Conjunto mínimo de parâmetros para avaliação da microbiota do solo e da fixação biológica do nitrogênio pela soja

Minimal set of parameters for evaluation soil microbiota and biological nitrogen fixation in soybean

MICROBIOLOGIA

Conjunto mínimo de parâmetros para avaliação da microbiota do solo e da fixação biológica do nitrogênio pela soja

Minimal set of parameters for evaluation soil microbiota and biological nitrogen fixation in soybean

Rosinei Aparecida de Souza^I; Mariangela Hungria^II; Julio Cezar Franchini^II; Carlos Dias Maciel^III; Rubens José Campo^II; Dimas Augusto Morozin Zaia^I

^IUniversidade Estadual de Londrina, Departamento de Química, Caixa Postal 60001, CEP 86051-990 Londrina, PR. E-mail: [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Soja, Caixa Postal 231, CEP 86001-970 Londrina, PR. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail]

^IIIUniversidade de São Paulo, Escola de Engenharia de São Carlos, Departamento de Engenharia Elétrica, CEP 13566-590 São Carlos, SP. E-mail: [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar e validar um conjunto mínimo de parâmetros para o monitoramento, em campo, da microbiota do solo e da fixação biológica do N₂ (FBN) pela soja. Os ensaios foram conduzidos em áreas de plantios comerciais (safra 2002/2003) e experimentais (safra 2004/2005), em blocos ao acaso. O C e o N da biomassa microbiana (CBM e NBM) mostraram-se adequados para a avaliação quantitativa da microbiota do solo e ambos os parâmetros foram correlacionados significativamente, portanto, apenas um deles precisa ser determinado. Foram obtidas correlações positivas e significativas entre a massa da parte aérea seca das plantas (MPAS) e o CBM e o NBM. A análise do DNA total do solo por eletroforese em géis desnaturantes (DGGE) detectou alterações qualitativas na microbiota do solo, relacionadas à homogeneidade da área e a diferenças entre tratamentos, áreas e coletas. A massa de nódulos secos (MNS) foi o melhor parâmetro para a avaliação da nodulação. Correlações significativas foram constatadas entre a MPAS e o N total acumulado na parte aérea (NTPA). Resultados semelhantes foram observados entre a MPAS e o N de ureídos (NTU). O monitoramento da FBN pela soja pode ser realizado apenas pela determinação da MNS e da MPAS.

Termos para indexação:Bradyrhizobium, Glycine max, biomassa microbiana, fixação biológica do nitrogênio, monitoramento ambiental.

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate and validate a minimum set of parameters capable of monitoring, under field conditions, soil microbes and/or the biological N₂ fixation process with the soybean crop. The field trials were performed in commercial fields (2002/2003) and experimental areas (2004/2004), with complete randomized blocks design. Microbial biomass C (MBC) and N (MBN) were adequate for the quantitative evaluation of soil microbes; the parameters were significantly correlated therefore the determination of only one of them is sufficient. Positive and significant correlations were also obtained between the parameters of shoot dry weight (SDW) and MBC and MBN. The analysis of total soil DNA by the denaturating gradient gel electrophoresis method (DGGE) detected qualitative changes in soil microbes, related to the homogeneity of the area, as well as to differences among treatments, areas and harvests. Nodule dry weight (NDW) was the most suitable parameter for the evaluation of nodulation. Significant correlations were obtained between the SDW and the total N accumulated in shoots (TNS). Similar results were obtained between SDW and total N-ureides (TNU). Monitoring of the symbiosis in soils traditionally cropped with soybean and poor on N may be achieved only by the determination of NDW and SDW.

Index terms:Bradyrhizobium, Glycine max, microbial biomass, biological nitrogen fixation, environmental monitoring.

Introdução

O cultivo comercial de plantas transgênicas iniciou-se em 1996 e cresceu exponencialmente desde então, tendo atingido aproximadamente 87,2 milhões de hectares em 2005 e envolvido mais de 8 milhões de agricultores em 17 países; 60% dessa extensão são cultivados com soja (Brookes & Barfoot, 2005, 2006).

