Ação da l-arginina na evolução de retalhos cutâneos de ratos sob exposição à nicotina

Resumos

OBJECTIVE: To evaluate whether treatment with L-arginine influences the healing of skin flaps in rats exposed to nicotine. METHODS: 40 male Wistar rats weighing 142.4 ± 10.1 g were separated into four groups: GC: treatment with 7.4 pH phosphate buffer, submitted to skin flap and observation for ten days; GN: exposure to nicotine for four weeks, submitted to skin flap and observation for ten days; GA: treatment with 7.4 pH phosphate buffer for four weeks, submitted to skin flap and arginine treatment for ten days; GAN: exposure to nicotine for four weeks, submitted to skin flap and treatment with arginine for ten days. We evaluated: areas of necrosis, re-epithelialization, inflammatory reaction and formation of granulation tissue by HE stain; the total area of deposition and differentiation of collagens I and III by histometry with picrosirius staining; and the scar vascular density by immunohistochemical staining with monoclonal anti-CD34 antibodies. RESULTS: The percentages of necrotic areas in GN and GNA were higher (p <0.001) than in GC and GA. In histological scores, collagen deposition, and the percentage of type I collagen, GA and GC were similar to each other (p> 0.05), but higher (p <0.001) than GA and GNA; as for vascular densities, they were lower in GN and GAN (p <0.001) than in GC and GA. CONCLUSION: Exposure to nicotine inhibited the effects of arginine and in unexposed mice there was induction of angiogenesis and improvement in the total collagen deposition in the skin flaps.

Nicotine; Arginine; Collagen; Healing; Patchwork of biological tissue

ARTIGO ORIGINAL

Ação da l-arginina na evolução de retalhos cutâneos de ratos sob exposição à nicotina

Marcus Vinicius Thomé Nora Guimarães^I; Guilherme Henrique Gonçalves Moreira^II; Luana Parminondi Rocha^II; João Eduardo Leal Nicoluzzi TCBC-PR^III; Carlos José Franco de Souza TCBC-PR^III; João Carlos Domingues Repka^IV

^IMestrando do Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da Pontifícia Universidade Católica do Paraná (Curitiba/PR - BR)

^IIMédico residente do Programa de Residência Médica em Cirurgia Geral do Hospital Angelina Caron (Campina Grande do Sul/PR - BR)

^IIIServiço de Cirurgia Geral e Transplantes do Hospital Angelina Caron (Campina Grande do Sul/PR - BR)

^IVCoordenação de Ensino e Pesquisa do Hospital Angelina Caron (Campina Grande do Sul/Pr - BR)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Avaliar se o tratamento com L-arginina influencia a cicatrização de retalhos cutâneos em ratos expostos à nicotina.

MÉTODOS: Foram utilizados 40 ratos Wistar pesando 142,4±10,1g separados em quatro grupos: GC- tratamento com solução tampão fosfatos pH 7,4, confecção de retalho cutâneo, observação por 10 dias; GN- exposição à nicotina por quatro semanas, confecção de retalho cutâneo, observação por dez dias; GA- tratamento com solução tampão fosfatos pH 7,4 por quatro semanas, confecção de retalho cutâneo, tratamento com arginina por dez dias; GAN- exposição à nicotina por quatro semanas, confecção de retalho cutâneo, tratamento com arginina por dez dias. Foram avaliadas as áreas de necrose, re-epitelização, reação inflamatória e formação de tecido de granulação, pela coloração HE, a área de deposição total e a diferenciação de colágenos I e III por histometria com a coloração de picrosirius, e, através da marcação imunoistoquímica com anticorpo monoclonal anti-CD34, a densidade vascular cicatricial.

RESULTADOS: As porcentagens de áreas de necrose de GN e GNA foram maiores (p<0,001) do que GC e GA. Nos escores histológicos, a deposição de colágeno e a porcentagem de colágeno tipo I, no GC e GA foram similares (p>0,05) e maiores (p<0,001) do que em GA e em GNA e, nas densidades vasculares, GN e GAN foram menores (p<0,001) do que em GC e em GA.

