Desenvolvimento de lesões de cárie em dentina em um modelo de biofilme simplificado in vitro: um estudo piloto

Development of dentin caries lesions in an in vitro simplified biofilm model: a pilot study

Resumo

Introdução

Modelos laboratoriais de biofilmes vêm sendo desenvolvidos com a finalidade de simular o ambiente bucal e o processo de formação da cárie dental.

Objetivo

Estabelecer e padronizar um modelo de biofilme in vitro para o desenvolvimento de lesões de cárie em dentina.

Material e método

Doze discos padronizados de dentina bovina foram divididos em três tempos experimentais: 4, 7 e 10 dias. As amostras de cada tempo experimental foram inoculadas com Streptococcus mutans UA 159 em meio de cultura BHI com 1% de sacarose e cultivadas em anaerobiose. As variáveis de resposta foram a perda de dureza integrada (ΔS) dos discos de dentina e dureza do substrato em diferentes profundidades. Os dados de ΔS foram analisados através de ANOVA seguido do teste Tukey, ambos com significância de 5%, e os dados de dureza de profundidade de lesão analisados descritivamente.

Resultado

Houve maior perda mineral aos 10 dias de crescimento microbiológico quando comparados aos 4 dias (p = 0,034), no entanto não houve diferença entre 7 e 10 dias (p = 0,853). O grupo de 4 dias mostrou perda de dureza em regiões mais superficiais (10-40µm); e o grupo de 10 dias mostrou desmineralização em áreas mais profundas, até 150 µm.

Conclusão

O modelo proposto mostrou-se capaz de desenvolver lesões de cárie artificiais em dentina. Em 7 dias, as lesões subsuperficiais de dentina foram adequadas para estudos de des-remineralização.

Descritores:
Placa dentária; cárie dentária; desmineralização; dentina

Abstract

Introduction

Oral laboratory biofilm models have been developed to reproduce the oral environment and the process of caries lesion formation in vitro.

Objective

To establish and standardize an in vitro biofilm model for the development of caries lesions in dentin.

Material and method

Twelve standardized bovine dentin discs were assigned into three experimental times: 4, 7, and 10 days. Samples of each experimental period were inoculated with Streptococcus mutans UA 159 in a BHI culture medium with 1% sucrose, and cultured under anaerobic conditions. The integrated hardness loss (ΔS) of dentin discs and the hardness of the substrate at different depths were considered as response variables. The ΔS data were analysed by ANOVA followed by Tukey's test, both with significance level of 5%, and the data of hardness at different depths were analysed descriptively.

Result

There was a higher hardness loss after 10 days of microbial growth when compared to 4 days (p = 0.034), however, there was no difference between 7 and 10 days (p = 0.853). The 4-day group showed loss of hardness of the surface layers (10-40μm) and the 10-day group showed demineralization in the deeper area around 150µm.

Conclusion

The proposed model was able to develop artificial caries lesions in dentin. In 7 days, the dentin sub superficial lesions were suitable to des-remineralisation studies.

Descriptors:
Dental plaque; dental caries; demineralization; dentin

INTRODUÇÃO

A cárie dentária ocorre quando há um desequilíbrio na relação físico-química entre o substrato dentário e o biofilme cariogênico formado sobre essa estrutura, resultando na sua destruição¹. A etiologia da doença está relacionada principalmente à interação de fatores determinantes como dieta rica em sacarose, microbiota bucal e higiene bucal inadequada². Nos últimos anos, especial ênfase tem sido dada aos aspectos comportamentais da doença e em especial ao hábito de consumo de carboidratos fermentáveis³ e principalmente sacarose, o principal causador da doença cárie. Estudos mostram que a redução na ingesta de sacarose conduz ao menor aparecimento da doença cárie^4,5.

