica for Windows 3.11, sendo o nível de significância de até 5% (P < 0,05).

RESULTADOS

Os resultados mostraram que os animais treinados permaneceram exercitando por um tempo maior até a exaustão que os animais sedentários (tabela 1). A concentração de lactato sanguíneo não foi diferente entre os animais sedentários e treinados em repouso, mas aos 15 minutos a dos animais treinados foi menor que a dos sedentários. Salienta-se que durante os experimentos morreram três ratos, sendo um de cada grupo (SE, TN e TNE).

Os músculos analisados dos animais do grupo CS apresentaram predominância de fibras com morfologia preservada, de aspecto poligonal em corte transversal, envolvidas pelo endomísio e organizadas em fascículos envolvidos pelo perimísio (figura 1A, figura 2A). Nos outros grupos, todavia, as lesões podem ser visualizadas nas figuras 1 e 2 B, C, e D.

A frequência de lesões nos músculos sóleo e reto femoral dos animais dos grupos controles (CS e TN) não foram estatisticamente diferentes (tabela 2). Entretanto, a frequência de fibras lesadas após o teste de exaustão no grupo SE foi estatisticamente maior em relação à do grupo CS em ambos os músculos analisados. Da mesma forma, no grupo TNE a frequência de lesões foi maior que no grupo TN. Houve presença rara de infiltrados inflamatórios, mas a frequência não foi diferente entre os grupos.

A figura 3 mostra o acúmulo de HSP70 nos músculos sóleo e reto femoral. Os animais dos grupos SE e TNE apresentaram tendência (P = 0,09) de maior acúmulo de HSP70 (sóleo:12,52 e 17,66%; reto femoral: 23,45 e 19,26%, respectivamente), comparados aos seus controles (CS e TN, respectivamente), porém as diferenças não atingiram significância estatística.

DISCUSSÃO

Este estudo investigou se um programa de treinamento em natação com baixa intensidade, abaixo do limiar de lactato, é capaz de proteger os músculos esqueléticos contra lesões induzidas por exercício exaustivo em ratos. Observamos que o programa de treinamento aplicado melhorou a performance dos animais, mas não promoveu proteção aos músculos esqueléticos estudados contra as lesões induzidas pelo exercício exaustivo.

Nós demonstramos que o programa de natação aplicado foi eficiente para causar adaptações ao organismo dos animais, pois os animais treinados nadaram por mais tempo até a exaustão, se comparados aos sedentários. Além disso, estes animais realizaram o esforço com menor acúmulo de lactato em relação aos controles sedentários⁽²⁷⁾. Estes dados indicam que os animais dos grupos TN e TNE estavam treinados.

Após o teste de exaustão, porém, os músculos analisados apresentaram lesões em resposta ao esforço realizado. As principais lesões evidenciadas neste estudo foram: vacuolização citoplasmática, leves reações inflamatórias intersticiais e ocorrência de núcleos volumosos e deslocados para a posição central da fibra⁽²⁾. Estes resultados mostram que o teste de exaustão foi suficiente para causar lesões musculares.

Nos animais sedentários, tanto no sóleo - músculo de características oxidativas - como na porção branca do reto femoral - músculo de características glicolíticas -, a frequência de fibras lesadas foi maior nos animais submetidos à exaustão do que nos controles (sóleo: 151%; reto femoral: 126%). Durante o exercício físico intenso há um aumento de 10 a 20 vezes no consumo total de oxigênio do organismo e um aumento de 100 a 200 vezes na captação de oxigênio pelo tecido muscular⁽¹⁾. Esse tipo de exercício pode ativar diferentes vias de formação de espécies reativas de oxigênio e também desencadear lesões musculares como aquelas observadas neste estudo⁽³⁾.

Nos animais treinados, da mesma forma, a frequência de fibras lesadas foi maior nos animais submetidos à exaustão (TNE) do que nos controles, grupo TN (sóleo: 64,00%; reto femoral: 155,00%). Estes dados mostram que as adaptações ao treinamento não protegeram os músculos contra as lesões induzidas pelo exercício exaustivo. Uma das adaptações ao treinamento físico que poderia exercer a função de proteção é o aumento da expressão de HSP70, pela sua função antiapoptótica⁽¹⁹⁾. O aumento de HSP no músculo esquelético após exercício é capaz de restaurar a homeostase, promover a remodelação celular e fornecer proteção contra os repetidos insultos celulares ocorridos durante a atividade física⁽²⁸⁾.

Nossos dados mostram que os níveis de HSP70, apesar de mais altos nos animais treinados que nos controles após o teste de exaustão, não foram estatisticamente diferentes. A Hsp72 é expressa exclusivamente por eventos de estresse⁽¹¹⁾, sendo altamente induzida pelo exercício físico em músculo esquelético e cardíaco⁽¹⁶⁾, enquanto a Hsp73 é constitutiva⁽²⁹⁾. Assim, os valores mais altos de HSP70 encontrados nos animais treinados, quando comparados aos dos animais controle (CS), embora não estatisticamente diferentes, refletem a indução da expressão de Hsp72 nos músculos analisados (figura 3).

Em concordância com os resultados do presente estudo, Smolka et al.⁽⁴⁾, reportaram que o exercício até a exaustão não resultou na indução de HSP70 ou diminuição da atividade de enzimas antioxidantes em ratos treinados. Segundo os autores, a exaustão foi menos estressante para os ratos treinados devido à elevada atividade de enzimas antioxidantes preexistentes no músculo sóleo desses animais. É possível que espécies reativas de oxigênio ataquem proteínas musculares dos ratos sedentários e sinalizem para a indução da expressão de HSP70 após a exaustão. Por outro lado, se o sistema enzimático antioxidante preexistente é suficiente para evitar ou minimizar o ataque das espécies reativas de oxigênio, a indução da expressão de HSP 70 pode não ser iniciada ou ser levemente iniciada.

Outra possibilidade é que a intensidade do treinamento aplicado no presente estudo não tenha sido suficiente para aumentar a expressão de HSP70 nos músculos esqueléticos destes animais. Os mecanismos responsáveis pela indução da síntese da HSP70, em resposta ao exercício crônico, envolvem várias alterações fisiológicas e fatores tais como elevação da temperatura interna e muscular, aumento da concentração de lactato, aumento da ação de catecolaminas, diminuição do pH, glicogênio e ATP, aumento de radicais livres e alterações no cálcio citosólico. Tais alterações poderiam, isoladas ou conjuntamente, explicar o consequente aumento das HSP70. Todavia, estes fatores estão presentes de forma diferenciada, se considerarmos o volume, a intensidade e o grau de estresse provocado pelo modelo de exercício^(14,29). Alguns estudos têm creditado os altos níveis de expressão de HSP70 em resposta ao exercício à intensidade do mesmo^(14,30).

Em conclusão, apesar de o programa de natação com baixa intensidade aumentar a performance dos animais no teste de exaustão, não promoveu proteção aos músculos esqueléticos estudados contra as lesões induzidas pelo exercício exaustivo.

AGRADECIMENTOS

Projeto financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG-CBB 1851/05). A.J. Natali é bolsista de produtividade do CNPq.

Todos os autores declararam não haver qualquer potencial conflito de interesses referente a este artigo.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011