O corrência natural de desoxinivalenol e toxina T-2 em milho pós-colheita

Natural occurrence of desoxinivalenol and toxin T-2 in recently harvested corn

OCORRÊNCIA NATURAL DE DESOXINIVALENOL E TOXINA T-2 EM MILHO PÓS-COLHEITA¹

PRADO², Guilherme; OLIVEIRA², Marize Silva; FERREIRA², Solange Oliveira; CORRÊA³, Tânia Barreto Simões; AFFONSO³, Beatriz Ramalho Ramos

RESUMO

Foi verificada a incidência natural de desoxinivalenol (DON) e toxina T-2 em 115 amostras de milho em grão, pós-colheita, procedentes de diferentes localidades do Brasil, Argentina e Paraguai, safra 1994/1995. Os grãos de milho foram obtidos da Associação Brasileira de Milho. DON foi extraído do grão com acetonitrila-água (84+16) e o extrato foi submetido a uma purificação em coluna de carvão ativo, alumina e Celite. A detecção foi feita por cromatografia em camada delgada, impregnando a placa com solução de cloreto de alumínio, aquecida após desenvolvimento e visualização em luz ultravioleta (366 nm). Para a toxina T-2, um método direto e competitivo de ELISA foi utilizado, após extração da amostra com metanol a 70%. As recuperações médias para o DON e toxina T-2 foram superiores a 70%. O limite de detecção foi cerca de 90 ng/g e 50 ng/g, para DON e toxina T-2, respectivamente. DON foi detectado em 7 das amostras (102-542 ng/g) e a toxina T-2 em uma amostra (104 ng/g).

Palavras-chave: Desoxinivalenol; toxina T-2; milho.

SUMMARY

NATURAL OCCURRENCE OF DESOXINIVALENOL AND TOXIN T-2 IN RECENTLY HARVESTED CORN. One hundred and fifteen samples of postharvest corn from the 1994/1995 season, from different locations of Brasil, Argentina and Paraguay, were examined for deoxynivalenol (DON) and T-2 toxin. The samples were obtained from the Brazilian Corn Association. DON was extracted with acetonitrile - water (84 + 16) and the extract submitted to a cleanup on a charcoal - alumina - Celite colunm. The detection was performed on silica gel TLC plates impregnated with aluminum chloride solution. After development the plates were heated and examined under UV light (366 nm). An enzyme-linked immunoassay (ELISA), direct and competitive, was employed for the detection and quantitation of T-2 toxin. The average recoveries for DON and T-2 toxin were above 70%. The detection limits were 90 ng/g for DON and 50 ng/g for T-2 toxin. DON was found in 7 of the samples (102 - 542 ng/g) and T-2 toxin in one sample (104 ng/g).

Key-words: Deoxynivalenol; T-2 toxin; corn.

1 — INTRODUÇÃO

O Brasil é um dos maiores produtores de milho da América do Sul, tendo sido responsável por aproximadamente 75% do total produzido no subcontinente em 1993. A cultura do milho na agricultura brasileira é considerada de grande importância econômica, ocupando uma das maiores áreas plantadas entre as culturas agrícolas, com ampla distribuição do norte ao sul do país (17).

Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos, que podem contaminar os grãos de cereais no campo, durante a colheita e armazenamento, e mesmo até antes do consumo, em condições bioclimáticas favoráveis, como chuva excessiva, danos por insetos e estresse da planta (4, 26).

Os tricotecenos são um grupo de metabólitos secundários produzidos por várias espécies de Fusarium, Myrotheciun, Trichoderma, Cephalosporium e outros fungos, caracterizados por uma estrutura sesquiterpenóide com uma dupla ligação na posição C-9-C-10 e um anel epóxido na posição C-12-C-13. Esses compostos estão envolvidos em intoxicação humana e animal, cujos sintomas incluem náusea, vômitos, distúrbios visuais, e em casos de animais de fazenda, recusa alimentar, redução do ganho de peso, diminuição do glicogênio hepático, hipoglicemia e imunossupressão (1, 5, 7, 24).

Entre os tricotecenos, desoxinivalenol (DON) e toxina T-2 são os mais importantes metabólitos fúngicos produzidos por espécies de Fusarium (8, 20, 23), sendo o DON o mais comumente encontrado em grãos de cereais (30, 32).

No Brasil, poucos são os trabalhos que relatam a presença dessas toxinas em grãos para consumo humano. SABINO et al. (28) não detectaram o DON em 46 amostras de milho em grão procedentes de alguns estados brasileiros e em 16 originárias dos Estados Unidos. Em trigo, de 70 amostras, apenas duas amostras estavam contaminadas com 183 ng/g de DON. FURLONG et al. (15) observaram que em 20 amostras de trigo pós-colheita, originárias de São Paulo (Brasil), quatro estavam com DON (470-590 ng/g ) e duas com toxina T-2 (400-800 ng/g). Em outro levantamento, o DON foi encontrado em uma amostra de trigo brasileiro (400 ng/g), coletado em silos do Rio Grande do Sul. A toxina T-2 foi detectada em duas amostras (350 e 360 ng/g), em trigo importado e armazenado em silos daquele estado (14). POZZI et al. (25) analisaram no período de maio de 1991 a maio de 1992, 130 amostras de milho pós-colheita e armazenado (10 e 120 amostras, respectivamente), originárias de Ribeirão Preto (São Paulo, Brasil). DON não foi dectado em nemhuma das amostras.

