DETECÇÃO DIRETA DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE EM ÓRGÃOS DE SUÍDEOS DO ESTADO DE SÃO PAULO PELA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE (NESTED-PCR)

DIRECT DETECTION OF ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE IN SUIDAE ORGANS IN SÃO PAULO STATE, BRAZIL, BY POLYMERASE CHAIN REACTION (NESTED-PCR)

RESUMO

A pleuropneumonia suína, causada pelo Actinobacillus pleuropneumoniae, é uma importante doença respiratória, responsável por prejuízos e queda de produtividade nas criações. Este trabalho teve como objetivo determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR dirigida ao gene Apx IV. Definiu-se a sensibilidade analítica das técnicas de PCR e nested-PCR utilizando a amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III, em concentrações de DNA variando entre 30 µg/mL a 0,01 ng/ mL. Um total de trinta e sete amostras de campo encaminhadas ao Instituto Biológico entre 1995 a 2007 foram analisadas pelas técnicas de PCR e nested-PCR. A avaliação da sensibilidade analítica revelou que a PCR possui capacidade de gerar sinal a partir de 2 ng/mL de DNA extraído e a nested-PCR a partir de 0,4 ng/mL. Uma vez que a nested-PCR apresentou sensibilidade analítica cinco vezes maior se comparada à PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão, o seu emprego pode minimizar a ocorrência de resultados tipo “falso-negativo”. Dentre as amostras testadas, dez foram positivas à nested-PCR, sendo observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, um deles javali. A presente técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio.

PALAVRAS-CHAVE
Actinobacillus pleuropneumoniae ; pleuropneumonia suína; reação em cadeia pela polimerase (PCR); nested-PCR

ABSTRACT

Porcine pleuropneumonia, caused by Actinobacillus pleuropneumoniae, is an important respiratory disease, responsible for economic losses and reduced productivity. The aim of this study was to determine occurrence of A. pleuropneumoniae in field samples, using an adapted nested-PCR reaction targeting the Apx IV gene. Different DNA concentrations (from 30 µg/mL to 0.01 ng/mL) of A. pleuropneumoniae serotype III reference strain were used to determine the level of sensitivity of first generation and nested-PCR reactions. Thirty-seven field samples sent to Instituto Biológico from 1995 to 2007 were tested by PCR and nested-PCR. Determination of the level of sensitivity showed that PCR could amplify to 2 ng/mL of extracted DNA and nested-PCR to 0.4 ng/mL. Since the nested reaction exhibited a level of sensitivity 5 times greater than the PCR reaction to detect a reference strain, using nested-PCR could minimize the occurrence of false-negative results. Among tested samples, 10 of them were nested-PCR positive, showing occurrence of A. pleuropneumoniae in 9 different animals (including one wild boar). This nested-PCR reaction can be used for direct detection of A. pleuropneumoniae in field samples, even after frozen storage for long periods, without the need for previous bacterial isolation.

KEY WORDS
Actinobacillus pleuropneumoniae ; porcine pleuropneumonia; polymerase chain reaction (PCR); nested-PCR

O Actinobacillus pleuropneumoniae é um cocobacilo Gram negativo classificado em dois biovares e quinze sorotipos, definidos pela produção de uma ou mais toxinas do grupo RTXs (repeat in toxin), sendo elas Apx I, Apx II e Apx III. A toxina Apx I tem ação hemolítica e citotóxica, a Apx II é citotóxica e tem baixa atividade hemolítica e a Apx III possui apenas a atividade citotóxica (CHRISTENSEN; BISGAARD, 2004).

SCHALLER et al. (1999) descreveram o gene Apx IV, que codifica a toxina RTX IV, de baixa atividade hemolítica, comum a todos os sorotipos.

