Efeito do treinamento físico e da ingestão crônica de cafeína sobre o tecido ósseo de ratos jovens

Efecto del entrenamiento físico y la ingestión crónica de cafeína sobre El hueso de ratas jóvenes

Effect of exercise training and chronic caffeine intake on bone tissue of young rats

BIODINÂMICA

Efeito do treinamento físico e da ingestão crônica de cafeína sobre o tecido ósseo de ratos jovens

Effect of exercise training and chronic caffeine intake on bone tissue of young rats

Efecto del entrenamiento físico y la ingestión crónica de cafeína sobre El hueso de ratas jóvenes

Solange de Paula Ramos^I; Vanessa Batista da Costa Santos^II; Roberto José Ruiz^III; Maria Carla Perozim Preti^IV; Mayara Caroline Ventura^II; Maiara Santos Nogueira^II; Francelaine Bruna Campana^II; Sérgio Swain Müller^V; Marcos Doederlein Polito^III; Claudia Patrícia Cardoso Martins Siqueira^II

^IDepartamento de Histologia, Universidade Estadual de Londrina

^IIDepartamento de Fisioterapia, Universidade Estadual de Londrina

^IIIDepartamento de Educação Física, Universidade Estadual de Londrina

^IVDepartamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Estadual de Londrina

^VFaculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista - Botucatu

^Endereço

RESUMO

Foram avaliados os efeitos da ingestão crônica de cafeína e exercício de natação sobre o tecido ósseo. Ratos Wistar jovens (n = 32) alocados em quatro grupos: sedentário controle (SCO), sedentário + cafeína (SCAF), treinados (TCO) e treinados + cafeína (TCAF), receberam 1 mg/ml de cafeína em água durante 30 dias (SCAF e TCAF) e foram submetidos a 21 dias de natação em intensidade moderada (TCO e TCAF). A tíbia esquerda foi submetida a ensaio biomecânico para determinação do coeficiente de rigidez, limite de elasticidade e carga máxima. A área de tecido ósseo primário e espessura do disco epifisário foram avaliadas no fêmur. Não foram observadas alterações nas propriedades biomecânicas e na deposição de tecido ósseo primário. O grupo SCAF apresentou maior espessura no disco epifisário distal. Os resultados sugerem que o treinamento moderado de natação e a ingestão de cafeína não provocaram alterações morfológicas e biomecânicas do tecido ósseo.

Unitermos: Osso; Cafeína; Exercício.

ABSTRACT

Effects of swimming training and chronic caffeine intake on bone tissue of young rats were investigated. Young Wistar rats were allocated into 4 groups: sedentary control (SCO), sedentary + caffeine (SCAF), trained (TCO) and trained + caffeine (TCAF); they received 1 mg/ml of caffeine diluted in water for 30 days (SCAF and TCAF) and were submitted to swimming training of moderate intensity for 21 days (TCO and TCAF). The left tibia was subjected to the biomechanical test for determination of the coefficient of stiffness, yield and maximum load. The immature bone tissue area and thickness of growth plates were evaluated in the femur. No changes were observed in biomechanical properties and the area occupied by immature bone tissue. However, SCAF group presented greater thickness in distal growth plate. The results suggest that the moderate intensity swimming training and caffeine consumption were not able to promote changes in morphology and biomechanical properties of bone tissue.

Uniterms: Bone; Caffeine; Exercise.

RESUMEN

Se evaluaram los efectos del consumo crónico de cafeína y la natación em el hueso. Ratas Wistar jóvenes (n=32) divididas en cuatro grupos: sedentarios control (SCO), sedentarios + cafeína (SCAF), entrenados (TCO) y entrenados + cafeína (TCAF), recibieron 1 mg/ml de cafeína en agua durante 30 días (SCAF e TCAF) e fueron sometidos 21 días de la natación moderada. La tibia izquierda se sometió a una prueba biomecánica para determinar la coeficiente de la rigidez, el limite de elasticidad y el punto de carga máxima. El area de hueso imaturo e de la zona de la placa de crescimiento proximal e distal se analizó em el fêmur. No se observaron cambios en las propiedades biomecánicas y el déposition de hueso inmaturo. Animales SCAF tenía más grueso de la placa de crescimiento distal. Los resultados sugieren que entrenamento moderalado de la natación y el cosumo crônico de cafeína no cambió la morfología y las propiedades biomecánicas del hueso.

Palabras clave: Hueso; Cafeína; Ejercicio.

