Determinação de aflatoxina B1 em pimenta (Piper nigrum L.) e orégano (Origanum vulgare L.) por cromatografia em camada delgada e densitometria

Determination of aflatoxin B1 (Piper nigrum L.) and oregano (Origanum vulgare L.) by thin-layer chromatography and densitometry

aflatoxin B1; methodology; spices

ARTIGO

Determinação de aflatoxina B₁ em pimenta (Piper nigrum L.) e orégano (Origanum vulgare L.) por cromatografia em camada delgada e densitometria

Determination of aflatoxin B₁ (Piper nigrum L.) and oregano (Origanum vulgare L.) by thin-layer chromatography and densitometry

Guilherme Prado^*; Marize Silva de Oliveira; Ana Paula Aprígio Moreira; Adriana de Souza Lima; Robson de Assis Souza; Matheus do Carmo Alves

Serviço de Ciências Bioquímicas, Fundação Ezequiel Dias, Rua Conde Pereira Carneiro, 80, 30510-010 Belo Horizonte – MG, Brasil

ABSTRACT

An analytical study based on extraction with methanol-water, immunoaffinity cleanup and separation, identification and quantification of aflatoxin B₁ by thin-layer chromatography,in ground black and white pepper and oregano was carried out. Validation of the applied methodology was done through accuracy and precision studies. Recoveries of aflatoxin B₁ and relative standard deviations, from spice samples spiked at levels from 4.86 to 97.70 µg/kg, were, respectively, higher than 72% and lower than 20%. Application to spice samples available in Minas Gerais state, purchased at popular markets, showed no contamination with aflatoxin B_1.

Keywords: aflatoxin B₁; methodology; spices.

INTRODUÇÃO

Fungos estão amplamente distribuídos no solo, plantas, matéria orgânica em decomposição, água, ar e poeira. Conseqüentemente, produtos não processados de origem animal e vegetal podem tornar-se contaminados com uma ampla variedade de espécies fúngicas. Os condimentos são produzidos em países de clima tropical que apresentam elevados valores de temperatura, umidade e índices de pluviosidade. Freqüentemente, os condimentos permanecem no solo para secagem à temperatura ambiente, onde as condições climáticas favorecem o crescimento de fungos e a produção de micotoxinas.^1-3

Micotoxinas são metabólitos tóxicos do metabolismo secundário de fungos filamentosos, principalmente dos gêneros AspergillusPenicillium e Fusarium. Existem descritas cerca de 400 micotoxinas, sendo as mais comuns as aflatoxinas, ocratoxina A, fumonisina, desoxinivalenol, patulina, toxina T-2 e zearalenona.⁴ As micotoxinas têm sido detectadas em vários alimentos de muitas partes do mundo, inclusive no Brasil, e são consideradas como um dos mais perigosos contaminantes de alimentos e rações animais.^5,6

Dentre as micotoxinas, as aflatoxinas (B₁, B₂, G₁ e G₂) representam a principal classe e são produzidas principalmente por Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, sendo freqüentemente encontradas em amendoim, pistache, cereais, milho, arroz e figo. Os efeitos tóxicos das aflatoxinas incluem atividade imunossupressora, mutagênica, teratogênica e hepatocarcinogênica. A aflatoxina B₁ é o mais potente hepatocarcinógeno descrito em mamíferos e é classificada no Grupo 1 (provável carcinógeno) pela "International Agency of Research on Cancer"^7,8.

Diferentes condimentos, tais como, pimenta, páprica, orégano, cominho, gengibre, açafrão, são produzidos principalmente na Índia, Indonésia, Brasil, Marrocos, Malásia e Turquia, sendo mundialmente utilizados para aumentar e/ou acrescentar sabor ao alimento, e, secundariamente, com finalidade de conservação, devido a suas propriedades antioxidantes. Apesar de inúmeros trabalhos descritos na literatura relacionarem a ocorrência de aflatoxinas em diferentes tipos de alimentos, poucos descrevem sua presença em condimentos.^2,3,5,9-14

Tradicionalmente, métodos analíticos para a determinação de aflatoxinas empregam extração das toxinas com solventes orgânicos, coluna de imunoafinidade, partição líquido-líquido ou coluna de fase sólida para a remoção de compostos interferentes e quantificação por cromatografia em camada delgada (CCD) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).^4,15-19

O monitoramento de aflatoxinas requer método simples, rápido, exato, preciso e sensível. Infelizmente, poucos trabalhos com estas características são descritos na literatura. Devido a sua especificidade, o emprego de coluna de imunoafinidade atualmente está bem difundido em diferentes tipos de alimentos, como café, cerveja, leite, queijo, suco de maçã, iogurte e matrizes complexas como salsa e plantas medicinais.^20-31

O objetivo desse trabalho foi avaliar o grau de contaminação com aflatoxina B₁ em amostras de pimenta (Piper nigrum L.) e orégano (Origanum vulgare L.) comercializadas no estado de Minas Gerais. Inicialmente, foram avaliados alguns parâmetros de um método analítico, utilizando extração com metanol-água, purificação em coluna de imunoafinidade e detecção e quantificação da aflatoxinaB₁ por cromatografia em camada delgada/densitometria.