O A. pleuropneumoniae está envolvido na ocorrência da pleuropneumonia suína, caracterizada por dificuldade respiratória, febre, depressão, tosse, mortalidade e morbidade variáveis, além de gastos com medicamentos e possíveis condenações de carcaças. Acredita-se que suínos de todas as idades sejam susceptíveis, porém os surtos ocorrem geralmente naqueles entre setenta e cem dias de idade. Após essa fase, segue-se a forma crônica, afetando principalmente os animais na terminação (SOBESTIANSKY et al., 1998).

O agente pode localizar-se nas tonsilas, em abscessos e nódulos pulmonares dos suínos, transformando-os em portadores assintomáticos. Fêmeas infectadas ou vacinadas desenvolvem imunidade sorotipo específica que, por meio do colostro, protege seus leitões nas primeiras semanas de vida (BERSANO et al., 2003).

O primeiro relato da infecção ocorreu em 1959 no norte da Califórnia, enquanto que, no Brasil, a primeira descrição foi em Santa Catarina em 1981. Desde então, o agente tem sido identificado com certa frequência mediante diferentes metodologias, viabilizando a sorotipagem eficiente, rápida, de fácil execução e baixo custo (BERSANO et al., 2003).

PIFFER et al. (1985), analisando amostras de pulmão e cavidade nasal de suínos no sul do Brasil, por meio das técnicas de imunoeletroforese, imunofluores-cência e imunodifusão, identificaram os sorotipos 3 e 5.

Durante o período de 1985 a 1987, SAITO et al. (1988), examinando cavidade nasal e pulmão de setenta e dois suínos, de diferentes idades e com sintomas clínicos de pleuropneumonia, provenientes de dez estados brasileiros, isolaram trinta e três cepas de

A. pleuropneumoniae. Os sorotipos identificados pela soroaglutinação rápida em placa foram 1, 3, 4 e 5. A existência de novos sorotipos e o grande número de amostras de A. pleuropneumoniae não tipadas levaram PIFFER et al. (1995) a analisar, por imunodifusão e hemaglutinação passiva, cinquenta e duas amostras originárias de diferentes regiões do Brasil, ocasião na qual observaram tratarem-se dos sorotipos 1, 3, 7, 9, sendo a primeira identificação dos sorotipos 7 e 9 no país.

O A. pleuropneumoniaetem sido detectado por meio da reação em cadeia pela polimerase (PCR) por diversos autores, tendo como vantagem em relação ao isolamento bacteriano, a possibilidade de amplificar material genético de amostras não viáveis biologicamente, o que minimiza resultados “falso-negativos”. Nesse sentido, BACCARO et al. (1999) submeteram fragmentos de pulmão de seis suínos a essa prova e observaram que dois desses materiais foram positivos, tanto no isolamento como na PCR. Na mesma ocasião também aplicaram a técnica em sessenta e oito suabes de tonsilas de suínos com idade entre cinquenta dias e um ano, demonstrando resultado positivo em vinte e uma dessas amostras.

Segundo FONSECA et al. (1999), KLEIN et al. (1999), COLLARES et al. (1999) e COSTA et al.(2004), a PCR tem se mostrado de grande utilidade, tendo entre outras vantagens a de otimizar estratégias de isolamento bacteriano, aumentando as possibilidades de detecção do agente e agilizar o diagnóstico, uma vez que pode substituir as provas bioquímicas para a caracterização do agente.

O diagnóstico do A. pleuropneumoniae é uma etapa fundamental para o estabelecimento de ações preventivas nos rebanhos e, nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi determinar a ocorrência de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mediante a adaptação e emprego de uma técnica de nested-PCR direcionada ao gene Apx IV, sem isolamento bacteriano prévio.

A amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III liofilizada teve seu DNA extraído mediante fervura em água ultrapura por 10 minutos. Em seguida, foi realizada a quantificação do material em espectrofotômetro a 260 nm (CASTRO et al., 2002) e diluições em concentrações variáveis entre 30 a 0,1 ng/mL de DNA foram empregadas para determinação da sensibilidade analítica das reações de PCR, visando amplificar um fragmento de 442 pares de bases (pb) de parte do gene Apx IV, e nested-PCR (com alteração da temperatura de hibridização dos primers de 52º C para 54,3º C), amplificando um fragmento interno ao anterior, de 378 pb.