Introdução

Apesar de a cafeína ser consumida em alimentos e bebidas, e ser utilizada frequentemente como recurso ergogênico em atividades esportivas (Burke, 2008; Goldstein, Ziegenfuss, Kalman, Kreider, Campbell, Wilborn, Taylor, Willoughby, Stout, Graves, Wildman, Ivy, Spano, Smith & Antonio, 2010), estudos "in vivo" e "in vitro" demonstram que a droga possui efeitos sobre o processo de remodelamento do tecido ósseo, sendo apontada como um possível fator de risco para a osteoporose (Duarte, Marques, Bezerra & Bastos, 2009; Hallstrom, Wolk, Glynn &Michalsson, 2006; Liu, Chen, Yang, Yen, Yang & Tsai, 2011; Rapuri, Gallagher, Kinyamu & Ryschon, 2001). Estudos em animais demonstraram que o consumo crônico de cafeína provoca redução da densidade mineral óssea (Lacerda, Matuoka, Macedo, Petenusci, Campos & Brentegani, 2010; Liu et al., 2011), afetando o processo de neoformação e de remodelamento do tecido em animais jovens (Duarte et al., 2009). Em estudos longitudinais em humanos, o consumo de bebidas cafeinadas provocou alterações no processo de remodelamento ósseo, sem alterar significativamente a densidade óssea em indivíduos jovens (Libuda, Alexy, Remer, Stehle, Schoenau & Kersting, 2008; Wetmore, Ichikawa, Lacroix, Ott & Scholes, 2008). Muitos dos estudos sobre cafeína e metabolismo ósseo foram realizados em mulheres idosas, e apresentando outros fatores de risco para a perda de densidade óssea como, por exemplo, o sedentarismo e depleção hormonal (Hallstrom et al., 2006; Hansen, Folsom, Kushi & Sellers, 2000; Rapuri, Gallagher, Kinyamu & Ryschon, 2001).

O exercício físico pode ter efeito antagonista à perda de cálcio induzida pela cafeína, protegendo o tecido ósseo (Huang, Yang, Hsieh & Liu, 2002). A estimulação mecânica sobre o tecido ósseo parece favorecer a atividade osteoblástica e a sobrevida de osteócitos, além de aumentar a densidade óssea mineral (Goulet, Halonen, Koch, Britton, Zernicke & Kozloff, 2011; Kemmler, Von Stengel, Bebenek, Engelke, Hentschke & Kalender, 2011; Mann, Huber, Kogianni, Jones & Noble, 2006). Os efeitos protetores do exercício físico podem ser mais eficazes em exercícios de força e impacto, sendo que a natação promove efeitos menos pronunciados no aumento da densidade óssea mineral em animais jovens (Hind, Gannon, Whatley, Cooke & Truscott, 2011; Huang, Lin, Chang, Hsieh, Liu & Yang, 2003; Mudd, Fornetti & Pivarnik, 2007; Warner, Shea, Miller & Shaw, 2006). Como o uso de altas doses de cafeína tem sido aplicado como recurso ergogênico associado ao treinamento físico, inclusive em indivíduos jovens e praticantes de natação (Dascombe, Karunaratna, Cartoon, Fergie & Goodman, 2010), torna-se necessário conhecer os efeitos do consumo crônico de cafeína e sua interação com o tecido ósseo nos indivíduos treinados.

Considerando que a associação entre os efeitos da cafeína sobre o tecido ósseo ainda são controversos e necessitam de maiores investigações, o objetivo do presente estudo foi analisar a estrutura histológica do fêmur e propriedades biomecânicas da tíbia de ratos Wistar submetidos a um período de treinamento físico com suplementação de cafeína.

Método

Foram utilizados 32 ratos machos, Wistar, com aproximadamente 250 gramas, obtidos do Biotério do Centro da Universidade Estadual de Londrina. Os animais foram mantidos em gaiolas à temperatura controlada de 25 °C, sendo fornecida ração normocalórica NUVILAB^® e água potável "ad libitum". Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para o Uso de Animais da Universidade Estadual de Londrina, parecer CEUA 028/10.

A amostra foi dividida em quatro grupos de oito animais, sendo eles: sedentário controle (SCO), sedentários com cafeína (SCAF), treinados controle (TCO) e treinados com cafeína (TCAF).

Os animais dos grupos SCAF e TCAF foram suplementados com 1 mg/ml de cafeína diluída em água potável, durante um período de 30 dias, por meio de ingestão voluntária (Lorenzo, Leon, Castillo, Ruiz, Albasanz & Martín, 2010), enquanto os animais do grupo SCO e TCO receberam água potável. O volume de ingestão líquida e o consumo de ração foram avaliados no primeiro, décimo e vigésimo dia de treinamento.