Esses autores relacionam vários benefícios econômicos, ambientais e sociais gerados em uma década de comercialização de transgênicos, incluindo maior produtividade, redução no uso de agrotóxicos e no gasto de combustíveis, menor emissão de gases com efeito estufa, e maior seqüestro de C. Por sua vez, questões relacionadas à segurança dos transgênicos, à saúde humana e ao ambiente são muito discutidas e incluem a possibilidade de fluxo gênico para plantas selvagens, domesticadas, ou ervas daninhas, e a tolerância aos agrotóxicos, além de questões éticas, socioeconômicas, de propriedade intelectual e de direito do consumidor (Gepts & Papa, 2003; Huffman et al., 2003; Gepts, 2004).

A estimativa do impacto ambiental, também denominada de análise de risco, é definida como um processo de avaliação, que inclui a identificação das incertezas, das probabilidades e da severidade dos efeitos adversos ao homem, ou ao meio ambiente, após a exposição a determinadas fontes de risco.

O reconhecimento da importância dos microrganismos para a qualidade do solo e da fixação biológica do N₂ (FBN) para a nutrição das leguminosas tem demandado a análise de diversos parâmetros microbiológicos em ensaios de avaliação de impactos ambientais. Como exemplo, a aprovação do uso comercial da soja transgênica pela CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) vem sendo condicionada à realização de planos de monitoramento pré ou pós-comerciais, em escala de propriedades comerciais ou de ensaios experimentais, nos quais estão incluídas avaliações da microbiota do solo. A definição de um conjunto mínimo de parâmetros, sensíveis, com baixa variabilidade e custo e validado para as condições brasileiras é relevante para a análise de risco ambiental em estudos que envolvem transgênicos, ou quaisquer novas tecnologias aplicadas à cultura da soja, inclusive o melhoramento genético tradicional.

O objetivo deste trabalho foi avaliar e validar um conjunto mínimo de parâmetros para o monitoramento, em campo, da microbiota do solo e da fixação biológica do N₂ (FBN) pela soja.

Material e Métodos

Foram realizadas avaliações em dois conjuntos de ensaios, conduzidos por duas safras (2002/2003 e 2004/2005), nas principais regiões produtoras de soja. O Ensaio 1 (2002/2003) foi conduzido com soja convencional em propriedades de agricultores, localizadas em seis municípios tradicionais de produção de soja: São Luiz Gonzaga (RS), Passo Fundo (RS), Ponta Grossa (PR), Cascavel (PR), Londrina (PR) e Dourados (MS).

Os ensaios nessas propriedades foram instalados no delineamento experimental em blocos ao acaso, com três repetições. As coletas para as análises microbiológicas foram realizadas nos estádios V4 (terceira folha trifoliada estendida e a quarta aberta) e R2 (florescimento pleno) do desenvolvimento da soja. O Ensaio 2 foi conduzido em sete estações experimentais, localizadas em regiões produtoras de soja: Ponta Grossa (PR), Londrina (PR), Santo Antônio da Posse (SP), Sete Lagoas (MG), Santo Antônio de Goiás (GO), Brasília (DF) e Planaltina (DF). As cultivares de soja utilizadas foram a Conquista e a Conquista evento transgênico, constituída de uma linhagem com características fenotípicas desejáveis, que contém uma cópia única de gene para tolerância a um herbicida específico. Os ensaios foram conduzidos com o delineamento experimental em blocos ao acaso, com quatro repetições e três tratamentos: 'Conquista' evento transgênico e herbicida específico, 'Conquista' evento transgênico e herbicidas convencionais, 'Conquista' convencional e herbicidas convencionais. As coletas para as análises microbiológicas foram realizadas nos estádios de pré-plantio (PP), R2 e, em cinco locais, em R8 (maturação plena). Detalhes sobre as áreas e condução dos ensaios constam do trabalho de Souza et al. (2008).