Tabela 1
Descrição da sequência de nucleotídeos dos primers utilizados nas reações de PCR e nested-PCR para detecção de DNA de Actinobacillus pleuropneumoniae. São Paulo, 2007.

Nome	Sequência	Localização	Tamanho	Referência
			fragmento
ApxIVA-1L	5'- TGGCACTGACGGTGATGA - 3'	6018-6035	442 pb	Schaller et al., 1999
ApxIVA-lR	5'- GGCCATCGACTCAACCAT - 3'	6442-6459
ApxIVA-lR-nest	5'- GGGGACGTAACTCGGTGATT - 3'	6407-6427	378 pb	Schaller et al., 2001
ApxIVA-L-nest	5'- GCTCACCAACGTTTGCTCAT - 3'	6050-6064

Para os cálculos de sensibilidade analítica, foi utilizada a sequência completa do genoma deA. pleuropneumoniae sorotipo III depositada no GenBank^® (NCBI Reference Sequence NC_010278), determinando a massa do DNA genômico com auxílio do software BioEdit Sequence Alignmnet Editor^®, versão 7.0.5.3 (HALL, 1999).

A solução de reagentes da PCR foi modificada e consistiu-se de: 0,25 µM de primers ApxIV-1L e ApxIV1R (Tabela 1); 1,0 U/µL de Platinum^® Taq DNA polimerase (Invitrogen^®); 0,17 mM de cada dNTP; 1,5 mM de MgCl₂; 20 mM de Tris-HCl pH 8,4; 50 mM de KCl; 2,5 µL de DNA extraído e água ultrapura q.s.p. 25 µL. Os ciclos de temperatura foram de 94º C por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94º C por 30 segundos, 52º C por 30 segundos, 72º C por 30 segundos, encerrando com aquecimento de 72º C por 10 minutos para a extensão final (SCHALLER et al., 1999). A solução de reagentes da reação de nested-PCR foi idêntica à reação supracitada, substituindo-se apenas o par de primers, sendo agora empregados ApxIV-1L-nest e ApxIV-1R-nest (Tabela 1) (SCHALLER et al., 2001) e submetida a 94º C por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94º C por 30 segundos, 54,3º C por 30 segundos, 72º C por 30 segundos, encerrando com aquecimento de 72º C por 10 minutos para a extensão final (FERRAZ et al., 2006). Os produtos amplificados foram visualizados por transiluminação com luz ultravioleta, após eletroforese em gel de agarose a 2% corado com brometo de etídeo a 0,5 mg/mL. Os fragmentos amplificados foram comparados a padrão de tamanho molecular (100 bp DNA Ladder BioLabs^®) disposto no gel juntamente com as amostras analisadas.

Uma vez definida a sensibilidade analítica das técnicas, estas foram empregadas para a detecção direta de A.pleuropneumoniaea partir de um painel de 37 amostras de campo (provenientes de 33 suínos e 1 javali) oriundas de diversas criações do Estado de São Paulo, encaminhadas ao Instituto Biológico entre os anos de 1995 e 2007. Tais amostras consistiam em macerados de pulmão (n = 13), de tonsilas (n = 7) e pools que continham pulmão e tonsilas, além de outros órgãos (n = 17), sendo realizada a extração do material genético mediante o emprego do reagente DNAzol (Invitrogen^®) de acordo com as instruções do fabricante.

As técnicas de PCR e nested-PCR apresentaram o sinal esperado, demonstrando respectivamente produtos amplificados de 442 e 378 pb.