Os grupos TCO e TCAF foram submetidos ao treinamento de natação, por um período de 21 dias, realizados cinco vezes por semana, em intensidade moderada (Carvalho, Masuda & Pompeu, 2005; Ravi Kiran, Subramanyam & Asha Devi, 2004) em tanques individuais, com temperatura da água entre 28 °C a 32 °C. Os animais foram submetidos a um período de familiarização com o ambiente aquático, durante cinco dias, em tanques com 10 cm de água no primeiro dia, aumentando diariamente o volume de água, até completar 30 cm de profundidade. Os animais que não apresentaram comportamento de natação voluntária foram excluídos. O protocolo de treinamento foi iniciado com sete minutos de treino sem carga, e aumentado gradativamente conforme TABELA 1.

Os animais foram pesados, no inicio do treinamento, e semanalmente, até o fim do experimento para ajuste de cargas de treino. As cargas de treino variaram de 3% a 4% do peso corporal e foram fixados ao abdômen do animal durante o treinamento.

Imediatamente após a última sessão de treino, os animais foram sedados em éter etílico e 1 ml de sangue foi coletado em tubos de ensaio contendo fluoreto de sódio, por punção cardíaca. As amostras de sangue foram centrifugadas e submetidas a dosagem de lactato (Biotecnica, Varginha, Brasil). Após 24 horas da última sessão de treino, os animais foram novamente sedados para coleta de sangue, via punção cardíaca. As amostras foram centrifugadas e o soro foi separado para dosagem de cálcio e creatina quinase, utilizando kits comerciais (Biotecnica, Varginha, Brasil), conforme instruções do fabricante.

Os animais foram sacrificados por inalação de dose letal de éter etílico. A tíbia direita foi removida e utilizada como corpo de prova para análise biomecânica e o fêmur esquerdo foi utilizado para análise histológica.

Para determinação das propriedades mecânicas, foi realizado ensaio de flexão em três pontos utilizando a Máquina Universal de Ensaios Mecânicos (Emic Modelo DL10000). O corpo de prova (tíbia direita) foi posicionado com apoio nas extremidades e a carga perpendicular incidiu sobre a metáfise. A distância entre os dois apoios de suporte foi padronizada em dois terços do comprimento do corpo de prova. O cutelo de aplicação de carga foi posicionado em ponto equidistante às extremidades. As propriedades biomecânicas analisadas foram a carga máxima (N) - carga máxima suportada pelo corpo de prova até a ruptura; o limite de elasticidade (N) - ponto final da fase elástica linear; e o coeficiente de rigidez (N/10 -3m) - relação entre carga e deformação do diagrama até o limite de elasticidade (Huang et al., 2003, 2010).

O fêmur foi fixado em solução de formalina tamponada 10%, durante 24 horas, e descalcificado durante 21 dias em solução de ácido etilenodiaminotetracético 10% (pH 7.2) em corrente elétrica de 75 mV. As amostras foram incluídas em parafina histológica e cortes de 7 µm foram submetidos a coloração de hematoxilina e eosina.

As imagens histológicas foram capturadas em câmera MOTICAN (Motic Company, Xiamen, China) e analisadas em "software" Motic Image Plus 2.0 (Motic Company, Xiamen, China). Três imagens do disco epifisário proximal e distal, e três imagens do osso esponjoso da diáfise medial e distal de cada animal, foram capturadas em aumentos de 40x. Foram avaliadas a espessura média do disco epifisário e a área das trabéculas ósseas do osso esponjoso.

A distribuição de normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smornov. A comparação entre grupos com distribuição paramétrica foi avaliada pelo teste ANOVA two-way, com teste "post hoc" de Tukey. Dados com distribuição não-paramétrica foram tratados com o teste Kruskal-Wallis e teste "post hoc" de Dunn. As diferenças entre os grupos foram consideradas significantes quando P < 0,05.

Resultados

Não foi observada diferença no peso final (Kruskal Wallis statistic = 6,01; P = 0,10), no consumo de ração (F = 1,48; P = 0,24) e ingestão de líquido (F = 0,02; P = 0,99) (TABELA 2). O consumo médio de cafeína nos grupos COCAF e TCAF foi 6,1 ± 0,8 mg.kg^-1.dia^-1.

Não foram observadas diferenças significativas na concentração sérica de cálcio entre os grupos (F = 0,48, P > 0,05). Os níveis de lactato sanguíneo foram significativamente menores nos animais treinados (F = 8,10; P = 0,002), em relação aos animais dos grupos sedentários (TABELA 2).

Não foi observada diferença nos valores de carga máxima (Kruskal Wallis statistic = 2,30; P = 0,51), limite de elasticidade (F = 0,13; P = 0,93) e coeficiente de rigidez (F = 0,43; P = 0,71) entre os grupos (FIGURA 1).