De cada uma das parcelas foram coletadas sete subamostras deformadas de solo (0–10 cm), na área total da parcela, antes do plantio, para a análise quantitativa e qualitativa da microbiota do solo. Na avaliação quantitativa do C da biomassa microbiana (CBM), utilizou-se o método de fumigação-extração modificado de Vance et al. (1987) e, para o N (NBM), o método de Brookes et al. (1985). A respiração basal (RB) foi avaliada pela determinação do C do CO₂ (C-CO₂) liberado em amostras não-fumigadas, incubadas por dez dias, e capturado em uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,5 N. O quociente metabólico (qCO₂) foi calculado pela divisão da RB pelo CBM. Para a determinação qualitativa da microbiota do solo, o DNA total do solo foi extraído e amplificado com primers específicos para a região que codifica para o gene ribossômico 16S rRNA e os produtos da reação foram submetidos à eletroforese em gel com gradiente desnaturante de uréia (DGGE, Denaturating Gradient Gel Electrophoresis) (Souza et al., 2008).

Nas avaliações da simbiose soja-rizóbio, inicialmente foi determinada a população de rizóbios capazes de nodular a soja, pelo método do número mais provável (NMP) com contagem em plantas. No estádio R2, dez plantas de soja foram coletadas ao acaso, de cada parcela, para a determinação dos parâmetros número (NN), massa de nódulos secos (MNS) e massa da parte aérea seca (MPAS). O N total da parte aérea (NTPA) foi avaliado por digestão úmida, seguida pela determinação da concentração de N, utilizando um analisador automático (Tecator Automatic N Analyzer, Suécia). Os pecíolos foram moídos (malha de 20 mesh) separadamente para a análise do N total sob a forma de ureídos (NTU). O teor de nitrato nos pecíolos também foi determinado, para a avaliação da percentagem do N total sob a forma de ureídos (%NU) (Herridge & Peoples, 1990). A ocupação dos nódulos pelas estirpes dominantes nos solos brasileiros foi realizada em 40 nódulos, escolhidos ao acaso, de cada parcela, pelo método de imunoaglutinação, contra os antígenos somáticos termoestáveis preparados com as estirpes SEMIA 5079, SEMIA 5080, SEMIA 587 e SEMIA 5019.

No Ensaio 2, os teores de P e K na parte aérea das plantas coletadas em R2 também foram determinados. Após a digestão do material moído por via seca em mufla, os teores de P e K foram analisados por espectroscopia de emissão atômica induzida por plasma (ICP-AES).

Os dados foram submetidos ao teste de normalidade das variáveis e de homogeneidade das variâncias (ANOVA) (SAS, 1999). Quando comprovadas a normalidade e a homogeneidade, foram calculadas a média aritmética () e o desvio-padrão (s), e resultados semelhantes foram obtidos utilizando-se o SAS ou o Microsoft Excel. Na estimativa da precisão experimental, foi utilizado o coeficiente de variação (CV) (desvio-padrão/média, s/). A classificação do CV nos níveis baixo, médio, alto e muito alto foi realizada após a análise da média aritmética () e do desvio-padrão da média (s) de cada valor de CV (Souza et al., 2008). Coeficientes de correlação entre os diversos parâmetros foram estimados com o programa Microsoft Excel e, também, na página da University of Amsterdam (2005). A análise dos perfis de DNA obtidos na análise de DGGE foi realizada com o programa Bionumérics (v. 1.50) (Applied Mathematics, Kortrijk, Bélgica), utilizando o algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetic mean) e o coeficiente de Jaccard.

Resultados e Discussão

No Ensaio 1, quando os parâmetros de CBM, RB e qCO₂ foram correlacionados (Tabela 1), destacaram-se as correlações positivas e significativas entre o CBM e a RB, tanto no estádio V4 (r = 0,83, p<0,001), como no estádio R2 (r = 0,90, p<0,001). A correlação entre esses dois parâmetros também foi positiva e estatisticamente significativa, quando os dados das duas coletas foram analisados em conjunto (r = 0,84, p<0,001), (Figura 1). Em relação ao qCO₂, não houve correlação com a RB em cada coleta, contudo, houve correlação negativa e significativa, a p<0,05, com o CBM, tanto em V4, como em R2, o que indica que, concomitantemente com o incremento no CBM, a microbiota tendeu a incrementar a eficiência metabólica, provavelmente pela seleção de microrganismos mais eficientes na conversão dos nutrientes disponíveis, particularmente o C (Tabela 1).