Os resultados obtidos nos testes de sensibilidade analítica mostraram que ambas as reações possuem capacidade de gerar sinal a partir de quantias reduzidas de material genético quando trabalhamos com culturas puras da bactéria, alcançando o limiar de 2 ng/mL para a reação de PCR e 0,4 ng/mL para a nested-PCR (Fig. 1), que em massa equivaleria respectivamente a 5 pg de DNA na PCR e 0,1 pg na nested-PCR. Sabendo-se que a massa aproximada de DNA genômico de uma unidade de A. pleuropneumoniae (de acordo com a sequência NC_010278) é 2,3 fg, a reação de nested-PCR pode detectar o DNA equivalente a pouco mais de 40 bactérias.

Fig. 1
Reprodução de gel de eletroforese com resultado do teste de sensibilidade analítica das reações de PCR (acima) e nested-PCR (abaixo) para Actinobacillus pleuropneumoniae sorotipo III. São Paulo, 2007. Nota: Os números acima das canaletas representam as concentrações de DNA empregadas nas reações em ng/mL. Pode-se observar o padrão de tamanho molecular de 100 pb (L) e a presença de fragmentos de 442 pb até a concentração 2,0 µg/mL para PCR e 378 pb até a concentração de 0,4µg/mL para nested-PCR.

Das trinta e sete amostras testadas, não houve sinal detectável na PCR, porém, dez delas foram positivas à nested-PCR, oriundas de diferentes materiais clínicos (pulmão n = 3; tonsila n = 3; pool de órgãos n = 4), representando nove animais, dos quais um era javali (Tabela 2).

Tabela 2
Resultados obtidos a partir da reação de nested-PCR das amostras de diferentes órgãos de suídeos. São Paulo, 2007.

Ano de colheita	Órgão	Nested-PCR
45/1995	pool	negativo
62/1998	pool	negativo
89/1998	tonsila	negativo
90/1998	tonsila	negativo
91/1998	tonsila	negativo
97/1998	tonsila	positivo
136/1998	pool	negativo
58/2000	pulmão	positivo
120/2000	pulmão	negativo
129/2001	tonsila	negativo
99/2002	pulmão	positivo
39/2002	pulmão	negativo
105/2002	pulmão	negativo
73/2003	pulmão	negativo
102/2003	pool	negativo
114/2003	pool	negativo
140/2003	tonsila	positivo
140/2003	pulmão	negativo
49/2004 A	pool	negativo
49/2004 B	pool	negativo
12/2005	pulmão	positivo
60/2005	pool	negativo
62/2005	pool	negativo
65/2005	pool	negativo
68/2005	pool	negativo
73/2005	pulmão	negativo
99/2005	pool	positivo
103/2005	pool	positivo
109/2005	pool	negativo
111/2005	pool	negativo
119/2005	pulmão	negativo
131/2005	pulmão	negativo
132/2005	pulmão	negativo
50/2006	pool	positivo
17/2007	pulmão	negativo
17/2007	tonsila	positivo
17/2007	pool	positivo
Total	37	10

• Nota: a amostra 17/2007 é proveniente de javali

As técnicas de PCR e nested-PCR adaptadas a partir dos trabalhos de SCHALLER et al. (1999, 2001) e FERRAZ et al. (2006) apresentaram sinal correspondente ao esperado, demonstrando respectivamente 442 e 378 pares de bases em seus produtos amplificados. Cabe ressaltar que a presença de fragmentos intermediários com 410 pb (Fig. 1) é resultado da hibridização de primers restantes da PCR em combinação com os da nested-PCR, deixando claro não ser uma amplificação inespecífica apresentada pela reação.

A sensibilidade analítica de ambas as técnicas foi determinada com base em diluição de material genético extraído a partir de amostra padrão (bactéria liofilizada, A. pleuropneumoniae sorotipo III), o qual foi dosado por espectrofotometria. Os resultados obtidos mostram que ambas as reações possuem capacidade de gerar sinal a partir de quantias mínimas de material genético quando trabalhamos com culturas puras da bactéria, alcançando o limiar de 2 ng/mL para a reação de PCR e 0,4 ng/mL para a nested-PCR, que em massa equivaleria respectivamente a adição de 5 pg de DNA na PCR e 0,1 pg na nested-PCR, ou ainda o equivalente a 40 bactérias na última reação.