CONCLUSÃO: A exposição à nicotina inibiu os efeitos da arginina, e nos ratos não expostos, induziu melhora na angiogênese e na deposição de colágeno total nos retalhos cutâneos.

Descritores: Nicotina. Arginina. Colágeno. Cicatrização. Retalhos de tecido biológico.

INTRODUÇÃO

O tabagismo é apontado como a principal causa de morte evitável no mundo e no Brasil, estima-se que 22,4% da população seja tabagista¹. O hábito tabágico é apontado como causa de alterações cicatriciais secundárias aos efeitos maléficos da nicotina na vascularização, especialmente em retalhos cutâneos, e alternativas para evitar esses efeitos têm sido motivo de investigações científicas².

A cicatrização de feridas é um processo dinâmico que envolve fenômenos bioquímicos e fisiológicos³. Nesse contexto, estudos experimentais demonstram que a complementação da dieta com arginina, em ratos, aumenta a força tênsil do tecido lesionado em processo cicatricial e a deposição de colágeno^4,5.

A arginina, um aminoácido semiessencial, precursora do óxido nítrico, da ornitina e da prolina, entre outras moléculas, é recrutada nas fases agudas e crônicas da cicatrização. O catabolismo da arginina em feridas em cicatrização ocorre por duas principais vias, as isoenzimas, que sintetizam óxido nítrico, e as duas isoenzimas arginases⁶.

Foi descrita a influência da nicotina no comprometimento do relaxamento do endotélio, na patogênese da isquemia de retalhos cutâneos e o potencial uso de substâncias precursoras de óxido nítrico para a prevenção ou tratamento desses processos isquêmicos^7,8.

Assim sendo, destaca-se a L-arginina como precursora fisiológica da síntese de óxido nítrico^2,9. Considerando o efeito antiangiogênico induzido pelo hábito tabágico e a busca de alternativas que possam prover aos pacientes tabagistas uma melhor condição cicatricial pós-operatória, do ponto de vista angiogênico, e, também, considerando o efeito do óxido nítrico como catabólito da arginina, para estimular a angiogênese, o presente estudo tem por objetivo avaliar se o tratamento com arginina em ratos previamente expostos à nicotina e submetidos à confecção de retalhos cutâneos, influencia a angiogênese no processo cicatricial desses retalhos.

MÉTODOS

Utilizaram-se 40 ratos Wistar (Rattus norvegicus, Rodentia Mammalia), não isogênicos, pesando 142,4 ± 10,1g, obtidos do biotério da Universidade Federal do Paraná. A amostra foi dividida em quatro grupos de cinco (Tabela 1). Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno adequadas para a espécie e mantidos em ambiente específico, com temperatura e umidade controladas sob ciclos de iluminação automaticamente regulados a cada 12 horas. Receberam ração específica para a espécie e água ad libitum. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Animais do Hospital Angelina Caron, conforme protocolo 018/09.

Os ratos dos grupos N e NA (Tabela 1) foram expostos à nicotonia na dose de 2mg/kg/dia em duas inoculações diárias de 1mg/kg/SC , com intervalo de 12 horas. Foi utilizada nicotina (SIGMA^® - N 5260), em solução aquosa a 20% preparada em tampão fosfatos pH 7,4, esterilizada por filtração em membranas MF (millipore membrane-SCWP304F0 Millipore^®)^10-12.

Os tratamentos com L-arginina foram efetuados diariamente por via SC nos ratos dos grupos A e NA (Tabela 1), na dose de 300mg/kg/dia¹³. Foi utilizada L-arginina (Merck^®) diluída a 20% em solução tampão fosfatos pH 7,4, esterilizada por filtração em membranas MF.