No Ensaio 1, o CBM e a RB foram significativamente correlacionados, por isso, no Ensaio 2, decidiu-se pela avaliação do CBM e a inclusão de um novo parâmetro, o NBM. As correlações obtidas entre o CBM e o NBM, avaliados em R2, em cada um dos sete locais, não foram estatisticamente significativas (Tabela 2). Entretanto, quando todos os dados coletados em R2 foram analisados em conjunto, constatou-se correlação positiva e altamente significativa (r = 0,77, p<0,001) (Figura 2 A). Além disso, o CBM e o NBM também foram correlacionados significativamente quando todos os locais e épocas (PP, R2 e, em cinco locais, em R8) foram considerados (r = 0,75, p<0,001) (Figura 2 B).

Desde o estudo pioneiro de Jenkinson (1966), dezenas de trabalhos comprovaram que a determinação da biomassa microbiana do solo pode fornecer informações relevantes sobre o funcionamento dos ecossistemas e sobre a qualidade do solo, havendo, inclusive, indicações de que os parâmetros microbiológicos apresentam maior sensibilidade do que os químicos e físicos, refletindo rapidamente alterações pelo manejo do solo ou das culturas (Wardle, 1992, 1998; Balota et al., 1998, 2003; Franchini et al., 2007). Com base nos resultados obtidos nos Ensaios 1 e 2, pode-se concluir que qualquer um dos três parâmetros – CBM, RB ou NBM – pode ser utilizado para a avaliação quantitativa da microbiota do solo. A vantagem da utilização do CBM reside na maior disponibilidade de dados, o que facilita a construção de bancos de dados.

Em relação à avaliação qualitativa da biomassa microbiana pelo DGGE, no estudo de Souza et al. (2008) foi evidenciado que a análise de quatro ou três repetições por tratamento, ou, ainda, de duas repetições combinadas (cada uma representou duas repetições em campo) foi válida para identificar a homogeneidade entre repetições e detectar diferenças qualitativas na microbiota do solo, relacionadas aos diferentes tratamentos, locais e épocas de colheita.

Neste trabalho, os perfis foram analisados visando a estabelecer a dissimilaridade máxima aceitável entre repetições em um mesmo local, com o uso do programa Bionumerics, o algoritmo de UPGMA e o coeficiente de Jaccard. Constatou-se que, quando a tolerância do programa for estabelecida em 5%, o nível de dissimilaridade máximo aceitável entre repetições deve ser de 5%. Um exemplo está demonstrado na Figura 3, em que os perfis das três repetições de São Luiz Gonzaga foram distintos, com dissimilaridade superior a 5%, o que indica falta de homogeneidade da área, ao contrário de Dourados, onde os perfis foram 99% similares. No caso da tolerância do programa ser fixada em 2%, o limite de dissimilaridade máxima aceitável pode ser superior, de até 10%.

No Ensaio 1, quando os parâmetros utilizados na avaliação da FBN foram correlacionados, verificou-se que o NN foi correlacionado positivamente com a MNS (r = 0,91, p<0,001) (Tabela 3). Conseqüentemente, no caso deste trabalho, conduzido em solos com população estabelecida de Bradyrhizobium, somente um dos dois parâmetros necessitaria ser avaliado, sendo preferível optar pela MNS, pela maior praticidade, menor variabilidade espacial e temporal e, também, pela melhor correlação com o desempenho simbiótico (Döbereiner, 1966; Bohrer & Hungria, 1998; Hungria & Bohrer, 2000).