Portanto, demonstrou-se que a nested-PCR é capaz de evidenciar sinal a partir de uma quantidade cinco vezes menor de material do que aquela presente na PCR, o que é particularmente relevante quando a reação é feita a partir de amostras de campo, nas quais a concentração bacteriana pode estar reduzida e a viabilidade do DNA comprometida. Uma decorrência de se aliar a nested-PCR neste contexto foi a minimização da ocorrência de resultados do tipo falso-negativos que seriam gerados se apenas a reação de PCR tivesse sido aplicada, deixando evidente que o aumento da sensibilidade analítica da técnica aumentou também a sua sensibilidade diagnóstica. Com efeito, todas as trinta e sete amostras de campo testadas pela PCR apresentaram resultado negativo, porém, quando submetidas à nested-PCR, dez delas mostraram-se positivas.

Aparentemente, o tipo de órgão do qual se fez a extração de material genético não influenciou no resultado do teste, visto que dentre as dez amostras positivas, quatro delas eram pool de órgãos, três foram obtidas a partir de pulmão e outras três de tonsilas. Deste modo o teste mostrou-se versátil quanto ao emprego de diferentes materiais clínicos.

Outra observação importante é em relação às amostras 140/2003 e 17/2007, que tiveram material genético extraído tanto de pulmão quanto de tonsila, porém, apresentando resultado positivo apenas para tonsilas. Isso pode indicar que a infecção estava sendo controlada na porta de entrada (tonsilas) ou que estava evoluindo, mas ainda não havia atingido os pulmões. Além disso, o material depoolde órgãos da amostra 17/ 2007 também foi testado, apresentando resultado positivo e demonstrando que, apesar da amostra de tonsila ter sido diluída junto a outros órgãos, isso não afetou

o resultado, além de que o material desses órgãos não se mostrou inibidor para a amplificação.

A enfermidade tem sido controlada por meio da vacinação, que impede a mortalidade, mas não a infecção, conferindo ainda, uma imunidade soro-específica. A erradicação da enfermidade num plantel fica dificultada pela presença dos portadores, recomendando-se a eliminação do rebanho e a repopulação com animais livres (BERSANO et al., 2003), o que denota a importância de se identificar a circulação do agente nas criações.

A sensibilidade analítica (limiar de detecção) da nested-PCR foi cinco vezes maior se comparada a PCR para detecção de A. pleuropneumoniae em amostra padrão. A técnica de nested-PCR pode ser utilizada para detecção direta de A. pleuropneumoniae em amostras de campo, mesmo após congelamento da amostra por longos períodos e sem necessidade de isolamento bacteriano prévio. Foi observada a ocorrência de A. pleuropneumoniae em nove diferentes animais, sendo um deles javali, oriundos de diferentes criações localizadas no Estado de São Paulo.

Ao se considerar que o A. pleuropneumoniae apresenta crescimento fastidioso ao isolamento e que foi possível detectar o A. pleuropneumoniae em amostras de diferentes órgãos, armazenadas em freezer comum (-20º C) por longos períodos, esta prova constitui-se numa alternativa ao diagnóstico direto deste agente.

AGRADECIMENTOS

-ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão de bolsa de Iniciação Científica à Maria Isabel Camargo Pinto Ferraz; -à Empresa Irfa Química e Biotecnologia Industrial Ltda, pelo fornecimento da amostra padrão A. pleuropneumoniae sorotipo III liofilizada.

REFERÊNCIAS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Out 2020
• Data do Fascículo
  Jan-Mar 2010

Histórico

• Recebido
  11 Jan 2008
• Aceito
  17 Nov 2009