Os tratamentos solução tampão fosfatos pH 7,4 foram efetuados diariamente por via SC nos ratos dos grupos C, A e N (Tabela 1), em doses equivalentes aos pesos. Foi utilizada solução tampão fosfatos pH 7,4, esterilizada por filtração em membranas MF.

Para o procedimento cirúrgico, os ratos foram anestesiados por via IM com a associação de 100mg/kg de cloridrato de cetamina e 10mg/kg de cloridrato de xilasina. Após tricotomia da região dorsal e antissepsia com álcool iodado, procedeu-se a marcação da área retangular do retalho que se estendeu desde o ângulo inferior das escápulas até 8cm no sentido caudal, com largura de 4cm. Foi realizada incisão envolvendo a pele e o tecido subcutâneo nas bordas direita, esquerda e caudal da marcação do retalho. A área cutânea foi a descolada e, em seguida, reposicionada em seu leito de origem, sendo fixada com oito pontos simetricamente distribuídos de nylon monofilamentar 6.0 ^10,11. Foram realizados curativos diários, por dez dias, no dorso para proteção dos retalhos.

A quantificação da área de necrose dos retalhos cutâneos se deu com os animais sedados por inalação com halotano, foram obtidos moldes em folhas plásticas do retalho que evidenciavam as áreas de tecido vascularizado viável e tecido necrosado que foram escaneados. A seguir, as imagens geradas foram analisadas através de escalas padronizadas pelo programa Paint-Autocad-2002^® e realizada análise planimétrica dos retalhos, registrando-se em centímetros quadrados a área total, área de tecido vascularizado viável e área de tecido necrosado¹⁰.

Após a morte dos animais, induzida por inalação letal de halotano em circuito fechado, foram coletados três fragmentos de pele e tecido subcutâneo das áreas de suturas dos retalhos, identificadas como BD (borda direita), BE (borda esquerda) e BC (borda caudal) que foram imediatamente colocados em frascos com solução de formalina tamponada para fixação da amostra.

Para avaliação histológica cicatricial, as três amostras de cada retalho cutâneo foram submetidas às preparações pelo método de coloração pela Hematoxilina e Eosina (HE) e analisadas conforme os parâmetros histológicos de re-epitelização, reação inflamatória e formação de tecido de granulação. Para cada parâmetro foi estabelecido um escore e o resultado de cada amostra foi a média obtida dos três fragmentos BD, BE e BC, de maneira que cada grupo de animais teve um escore final, permitindo assim a classificação dos grupos em três fases do processo cicatricial.

A avaliação quantitativa do colágeno existente na linha de sutura do retalho cutâneo foi feita pela coloração pelo Picrosirius para reconhecer, ao microscópio com luz polarizada, a densidade total do colágeno e as frações de colágeno I (maduro) e III (imaturo), pois as fibras mais espessas e fortemente birrefringentes apresentam-se coradas em tons de laranja a vermelho (colágeno I) e as fibras mais finas e dispersas, fracamente birrefringentes coradas de verde (colágeno III)¹⁴. Para as avaliações quantitativas as imagens foram captadas por uma câmera fotográfica, transmitidas a um monitor colorido, e digitalizadas. Realizou-se a análise das imagens usando o aplicativo Image-Plus^® 4.5 em microcomputador. Foram analisados em cada corte o percentual de área ocupada pelas fibras vermelhas e amarelas (colágeno I) e verdes (colágeno III). Para cada amostra, área total de colágeno e as porcentagens dos tipos I e III foram obtidas pelas médias dos três fragmentos BD, BE e BC¹⁵.