PARTE EXPERIMENTAL

Reagentes

Os solventes utilizados para preparo da fase móvel: ácido fórmico, clorofórmio e tolueno (Merck, Darmstadt, Alemanha) e acetato de etila (CRQ, Diadema, Brasil) foram de grau analítico. O metanol empregado para extração da aflatoxina foi grau cromatográfico (Merck, Darmstadt, Alemanha). O Tween 20 foi grau analítico Vetec (Duque de Caxias, Rio de Janeiro). A água utilizada no preparo da solução de extração foi obtida por sistema de purificação e filtração Milli-Q de resistividade 18 MW cm^-1 (Millipore, Bedford, MA, USA).

Aflatoxina B₁ foi adquirida da Sigma Chemicals Co, St. Louis, MO e diluído em benzeno:acetonitrila (98:2 v/v), grau cromatográfico. O benzeno da Tedia (Fairfield, OH, USA) e a acetonitrila, da Merck (Darmstadt, Alemanha).

A coluna de imunoafinidade utilizada foi a Aflatest WB, G1024, da Vicam, Watertown, USA. A estocagem das colunas foi em temperatura entre 2 e 8 ºC e utilizadas à temperatura ambiente.

As placas de cromatografia de camada delgada empregadas foram obtidas da Merck (Darmstadt, Alemanha): cromatofolha de alumínio, sílicagel 60, sem indicador fluorescente, 20 x 20 cm e espessura de 250 µm.

Todo o material de vidraria utilizado na determinação de aflatoxina foi descontaminado com Extran Alcalino MA 01, 7555 (Merck, Darmstadt, Alemanha), a 20%, (pH >12) permanecendo em contato durante 24 h e posterior lavagem com água destilada.

Solução padrão de aflatoxina B₁

Solução padrão estoque de aflatoxina B₁ (13,43 µg mL^-1) foi preparada dissolvendo o padrão sólido em benzeno:acetonitrila (98:2 v/v). A concentração exata foi medida em espectrofotômetro Shimadzu UV-1601 PC, Shimadzu Scientific Instrument, Japão.³² Uma solução padrão intermediária foi preparada diluindo 1 mL da solução estoque com 10 mL de benzeno:acetonitrila (98:2 v/v). Esta solução foi utilizada para a elaboração da curva de calibração, aplicando-se na placa de cromatografia de camada delgada volumes que variaram de 2 a 5 µL. Para os ensaios de fortificação foi utilizada uma solução de aflatoxina B₁ em benzeno:acetonitrila (98:2 v/v) em uma concentração de 9,73 µg mL^-1 . Todas as soluções foram acondicionadas em frascos âmbar a 18 ºC.

Amostras

Um total de 30 amostras de pimenta do reino e 20 de orégano moídas foram coletadas pela Vigilância Sanitária (MG) em supermercados e mercearias de diferentes municípios do estado de Minas Gerais, no período de março de 2006 a julho de 2007.

Extração e purificação

Amostras de pimenta (50 g) e orégano (25 g) foram extraídas com 250 mL de uma mistura de metanol:água (60:40) e 4 g de NaCl, sob agitação durante 60 min, seguida de ultrassom por 15 min. Após filtração em papel Whatmam 4 e microfibra Whatman GF-B 47 mm, 10 mL e 25 mL dos extratos de pimenta e orégano, respectivamente, foram diluídos com 10 e 25 mL, de Twenn 20%. Após agitação, a totalidade da mistura foi passada através de uma coluna de imunoafinidade, contendo anticorpos específicos para aflatoxina, em um fluxo de 2-3 mL/min. Posteriormente a coluna foi lavada com 20 mL de água destilada, seca, sendo a aflatoxina B₁ eluída com 3 x 2 mL de metanol. Seguiu-se evaporação do metanol até resíduo (± 50 ºC), em atmosfera de nitrogênio e ressuspensão em 200 µL de benzeno:acetonitrila (98:2 v/v). Este procedimento analítico faz parte do Manual de Instruções da Vicam para quantificação de aflatoxinas B₁, B₂, G₁ e G₂ em condimentos. Foi alterada a proporção da mistura de extração metanol:água (de 80:20 para 60:40) e utilizada uma coluna de imunoafinidade com maior quantidade de anticorpos específicos para aflatoxinas: a coluna WB G1024 da Vicam ao invés da Aflatest,³³ conforme descrito na parte experimental (Reagentes).