A análise histológica do fêmur não demonstrou alteração significativa na espessura do disco epifisário distal entre os grupos estudados (Kruskal Wallis statistic = 1,39; P = 0,70) (FIGURA 2a). Todos os animais apresentaram disco epifisário distal. Animais submetidos à dieta com cafeína e sedentários (SCAF) apresentaram maior espessura do disco epifisário proximal (Kruskal Wallis statistic = 11,74; P = 0,008) , em relação ao grupo SCO (P < 0,05, teste de Dunn) (FIGURA 2b). Não foi observada diferença entre a espessura do disco epifisário proximal nos grupos SCO e TCO (P > 0,05, teste de Dunn), TCO e TCAF (P > 0,05, teste de Dunn). Oito animais (22%) apresentaram ossificação completa do disco epifisário proximal, sendo três no grupo SCO, um no SCAF, dois no TCO e dois no TCAF.

Quanto à formação de osso primário, não foram observadas diferenças significativas (F = 1,88; P = 0,15) nas áreas ocupadas pelas trabéculas ósseas do osso esponjoso entre os grupos estudados (FIGURA 3).

Discussão

Os resultados do presente estudo sugerem que as propriedades biomecânicas e morfológicas no tecido ósseo em crescimento não foram alteradas com a associação da administração crônica da cafeína e do protocolo de natação. Estudos em animais aplicando exercícios de natação sugerem que ocorre um aumento da atividade osteoblástica e das propriedades biomecânicas do tecido ósseo, mesmo na ausência de alterações histomorfométricas (Hart, Shaw, Vajda, Hegsted & Miller, 2001; Huang et al., 2003, 2010; Warner, Shea, Miller & Shaw, 2006). Em protocolo de exercício de natação semelhante ao aplicado no presente estudo, foi observado aumento na carga máxima e módulo de Young no exercício com 2% de carga, enquanto a intensidade de 4% diminuiu as propriedades biomecânicas do tecido ósseo femoral (Huang et al., 2003, 2010). A carga progressiva e o tempo treinamento aplicados no presente estudo não provocaram alterações significativas nas propriedades biomecânicas. Porém, também não foram observadas alterações biomecânicas significativas quando a cafeína foi administrada concomitantemente ao treinamento utilizado.

O curto intervalo de treinamento e a modalidade de exercício aplicado aos animais em estudos foi capaz de promover adaptação aeróbica ao exercício, reduzindo os níveis séricos de lactato. No entanto, o protocolo de exercício não promoveu adaptações morfológicas e biomecânicas sobre o tecido ósseo. Estudos anteriores reportando o aumento do volume das trabéculas ósseas e das propriedades biomecânicas ósseas aplicaram protocolos de treinamento em esteira de 10 a 19 semanas, o que pode ter estimulado de forma mais eficiente a ossificação primária (Huang et al., 2002, 2003, 2010; Tromp, Bravenboer, Tanck, Oostlander, Holzmann, Kostense, Roos, Burger, Huiskes & Lips, 2006).

O consumo crônico de cafeína tem sido associado ao maior risco de desenvolvimento de lesões osteoporóticas, pois a droga diminui a densidade mineral óssea e interfere no metabolismo do cálcio, ostoblastos e osteoclastos (Body, Bergmann, Boonen, Boutsen,Bruyere,Devogelaer, Goemaere, Hollevoet, Kaufman, Milsen, Rozenderg & Reginster, 2011; Duarte et al., 2009; Liu et al., 2011; Lu, Lai & Chan, 2008; Rapuri et al., 2001; Tsuang, Sun, Chen, Sun & Chen, 2006). Embora exercícios de impacto possam favorecer o desenvolvimento de uma estrutura óssea mais resistente a testes bimecânicos, a natação parece não aumentar de forma significativa o volume e a resistência do tecido ósseo, e pode provocar redução da densidade mineral óssea em atletas jovem (Carbuhn, Fernandez, Bragg, Green & Crouse, 2010; Hind et al., 2011; Mudd, Fornetti & Pivarnik, 2007). O consumo crônico de cafeína pode inibir o processo de remodelamento do tecido ósseo, diminuindo o pico de massa óssea em indivíduos jovens. No entanto, poucos estudos avaliaram o consumo crônico de cafeína sobre a mineralização do tecido ósseo em indivíduos jovens (Huang et al., 2002; Libuda et al., 2008; Wetmore et al., 2008). Estudos em animais demonstram que o consumo crônico de cafeína tem atividade pró-resorptiva, diminui a densidade mineral óssea e compromete a ossificação dos discos epifisários e o processo de reparo ósseo (Duarte et al., 2009; Liu et al., 2011). Por outro lado, estudos em humanos sugerem que o consumo de bebidas cafeínadas não altera de forma significativa a densidade mineral óssea em mulheres jovens (Wetmore et al., 2008).