Modelos laboratoriais de biofilmes vêm sendo desenvolvidos com a finalidade de simular in vitro o ambiente bucal^6-10, devido à dificuldade de investigação do biofilme in vivo, limitação de quantidade amostral, complexidade do ambiente bucal e a questões éticas relacionadas com estudos envolvendo cárie dentária em seres humanos^8,10. E embora estudos in situ possam ser utilizados como uma ponte entre estudos in vitro e in vivo, através do uso de dispositivos intraorais que viabilizam a remoção das amostras em períodos de tempo predeterminados, o acesso às características do biofilme e perfil de desmineralização também possuem limitações como custos, tempo e dependência da colaboração do paciente. Estudos in vitro permitem a realização de investigações em ambientes controlados, com menor variabilidade¹¹. Além disso, estudos in vitro são precursores de estudos in vivo, além de permitirem a confirmação de achados clínicos¹². Ainda, dentro desse contexto, os modelos microbiológicos parecem se aproximar mais do processo de formação da cárie dental e da mimetização da morfologia das lesões¹³.

A utilização de modelos de biofilme em monocultura como, por exemplo, de Streptococcus mutans tem sido útil no estudo de variáveis específicas dentro da complexidade da doença cárie dentária^14,15. Além disso, modelos desse tipo permitem respostas rápidas para avaliação do efeito antimicrobiano ou anticariogênico de substâncias ainda em testes iniciais¹⁶. Diversos métodos microbiológicos de monocultura foram descritos^14,15, porém poucos padronizam os seus resultados para uma condição cariogênica específica. Tratamentos preventivos para a cárie dentária com a utilização de diferentes tipos de materiais vêm sendo amplamente estudados¹ e nesse contexto a padronização de modelos simplificados ou complexos que desenvolvam lesões de cárie em laboratório parece ser útil para investigações acerca do efeito desses materiais.

Ainda, a maior parte dos estudos publicados na literatura sobre a indução de lesões em dentina reportam o uso de diferentes protocolos, sendo baseados normalmente na imersão em ácido ou ciclagem de pH¹³. O presente estudo baseia-se no uso de microrganismos para a indução das lesões, que simulam de forma mais próxima da real os eventos que ocorrem na cavidade oral, em comparação aos modelos anteriormente citados, e permite a interação entre substrato e bactéria. A partir disso, o presente estudo objetivou padronizar o desenvolvimento de lesões de cárie em dentina em um modelo de biofilme de monocultura simplificado (Streptococcus mutans), para auxiliar em estudos de desmineralização e remineralização. A hipótese testada foi de que o modelo de biofilme proposto permitiria o desenvolvimento de lesões artificiais de dentina.

MATERIAL E MÉTODO

Delineamento Experimental

Biofilmes de monocultura (Streptococcus mutans UA 159) foram crescidos sobre 12 discos de dentina bovina, os quais foram alocados em três grupos (n = 4) de acordo com o tempo de incubação: 4, 7 e 10 dias. Todos os grupos experimentais foram expostos ao desafio cariogênico constante através da imersão em caldo BHI (Brain Heart Infusion) inoculados com Streptococcus mutans UA 159, enriquecidos com sacarose a 1% e incubados em atmosfera de anaerobiose a 37 °C. Após cada tempo experimental, analisaram-se as amostras através do teste de dureza transversal para obtenção dos dados de ΔS e dados de dureza em relação às profundidades de indentação (Figura 1).

Figura 1
Delineamento experimental do estudo; (A) Confecção da amostra: 1 e 2 - Obtenção do disco padronizado a partir do dente bovino; 3 e 4 - Corte na junção amelodentinária e obtenção de discos de dentina; 5 - Cobertura com esmalte de unha cosmético, exceto janela superior de 2 mm²; (B) Modelo microbiológico: Crescimentos de biofilme de S. mutans em BHI com 1% de sacarose pelos tempos experimentais de 4, 7 e 10 dias; (C) Corte transversal das amostras e posicionamento das indentações para leituras de dureza.

Preparo dos Espécimes

Doze dentes incisivos bovinos irrompidos e livres de falhas foram selecionados para o estudo e seccionados com auxílio de uma furadeira de bancada ao nível do terço médio para obtenção de discos padronizados (4 mm de diâmetro). Através de uma cortadeira de precisão, os mesmos foram seccionados transversalmente ao nível da junção amelodentinária, separando-se assim os discos de dentina. Os discos obtidos foram polidos e padronizados com a espessura de 1,5 mm. A dureza superficial dos discos selecionados foi de 65,07 ± 3,6 (kgf/mm²). Cada disco teve a superfície totalmente recoberta por esmalte de unha cosmético, exceto a porção superior, na qual uma janela de 2 mm² de dentina permaneceu exposta. Os espécimes foram autoclavados e mantidos em atmosfera úmida (4 °C) até o uso⁹.