Correlações positivas e significativas foram constatadas entre a MPAS e o NTPA (r = 0,88, p<0,001), bem como entre a MPAS e o N total da planta sob a forma de ureídos (NTU) (r = 0,81, p<0,001); além disso, o NTU foi altamente correlacionado com o NTPA (r = 0,94, p<0,001) (Tabela 3). Em condições axênicas, Haydock et al. (1980) verificaram que as estirpes mais eficientes poderiam ser selecionadas com base na biomassa de plantas, ou somente da parte aérea, sem a necessidade de determinar o teor de N nos tecidos. Bohrer & Hungria (1998) constataram, também em condições axênicas, correlação positiva, elevada e significativa (r = 0,88, p<0,001) entre a MPAS e o NTPA. Posteriormente, esses resultados foram confirmados em solo não-estéril, em condições de casa de vegetação (r = 0,91, p<0,001) (Hungria & Bohrer, 2000).

A ocupação dos nódulos pelas estirpes não foi correlacionada significativamente com a MPAS, com o NTPA, ou com o NTU (Tabela 3). Limitações à determinação da ocupação dos nódulos foram apontadas por Souza et al. (2008): nódulos ocupados por mais de uma estirpe; nódulos sem reação conhecida; variabilidade (CV%) aceitável para as estirpes que ocuparam a maior percentagem dos nódulos (SEMIAs 587, 5019 e 5079), mas não para a estirpe menos competitiva (SEMIA 5080); e dificuldade em separar estirpes com reação sorológica semelhante, por exemplo, a SEMIA 566 e a SEMIA 5079. Essas limitações dificultam a interpretação dos resultados obtidos, razão pela qual não deve ser incluído na avaliação da eficiência agronômica de inoculantes para leguminosas (Relare, 2000). A avaliação da ocupação dos nódulos, no entanto, é importante em estudos de ecologia de rizóbios – por exemplo, de introdução de estirpes em solos isentos de Bradyrhizobium (Mendes et al., 2004) –, bem como para monitorar o efeito da reinoculação maciça com novas estirpes em solos com população naturalizada (Nishi & Hungria, 1996). Neste estudo, a MNS foi correlacionada positivamente com a ocupação pelas estirpes SEMIA 587 e 5019, ao passo que a eficiência dos nódulos foi correlacionada negativamente com essas duas estirpes e positivamente com a SEMIA 5080. Desse modo, as estirpes SEMIA 587 e 5019 resultaram em maior nodulação, mas a SEMIA 5080 foi a mais eficiente no processo de FBN, confirmando relatos anteriores (Nishi & Hungria, 1996; Mendes et al., 2004; Hungria et al., 2006).

No Ensaio 2, na coleta R2, em cada um dos sete locais, também se destacaram as correlações significativas entre a MPAS e o NTPA (Tabela 2). Quando os dados dos sete locais foram analisados em conjunto, novamente obteve-se correlação positiva e altamente significativa (r = 0,96) (Figura 4), confirmando os resultados obtidos no Ensaio 1. Pode-se concluir, portanto, que em solos com baixos teores de N e na ausência de fertilizantes nitrogenados, a avaliação da MPAS representa um forte indicativo do estado nutricional da soja em N – isso porque, no Brasil, em geral a soja recebe todos os nutrientes necessários ao seu desenvolvimento, exceto o N, que se torna o nutriente limitante ao crescimento das plantas.

Para verificar se o crescimento das plantas (MPAS) estava, de fato, relacionado ao N, procedeu-se à análise dos teores de P e K nos mesmos tecidos, uma vez que esses são os dois nutrientes, após o N, acumulados em quantidade maior nos tecidos da soja. Constatou-se que o N foi o nutriente com maior correlação com o crescimento das plantas, sendo estatisticamente distinto do P e do K (Figura 4). Adicionalmente, a MPAS foi significativamente correlacionada com o N proveniente da FBN sob a forma de ureídos (Figura 5) e houve correlação altamente significativa entre o NTPA e o NTU (r = 0,997, p<0,001). A escolha de correlação com o parâmetro de MPAS apresenta vantagens em relação ao rendimento de grãos, que está condicionado a características genéticas da planta, como resistência ao acamamento e número de vagens por haste, nem sempre relacionadas à qualidade do solo.