No presente estudo, embora o crescimento dos discos epifisários dos animais do grupo controle e treinados com e sem cafeína apresentassem padrão normal (Reno, Mcburney, Lovejoy & Horton We, 2006; Roach, Mehta, Oreffo, Clarke & Cooper, 2003), os ratos do grupo SCAF apresentaram maior espessura do disco epifisário proximal comparado ao controle e 22% dos animais SCAF apresentaram calcificação do disco epifisário proximal, sugerindo que ocorreu um comprometimento do crescimento ósseo dos animais sedentários e tratados com cafeína. O consumo de altas doses de cafeína (10 mg/100g de peso corporal por dia) associado a protocolos de exercícios demonstraram resultados semelhantes em relação ao comportamento do disco epifisário proximal (Huang et al., 2002), com o aumento na espessura da placa de crescimento da tíbia proximal e maior número de células na zona proliferativa. Por outro lado, há evidências de que baixas doses de cafeína não provocam alterações na histomorfometria óssea e marcadores séricos do metabolismo mineral ósseo, embora a cafeína tenha aumentado a secreção de osteocalcina, um fator de crescimento regulador da formação de calcificação da matriz óssea (Glajchen, Ismail, Epstein, Jowell & Fallow, 1988). No entanto, Liu et al. (2011) demonstram que animais jovens suplementados com cafeína apresentam aumento da ativação de osteoclastos, aumento da expressão do ligante do receptor ativador do fator nuclear kappa B (RANKL) e inibição da expressão de osteoprotegerina, além da redução da densidade mineral óssea. Os resultados divergentes em relação a estudos anteriores podem ter ocorrido devido ao maior tempo de exposição à cafeína realizada nos referidos estudos e as dosagens utilizadas.

Além do tempo de exposição à cafeína, a concentração de cafeína também é relevante em algumas pesquisas. Por exempo, em pesquisas com animais, Lacerda et al. (2010) administraram 50 mg/ml de cafeína por 42 dias e Duarte et al. (2009) utilizaram doses de cafeína equivalentes a 10 mg/100 g de peso corporal durante 56 dias. Ambos os estudos concluíram que existe uma ação negativa da cafeína sobre o metabolismo ósseo. No nosso estudo, foi utilizado 1 mg/ml de cafeína, equivalente a aproximadamente 6 mg/kg, doses consideravelmente menores que as utilizadas por Lacerda et al. (2010) e Duarte et al. (2009). Em conjunto, o resultado destes e de outros estudos sugerem que a cafeína administrada cronicamente tem o potencial de interferir com o crescimento dos ossos longos, dependendo da dose e do tempo de utilização. A ingestão crônica de cafeína associada ou não ao protocolo de exercício utilizado nesta pesquisa não foi capaz de alterar as propriedades biomecânicas no sistema ósseo de ratos Wistar.

O exercício aplicado no presente estudo simulou um treinamento aeróbio de baixa intensidade, provavelmente induzindo um aumento do metabolismo aeróbio e reduzindo a concentração sérica de lactato (Carvalho, Masuda & Pompeu, 2005; Ravi Kiran, Subramanyam & Asha Devi, 2004). Porém, o exercício não promoveu alterações morfológicas do tecido ósseo primário ou alteração das propriedades biomecânicas.

Concluímos que a administração crônica de cafeína associada ao exercício de natação não provocou alteração das propriedades biomecânicas e morfologia do tecido ósseo. A administração crônica de cafeína em animais sedentários sugere que ocorra um atraso no processo de ossificação do disco epifisário. No entanto, a extrapolação de resultados em relação a administração de doses seguras e eficientes de cafeína ou bebidas e suplementos cafeinados em praticantes de natação jovens deve aguardar resultados que demonstrem os efeitos da cafeína sobre o modelo moléculas reguladoras do metabolismo ósseo. Estudos experimentais, utilizando protocolos de exercício em intensidade e modalidades diferentes, tais como exercícios de força e esteira, são necessários para esclarecer o impacto da administração crônica de cafeína.

Recebido para publicação: 14/09/2011

Revisado: 14/03/2012

Aceito: 02/04/2012

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Jul 2012
• Data do Fascículo
  Jun 2012

Histórico

• Recebido
  14 Set 2011
• Aceito
  02 Abr 2012
• Revisado
  14 Mar 2012