Processo de Indução de Cárie

As amostras foram dispostas em tubos Falcon codificados contendo 1 mL de BHI inoculado com Streptococcus mutans 159 UA e enriquecido com sacarose 1% (1,5 × 10⁸ CFU/mL). Os espécimes foram incubados em jarras de anaerobiose sob temperatura de 37 °C por até 4, 7 ou 10 dias. A renovação do meio foi realizada a cada 24 h, e o pH de cada meio de cultura descartado foi verificado para cada grupo (4,13 ± 0,25).

Análise da Perda de Dureza

Após o período experimental de cada grupo, os discos de dentina foram coletados do tubo Falcon e delicadamente limpos com escova dental de cerdas macias. As amostras foram seccionadas de forma perpendicular ao centro da superfície de dentina exposta, usando uma cortadeira de precisão. Todo o processo ocorreu sob refrigeração. As metades de cada amostra foram embutidas em tubos de policloreto de vinila (PVC) com auxílio de resina epóxi e polidas com lixas d’água de 600, 1.200, 1.500 e 2.000, através da utilização de uma politriz. O ensaio de microdureza transversal foi realizado através de um microdurômetro (Future-Tech FM) com indentação do tipo Knoop, com 5 gramas de carga por 5 segundos. Foram realizadas 14 indentações, divididas em 2 colunas com distância de 100 µm entre elas, iniciadas a partir da superfície externa da lesão (Figura 1), segundo as profundidades de 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150 µm. A perda mineral integrada foi calculada através da subtração do perfil de dureza desmineralizado (Knoop Hardness Number, kgf/mm²) a partir do perfil hígido de cada amostra, como previamente descrito¹⁷.

Análise Estatística

Os dados de perda de dureza integrada foram analisados de acordo com os pressupostos de homogeneidade e normalidade¹⁸ e comparados por meio de Análise de Variância de uma via (ANOVA), seguido do teste Tukey, utilizando-se o programa estatístico SPSS V.20 (IBM, USA), ambos com significância de 5%.

RESULTADO

Os dados de perda de dureza integrada estão na Figura 2. Observou-se maior perda de dureza integrada para os tempos experimentais de 7 e 10 dias e não houve diferença entre esses dois períodos (p = 0,853). Foram encontradas diferenças entre os tempos de 4 e 10 dias (p = 0,034).

Figura 2
Perda de dureza integrada (ΔS = média + desvio-padrão) para cada tempo experimental in vitro. Letras diferentes indicam diferença estatística (p < 0,05).

Analisando-se os dados brutos de perda de dureza em relação à profundidade de indentação pôde-se observar, considerando todas as profundidades avaliadas, que a perda de dureza em dentina parece aumentar conforme o número de dias, ou seja, parece ser crescente do grupo 4 dias para os grupos 7 e 10 dias. A perda de dureza encontrada nos grupos 7 e 10 dias estendeu-se desde a superfície da lesão até a profundidade de 40-100 μm, conforme pode-se analisar na Figura 3. No entanto, o grupo experimental de 10 dias demostrou perda de dureza além dessa profundidade, alcançando a totalidade da profundidade mensurada no espécime.

Figura 3
Relação do teste de microdureza Knoop em relação à profundidade de indentação na lesão cariosa induzida in vitro.