As três amostras de cada retalho foram também submetidas às preparações pelo método imunoistoquímico, para pesquisa do marcador CD34 como parâmetro da avaliação da densidade vascular cicatricial¹⁵. Foi empregado o anticorpo monoclonal anti-CD34, clone QBEnd10 (Dako^®) e as contagens foram executadas nas áreas com maior número de capilares e pequenas vênulas, em três campos distintos utilizando-se magnificação de 200X. Para as contagens dos microvasos foram consideradas as células coradas em marrom, tanto isoladas quanto agrupadas. Para cada amostra a densidade vascular cicatricial foi estabelecida pela média dos três fragmentos BD, BE e BC.

A avaliação da normalidade da distribuição dos resultados foi feita pelo teste de Kolmogorov-Smirnov e expressas como média ± desvio padrão. As variáveis foram testadas por meio de análise de variância (ANOVA) e os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

RESULTADOS

Os grupos nicotina (GN) e arginina-nicotina (GNA) apresentaram porcentagens médias de 23,7±7,7 e 17,4±7,1 de áreas de necroses, sendo significantemente maiores que o controle (GC), que apresentou 7,1±3%. O grupo arginina apresentou média de 6,5±3,1% e não diferiu do GC (Figura 1).

A análise dos escores médios das avaliações histológicas dos retalhos cutâneos demonstrou que os grupos controle e tratados com arginina apresentaram escores similares quanto aos critérios re-epitelização (p>0,05), reação inflamatória (p>0,05) e formação de tecido de granulação (p>0,05), cujos escores foram significantemente maiores que os observados nos grupos de ratos expostos à nicotina (GA) e expostos à nicotina e tratados com arginina (Figura 2).

A avaliação da síntese de colágeno demonstrada pelas médias das avaliações histométricas das áreas totais de colágeno, representativas das amostras das bordas direita, esquerda e caudal dos retalhos cutâneos foram significantemente maiores nos grupos controle e arginina do que as médias observadas nos grupos de ratos expostos à nicotina (GA) e expostos à nicotina e tratados com arginina (Figura 3).

Da mesma forma, a avaliação das médias histométricas de colágeno maduro, representativas das amostras das bordas direita, esquerda e caudal dos retalhos foram significantemente maiores nos grupos controle e arginina do que as médias observadas nos grupos de ratos expostos à nicotina (GA) e expostos à nicotina e tratados com arginina (Figura 4).

Houve diferenças significantes nas médias das contagens de vasos marcados pelo anticorpo anti-CD34 entre as bordas direta, esquerda e caudal entre os grupos avaliados. Destacam-se as médias observadas na borda caudal, em todos os grupos avaliados, menores do que as médias das outras bordas do retalho cutâneo. Nas avaliações estatísticas entre as médias dos fragmentos BD, BE e BC por grupos, observou-se que os grupos GN (4,3±1,5) e GAN (2,9 ±1,1) foram significantemente menores do que o GC (6,3±1,9) e o GA (8,9±1,8) (Figura 5).

DISCUSSÃO

Os efeitos deletérios do tabagismo estão diretamente associados ao número de cigarros consumidos por dia, que é o fator que determina nos modelos experimentais a intensidade diária da exposição à nicotina¹⁶.

No presente estudo, a dose de nicotina administrada aos ratos foi 2mg/kg por quatro semanas, equivalente a alta exposição à droga, mimetizando um quadro de tabagismo acentuado¹⁶.

O tema isquemia e angiogênese no modelo experimental retalho cutâneo dorsal proposto por Macfarlane¹² é intensamente utilizado para avaliar outras estratégias experimentais para a melhora da necrose distal do referido retalho.

Em resumo, nesse modelo, foram descritos os efeitos de substâncias antioxidantes como vitamina C, vitamina E e gingko-biloba, com menor dano tecidual e aumento da neovascularização¹⁷.

A associação de manitol com vitamina C reduziu, mas não impediu, a ocorrência de necrose¹⁸. A iontoforese, como forma de administração de cloridrato de hidralazina, não foi eficaz para o aumento da área de viabilidade do retalho, porém, quando associada à histamina, por essa mesma via, verificou-se aumento da área de viabilidade¹⁹, da mesma forma o minoxidil²⁰.