Cromatografia em camada delgada – densitometria

A aflatoxina B₁ foi separada e identificada por cromatografia em camada delgada, em placa de sílica gel 60 G, 20 x 20 cm, utilizando-se como fase móvel tolueno:acetato de etila:clorofórmio:ácido fórmico (70:50:50:20 v/v/v/v). Foram aplicados 5, 10, 20 e 30 µL dos extratos das amostras e 2, 3, 4 e 5 mL da solução padrão intermediária de aflatoxina B₁ (1,343 µg mL^-1). Após eluição a placa foi seca em estufa a 105 ºC durante 10 min e examinada visualmente em luz ultravioleta a 366 nm (Cromatovisor UV-Betrachter, Suiça). A quantificação da aflatoxina B₁ foi feita por medidas das intensidades das fluorescências dos spots das amostras e de padrões, em densitômetro Shimadzu, modelo CS9301PC, com lâmpada de xenônio, 250-370 nm, em leitura linear, com feixe 0,4 x 5,0 mm e alta sensibilidade de fluorescência. Os níveis de aflatoxina B₁ nas amostras foram calculados a partir do cálculo das áreas dos picos das aflatoxinas referentes aos extratos das amostras e da solução padrão de aflatoxina B₁.

Características de desempenho da metodologia analítica

Linearidade

A linearidade foi avaliada na faixa de 2,7 a 6,7 ng, a partir da solução padrão intermediária de aflatoxina B₁ de 1,343 µg mL^-1 e calculada a partir da equação da regressão linear, determinada pelo método dos mínimos quadrados. Foi utilizado o coeficiente de correlação linear (r²) como indicador da reta como modelo matemático.³²

Recuperação

Os estudos de recuperação foram realizados após fortificação de amostras em que não foram detectadas aflatoxinas com solução padrão de aflatoxina B₁ em benzeno:acetonitrila (98:2 v/v) em uma concentração de 9,73 µg mL^-1. Para pimenta foram utilizados 6 níveis de contaminação em 4 repetições e para orégano, 4 níveis de contaminação em duplicata. A recuperação foi calculada pela relação entre a quantidade de toxina quantificada e a adicionada no início do procedimento analítico executado de forma completa.

Limites de detecção e quantificação

O limite de detecção do equipamento foi considerado como sendo a menor concentração de aflatoxina B₁ em que o método distingue, com segurança, como sendo a resposta. A faixa empregada foi de 0,09 a 0,45 ng de aflatoxina B₁.

O limite de quantificação representa a menor concentração do analito que pode ser determinado com um nível aceitável de exatidão e precisão. É a capacidade de um método obter resultados próximos ao real e com baixa dispersão, executando o procedimento analítico de forma completa³².

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 1 mostra o densitograma de uma curva padrão de aflatoxina B₁ e de amostras fortificadas de pimenta (19,46 µg/kg), obtido pela medida das áreas de fluorescência dos respectivos extratos aplicados na placa de cromatografia. Boa linearidade foi obtida entre fluorescência emitida e concentração de aflatoxina, demonstrada pelo valor do coeficiente de correlação (r²) superior a 0,99, conforme recomendado por Green.³⁴

Os níveis de contaminação de aflatoxina B₁ empregados e encontrados, a partir de amostras fortificadas, bem como os valores de recuperação e coeficientes de variação, estão apresentados nas Tabelas 1 e 2.

O limite de detecção do equipamento baseado em 3 vezes o ruído do sinal foi de 0,54 ng/g.

Observa-se que os valores obtidos de recuperação para pimenta fortificada com aflatoxina B₁ variaram de 85 a 107% e de 72 a 96% para orégano. As modificações introduzidas, alteração na composição da mistura metanol:água e o tipo de coluna de imunoafinidade empregada, proporcionaram um aumento nos valores de recuperação em relação ao método original, que eram de 76% para pimenta e 57% em orégano, para um nível de contaminação de 20 µg/kg de aflatoxinas.³³ Os valores de coeficientes de variação, em todos os níveis de fortificação, tanto para pimenta quanto para orégano, foram inferiores a 20%. Na análise de micotoxinas consideram-se como aceitáveis valores de recuperação no intervalo de 70 a 120%e coeficiente de variação inferior a 30%.^35,36 Em função dos resultados obtidos, os limites de quantificação do método analítico para pimenta e orégano são, respectivamente, 5,0 e 10,0 µg/kg. Dessa forma, os limites de detecção serão 2,5 e 5,0 µg/kg para pimenta e orégano, respectivamente, conforme Green.³³ Esses valores atendem à Resolução nº34/76 do Ministério da Saúde, que estabelece o limite máximo de 30 mg/kg de aflatoxinas em alimentos.³⁷