DISCUSSÃO

O presente estudo estabeleceu um modelo de monocultura que permite o desenvolvimento de cárie em dentina in vitro de forma padronizada, sendo útil em estudos voltados a desmineralização e remineralizarão. Inúmeros são os modelos para o desenvolvimento de cárie in vitro, entre os quais destacam-se os modelos de géis acidificados, ciclagem de pH¹³ e modelos microbiológicos de microcosmos, consórcios e de monocultura, como o modelo usado no presente estudo^19-21. Dentre os modelos vigentes, modelos microbiológicos são aqueles que melhor mimetizam o processo de cárie natural¹³. Modelos de biofilme simplificados que utilizam uma só espécie bacteriana parecem ser úteis em casos em que seja necessária uma análise rápida dos resultados, e com baixo custo de implementação, quando comparados aos modelos mais complexos, tais como de microcosmos ou de consórcios de bactérias¹⁹.

O modelo de biofilme escolhido mostrou-se adequado para desenvolver lesões artificiais de dentina e, portanto, a hipótese deste estudo foi aceita. A condição cariogênica estabelecida proporcionou perda de dureza integrada para todos os tempos experimentais. Ao fim do primeiro tempo experimental observou-se uma menor desmineralização, principalmente localizada nas áreas mais superficiais (até 40 µm), o que vai ao encontro de estudos com modelos microbiológicos previamente descritos na literatura^13,22. Aos 7 dias observou-se perda de dureza em profundidade até aproximadamente 100 μm, caracterizando o desenvolvimento de lesão artificial de cárie, uma vez que a partir dessa profundidade foram observados valores de dureza correspondentes a superfícies hígidas (~60 kgf/mm²). Após 10 dias de experimento foi possível observar lesões mais profundas, alcançando 150 μm. Como foram observadas áreas pontuais de erosão superficial nessas amostras, a leitura até profundidades maiores foi descontinuada.

Conforme discutido acima, sugere-se que o tempo mais adequado para estudos de des- e remineralização corresponde a 7 dias, uma vez que ao fim desse tempo experimental obteve-se perda de dureza integrada semelhante a dos 10 dias, porém com menor profundidade de lesão. Além disso, esse tempo experimental não demonstrou a presença de lesões de erosão superficial. A partir dessa condição cariogênica torna-se possível induzir lesões subsuperficias de dentina padronizadas in vitro e, a partir disso, realizar estudos de ganho e perda mineral, assim como outros já executados para avaliar o efeito preventivo de agentes contendo flúor^23,24 e outros tratamentos²⁵, porém em um ambiente mais semelhante ao que ocorre na cavidade oral.

Embora os resultados obtidos neste estudo tenham ido ao encontro da hipótese inicial proposta, os autores reconhecem a presença de limitações, como o número de amostras por grupo, como também as inerentes ao modelo simplificado usado, por esse não possuir a capacidade de mimetizar todos os aspectos da cavidade oral e do processo cárie, como ocorre em modelos complexos com utilização de inóculos de microcosmos. Outra limitação do estudo é a descontinuação da análise em profundidades maiores que 150 µm no grupo experimental de 10 dias. Esse fato levou a uma subestimação dos valores de perda mineral para o respectivo tempo experimental. No entanto, o modelo simplificado apresentado ainda parece ser mais representativo que modelos de desenvolvimento de cárie artificiais que utilizam somente géis ácidos ou ciclagem de pH^8,20.

Como prospectos futuros a pesquisas relacionadas à utilização desse modelo destacam-se as possibilidades de investigação de materiais dentários com propriedades antimicrobianas ou anticariogênicas (efeito remineralizador), com relação à possibilidade de adesão microbiana e seu envelhecimento, e, principalmente, de estudos de remineralização e desmineralização envolvendo o substrato dentinário previamente desmineralizado.

CONCLUSÃO

O modelo microbiano investigado mostrou-se adequado para o desenvolvimento de lesões artificiais de dentina, sendo uma ferramenta útil para estudos no campo da cariologia. Dentre os tempos experimentais analisados, o período de 7 dias mostrou-se apropriado para desenvolvimento de lesões subsuperficiais simuladas in vitro.

AGRADECIMENTOS

Os autores gostariam de agradecer à Carmem Lúcia Machado Lopes, técnica do Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal de Pelotas, pelo suporte aos experimentos descritos nesse manuscrito.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Fev 2018
• Data do Fascículo
  Jan-Feb 2018

Histórico

• Recebido
  17 Jul 2017
• Aceito
  24 Jan 2018