A associação entre a pentoxifilina e o cloridrato de buflomedil foi avaliada na sobrevida dos retalhos induzidos em ratos expostos à nicotina, em doses que produzem níveis comparáveis a de fumantes humanos.

Verificou-se que a associação entre as drogas melhorou a resposta clínica com a sobrevida dos retalhos, e os autores consideraram como associação eficaz na reversão dos efeitos causados pela nicotina²¹.

A dose de 2mg/kg de nicotina e forma de administração SC utilizadas no presente estudo foram empregadas também para a avaliação dos efeitos da terazosina, um neurorreceptor antagonista, e demonstraram sua eficácia na prevenção da necrose, porém, quando associada ao propranolol, um bloquedor de receptores beta, o efeito protetor da reação necrótica anteriormente observada não ocorreu²².

Taxas de necrose em retalhos cutâneos dorsais de ratos de 28,5% no grupo controle e de 45,7% no grupo exposto à nicotina por sete dias no pré-operatório e sete dias no pós-operatório foram relatadas em estudos com metodologia diferente do presente trabalho, pois os retalhos eram mais longos e, por isso, mais isquêmicos, e a exposição à nicotina foi feita pela via inalatória^23,24.

No presente estudo, o tratamento diário com 300mg/kg com a arginina, durante o pós-operatório de dez dias, não impediu, mas minimizou a ocorrência de necrose nos retalhos dorsais dos ratos nos grupos GA (6,5±3,1%) e GAN (17,4±7,1%). A utilização da arginina, em estudo experimental de retalho miocutâneo, pediculado e dorsal, foi relacionada com a queda das concentrações sanguíneas, de piruvato, lactato e corpos cetônicos no 14^o dia. Os autores sugeriram a ocorrência de maior utilização desses metabólitos pelos tecidos em cicatrização, por possível ação anabólica da oferta de L-arginina, e concluíram que a suplementação de L-arginina tem efeito sobre as concentrações séricas de substratos e sobre a cicatrização cutânea e muscular²⁵.

A nossa explicação para a síntese deficiente de colágeno nos ratos expostos à nicotina era de que os retalhos isquêmicos, decorrentes da exposição à nicotina, geravam tensões que só permitiam a divisão celular do fibroblasto, já que uma tensão maior era requerida para síntese de colágeno, o que foi verificado com a administração oral de L-arginina²⁶.

No presente estudo houve diferenças significantes entre os grupos nos três critérios histológicos avaliados: re-epitelização (p=0,0335), reação inflamatória (p<0,001) e formação de tecido de granulação (p<0,001).

Na comparação entre os pares de grupos, quanto à re-epitelização não houve diferença significante (p>0,05). A análise da reação inflamatória mostrou que o GC apresentou resultados significativamente melhores do que GN e GAN (p<0,001); da mesma forma, o GA em relação ao GAN (p<0,001).

Quanto à formação de tecido de granulação, que traduz a fase proliferativa do processo cicatricial, observou-se a mesma tendência que o critério anterior, pois o GC apresentou resultados significativamente melhores do que GN e o GAN (p<0,001); o mesmo quanto ao GA em relação ao GAN (p<0,001).

As alterações histológicas na cicatrização dos retalhos cutâneos dos ratos expostos à nicotina, no presente estudo, não diferiram dos achados histológicos de outros autores^26,27, ou seja, ocorreram alterações significativas nas avaliações dos critérios de re-epitelização, reação inflamatória e formação de tecido de granulação. Estes autores salientaram que as alterações descritas eram decorrentes da diminuição da pO₂ tecidual, uma vez que essa diminuição é consequência dos efeitos da nicotina, como verificado anteriormente que a boa cicatrização depende fundamentalmente da oferta de oxigênio aos tecidos^27,28,, fortalecendo assim os achados deste trabalho, que, através da confecção de um retalho isquêmico e exposto à nicotina, uma droga sabidamente vasoconstritora, seguido de tratamento pela arginina, as médias dos escores dos padrões histológicos apresentaram-se mais próximas às do grupo controle.