Nesse estudo, nenhuma das 30 amostras de pimenta e 20 de orégano estavam contaminadas com aflatoxinas. As características de desempenho do método analítico foram avaliadas apenas para a aflatoxina B₁ pelo fato de somente esta toxina estar incluída no Grupo 1 (provável carcinógeno). Entretanto, em nenhuma das amostras analisadas foram observadas fluorescências características das aflatoxinas G₁, B₂ e G₂ nos seus respectivos R_f.Em Portugal, aflatoxina B₁ foi detectada em 3 das 7 amostras de pimenta branca analisadas, em níveis inferiores a 5,0 µg/kg.² Na Turquia, Erdogan³ avaliando a qualidade de 44 amostras de pimenta, detectou contaminação com aflatoxina B₁ em 11 amostras, utilizando cromatografia em camada delgada, na faixa de 1,1 a 97,5 µg/kg. Bircan,¹⁰ também na Turquia, detectou em 4 das 15 amostras de pimenta preta moída, aflatoxina B₁ em concentração inferior a 5,0 µg/kg. Em um levantamento de pimenta preta feito no Marrocos, Zinedine et al.¹¹ detectaram aflatoxina em 7 das 15 amostras, com níveis inferiores a 1,0 µg/kg. Fazekas et al.¹⁴ avaliaram, na Hungria, o conteúdo de aflatoxinas em 70 amostras de pimenta vermelha moída. Em 18 foi detectado aflatoxina B₁, e em 7 o nível foi superior a 5 µg/kg. No Brasil, Gatti et al.⁹ realizaram um monitoramento em duas das principais regiões produtoras de pimenta (Pará e Espírito Santo) e não detectaram aflatoxinas em 115 amostras de sementes secas de pimenta preta, utilizando a cromatografia em camada delgada como metodologia analítica. Resultados semelhantes foram encontrados por Freire et al.¹³ após analisarem 10 amostras de pimenta branca e preta da região da Amazônia. Semelhantemente, Elshafie et al.¹² em Omã não detectaram aflatoxinas em 105 amostras de condimentos, inclusive pimenta preta.

Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que não há evidência de contaminação por aflatoxina em pimenta e orégano. Entretanto, estudos com pimenta no Brasil revelaram uma alta contaminação com fungos toxigênicos produtores de aflatoxina. Gatti et al.⁹ detectaram em 99,1% das amostras analisadas fungos filamentosos, com 53,5% para o Aspergillus flavus. Foram isoladas 13 espécies de A. flavus, em um total de 56, capazes de produzir aflatoxinas, utilizando a técnica de cromatografia em camada delgada. Da mesma forma, Freire et al.¹³ isolaram um total de 42 espécies em pimenta branca e vermelha, sendo o A. flavus o fungo mais freqüentemente isolado (43,8%). Morais et al.³⁸ observaram, em Minas Gerais, que 56% das amostras de pimenta e orégano apresentavam contagens de fungos superiores a 5,0 x 10³ UFC/g, sendo o A. flavus o fungo mais isolado.

Ressalta-se, dessa maneira, a importância dos procedimentos de pós-colheita, tais como, técnicas de secagem e armazenamento de condimentos, que devem ser cuidadosamente controlados, para minimizar o crescimento de fungos e a possível produção de micotoxinas.

CONCLUSÃO

A metodologia empregada apresentou boa performance analítica para determinação de aflatoxina B₁ em pimenta e orégano.

A metodologia cumpre os limites estabelecidos pela legislação no Brasil para aflatoxina B₁ em alimentos.

Dada a importância da exposição humana à aflatoxina B₁ para a saúde pública e as condições climáticas do Brasil, que favorecem a produção de fungos e produção de micotoxinas, é necessário um constante monitoramento da qualidade dos alimentos oferecidos para os consumidores.

AGRADECIMENTOS

À FUNED (Fundação Ezequiel Dias), à Vigilância Sanitária do Estado de Minas Gerais pelo aporte financeiro e à FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais) pelas bolsas de Produtividade em Pesquisa (G. Prado e M. S. de Oliveira) e de Iniciação Científica (R. A. Souza e M. do C. Alves).

Recebido em 8/1/07; aceito em 6/9/07; publicado na web em 10/3/08

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Jun 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Recebido
  08 Jan 2007
• Aceito
  06 Set 2007