Quando todas as áreas foram consideradas (84 médias por parâmetro), também foram verificadas correlações positivas e altamente significativas entre MPAS e CBM e entre MPAS e NBM (Figura 6), bem como entre NTPA e CBM (r = 0,65, p<0,001) e entre NTPA e NBM (r = 0,65, p<0,001), indicando a viabilidade de utilização dos parâmetros de biomassa microbiana como bioindicadores do crescimento da soja.

As limitações dos ensaios conduzidos sob condições de laboratório para o monitoramento ambiental já foram amplamente discutidas (Eijsackers, 1985; Grossbard, 1985), e um passo importante, nesse sentido, foi a definição das avaliações em escala de campo (Farm Scale Evaluations, FSEs), que estabeleceu alguns critérios, metodologias e bases estatísticas (Perry et al., 2003). O volume especial da revista Philosophical Transactions of the Royal Society of London B (v.358, 2003) relata os resultados obtidos em FSEs na Grã-Bretanha, após três anos de cultivo com culturas transgênicas de beterraba (Beta vulgaris subsp. vulgaris), milho (Zea mays L.) e canola (Brassica napus). Tanto nos estudos de definição de FSEs como nesse volume especial, são apresentados resultados referentes à biota do solo, mas somente invertebrados (Firbank et al., 2003; Perry et al., 2003; Squire et al., 2003).

Um problema identificado nos ensaios da Grã-Bretanha, conduzidos com o desenho experimental em split-plot, com metade da área cultivada com a cultura geneticamente modificada e a outra metade com a cultura convencional, foi a constatação da necessidade de repetição em 60 a 75 locais, por cultura, para conseguir detectar diferenças de 50% entre os tratamentos (Champion et al., 2003; Perry et al., 2003; Squire et al., 2003). Ainda assim, os autores demonstraram que, pela análise histórica das áreas, o cultivo tradicional por um ou vários anos antes do início do ensaio já havia afetado grupos sensíveis, em 50%, ou mais, dificultando a interpretação de qualquer efeito positivo, ou negativo, do cultivo de plantas transgênicas (Squire et al., 2003). Souza et al. (2008) definem níveis aceitáveis de dispersão de alguns parâmetros biológicos para as condições edafoclimáticas do Brasil, pois, conforme salientado por Bruinsma et al. (2003), a falta de informação sobre o que deve ser uma variação normal ou modificada é, provavelmente, um dos principais fatores responsáveis pelo número elevado de estudos não conclusivos sobre impacto ambiental na microbiota do solo.

Em função das correlações obtidas, foi possível definir um conjunto mínimo de parâmetros para avaliar possíveis efeitos na microbiota do solo (CBM ou NBM e análise do DNA total do solo por DGGE) e na FBN (MNS, MPAS e, no caso de desconhecimento dos teores de N do solo, o NTPA ou NTU), pela adoção de novas tecnologias com a cultura da soja. A utilização desse conjunto mínimo de parâmetros, em diversos ensaios, pode promover a criação de bancos de dados, facilitar a identificação de problemas com a capacidade produtiva dos solos e permitir o monitoramento em avaliações de risco ambiental.

Conclusões

1. A avaliação do C ou do N da biomassa microbiana permite monitorar, quantitativamente, o impacto de novas tecnologias com a cultura da soja na microbiota do solo.

2. A análise do perfil de DNA total do solo por DGGE permite monitorar, qualitativamente, o impacto de novas tecnologias com a cultura da soja na microbiota do solo.

3. A massa de nódulos e da parte aérea secos, de plantas coletadas no estádio R2, constitui o conjunto mínimo de parâmetros para a avaliação da fixação biológica do nitrogênio com a cultura da soja, em solos com baixo teor de N.

4. Em solos com teores desconhecidos ou elevados de N, ou que receberam fertilizante nitrogenado, o conjunto mínimo de parâmetros para a avaliação da fixação biológica do nitrogênio deve incluir, ainda, o teor de N total ou de N de ureídos na parte aérea.

Recebido em 26 de abril de 2007 e aprovado em 17 de dezembro de 2007

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Fev 2008
• Data do Fascículo
  Jan 2008

Histórico

• Aceito
  17 Dez 2007
• Recebido
  26 Abr 2007