No presente estudo, o GC demonstrou média de colágeno total significantemente mais elevada do que o GN e GAN (p<0,001), porém, não demonstrou diferenças quando em comparação ao grupo GA (p>0,05), cuja média foi maior do que a do GC. O GN demonstrou média significantemente (p<0,001) menor do que o GA, mas semelhante ao GAN (p>0,05). O GA mostrou média significantemente maior do que o GAN (p<0,01).

A dose de nicotina utilizada por Salles Júnior et al¹⁰ induziu a diminuição do fluxo sanguíneo nos pontos mais distais de em retalhos cutâneos em ratos e avaliados por fluxometria à laser e, de modo similar no presente estudo, diminuiu a proporção entre as taxas de colágenos tipo I e tipo III.

Quanto ao colágeno tipo I, considerando a média porcentual dos três fragmentos (BD, BE e BC) no GC foi significantemente maior (p<0,001) do que no GN e no GAN. O GA foi significantemente maior do que o GN (p<0,001) e também que o GAN (p<0,01) e, quanto a esses achados do presente estudo, pode-se inferir um efeito da arginina.

Essas afirmações foram reiteradas por outros autores²⁶, que inferiram ser a deposição de colágeno, a epitelização e a angiogênese, fenômenos dependentes da oxigenação tecidual. A cicatrização retardada observada no grupo exposto à nicotina (GN) e exposto à nicotina e tratado pela L-arginina (GAN) pode ser explicada pela diminuição da proliferação de fibroblastos e macrófagos induzidos pela nicotina².

Poucos são os estudos que informam a densidade vascular cicatricial nas condições experimentais avaliadas no presente estudo, ou seja, pelas médias das contagens de vasos marcados pelo anticorpo anti-CD34, entre as bordas direita, esquerda e caudal nos grupos avaliados; demonstrou na borda caudal, em todos os grupos, médias menores que as das outras bordas do retalho cutâneo. Após serem obtidas as médias dos fragmentos BD, BE e BC por grupos, observou-se que os grupos GN e GAN foram significantemente menores do que o GC e o GA (p<0,001).

Intensamente difundido é o fato de a arginina ser precursora do ON e esse, por sua vez, dispõe de propriedades terapêuticas, como a estimulação da resposta imunológica, o auxílio no processo de cicatrização, a vasodilatação e a angiogênese²⁹.

Em estudo experimental, com método similar ao do presente estudo, com o objetivo de avaliar a marcação imunoistoquímica com anticorpos monoclonais anti-CD34, a influência da L-arginina no desenvolvimento microvascular do intestino delgado de suínos desmamados precocemente, foi descrito que a suplementação alimentar com 0,7% de L-arginina reforça a expressão de fatores angiogênicos no intestino delgado. No entanto, a suplementação excessiva com L-arginina (1,2%) induziu estresse e disfunção intestinal³⁰.

O tratamento com arginina, na dose de 300mg/kg, demonstrou, no processo cicatricial de retalho cutâneo em ratos não expostos à nicotina, indução de angiogênese e aumento da deposição de colágeno total. Nos ratos expostos à nicotina, não foram observados efeitos relacionados com melhora da área de necrose, do padrão histológico, da deposição e maturação de colágeno e aumento na densidade vascular cicatricial.

Recebido em 21/05/2012

Aceito para publicação em 30/07/2012

Conflito de interesse: nenhum

Fonte de financiamento: nenhuma

Trabalho realizado no Programa de Pós-Graduação em Cirurgia da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, PR, Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Mar 2013
• Data do Fascículo
  Fev 2013

Histórico

• Recebido
  21 Maio 2012
• Aceito
  30 Jul 2012