O objetivo deste trabalho foi detectar e quantificar o DON e a toxina T-2, em milho pós-colheita, de alguns estados brasileiros e países da América do Sul.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Amostragem

Amostras de milho em grão procedentes de alguns estados do Brasil (Paraná, Santa Catarina, Goiás, Mato Grosso) da Argentina e Paraguai, safra 1994/1995, fornecidas pelos cooperados da ABIMILHO, foram coletadas segundo metodologia descrita por FONSECA (12). Posteriormente, dois quilogramas foram moídos, passados em tamis 20 mesh e analisados imediadamente.

2.2 – Metodologia

2.2.1 – Da determinação de desoxinivalenol.

A. Dissolução do padrão e determinação da concentração da solução padrão

Desoxinivalenol (1 mg) foi dissolvido em acetato de etila (5 mL) sob agitação vigorosa. Posteriormente, foi lida a absorvância (A) a 260 nm. A concentração do padrão foi determinada a partir do seu peso molecular (296) e a absortividade molar de 1410 (3, 28).

B. Determinação da recuperação de desoxinivalenol adicionado ao milho.

Amostras de milho, isentas de micotoxinas, em duplicata, foram contaminadas com quantidades variáveis de solução padrão de desoxinivalenol, cuja concentração foi determinada como descrito no item A. Após duas horas, foi feita a extração, purificação e quantificação (3, 31).

C. Quantificação em amostras de milho

A metodologia utilizada envolveu extração com acetonitrila-água, partição com hexano, purificação em coluna com carvão ativo:celite:alumina, concentração em atmosfera de nitrogênio, dissolução em clorofórmio:acetonitrila, separação por cromatografia em camada delgada em placa previamente embebida em solução de cloreto de alumínio a 15% e quantificação visual sob luz ultra-violeta de comprimento de onda longa (366 nm) por comparação com padrão, em aparelho Chromatovue-Camag. (3, 31).

A confirmação foi feita por cromatografia em camada delgada de alta eficiência utilizando cloreto de alumínio a 20% como agente revelador (9).

2.2.2 – Da determinação de toxina T-2

A metodologia utilizada foi a "enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) direta e competitiva. Nesse tipo de ensaio, o anticorpo é fixado em uma superfície sólida e exposto inicialmente à amostra teste, que pode conter a micotoxina livre e, posteriormente, ao conjugado enzima-micotoxina, o qual compete com a micotoxina livre pelo sítio de ligação do anticorpo. As cavidades da microplaca são então lavadas e o substrato de enzimas é adicionado. A reação que se processa é catalizada pela enzima e, como resultado, pode ser observada uma variação de cor, pela conversão do substrato em produto. A determinação quantitativa é feita então em leitora de ELISA a 650 nm, comparando-se as absorvâncias das amostras com as dos padrões de 0, 150, 500 e 1500 ng/g de toxina T-2, aplicando o modelo matemático adotado por FINNEY (11). Quanto maior a intensidade da coloração, menor é a concentração da toxina na amostra (2, 6 ).

Foram utilizados kits da Neogen Corporation (USA), de acordo com o procedimento analítico descrito pelos fabricantes e dentro do prazo de validade especificado (6 meses). A extração da toxina T-2 foi feita em 5g de amostra com 25 mL de metanol a 70%, seguido de agitação em alta rotação por 3 minutos e filtração em papel Whatman Nº 1. A partir de uma alíquota do filtrado procedeu-se a reação imunológica conforme indicado pelo fabricante. As análises foram efetuadas em duplicata.

A. Determinação da recuperação de Toxina T-2 adicionada ao milho

A recuperação do método de ELISA foi estudada contaminando artificialmente 5g da amostra moída, em triplicata, para conter em cada amostra, níveis de toxina T-2 dentro da faixa de concentração dos controles existentes nos kits (0 a 1500 ng/g ). As amostras foram submetidas ao contato com os padrões por 30 minutos antes da extração e da execução da reação imunológica (10).

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados de recuperação e coeficientes de variação estão apresentados na Tabela 1. O limite de quantificação para o DON foi de 111 ng/g, sendo que os valores de recuperação e coeficientes de variação foram de 70 a 110% e 6 a 11%, respectivamente, na faixa de concentração de 92 a 617 ng/g, demonstrando a adequação do método na quantificação de DON. Valores semelhantes foram encontrados por TRUCKSESS et al. (31) e SABINO et al. (28).

Para a toxina T-2 os resultados de recuperação e coeficientes de variação foram de 88 a 98% e 5 a 26%, respectivamente, na faixa de concentração de 375 a 1500 ng/g. Os valores encontrados são aceitáveis em análises de teores da ordem de ng/g (16).

A incidência de DON e toxina T-2 estão apresentados na Tabela 2. Observou-se que apenas uma das amostras continha a toxina T-2 (104 ng/g ) e em 7 foi detectado o DON (102-542 ng/g ). Os resultados encontrados sugerem que o milho do Brasil está igual ou menos contaminado, quando comparado com outros países do mundo, onde estudos de incidência já foram realizados.

Na Coréia, 38 amostras de cereais foram avaliadas, e em 7 foram detectadas o DON (168-506 ng/g ). A toxina T-2 não foi detectada em nenhuma das amostras (23). Em outro estudo, também conduzido na Coréia, 46 amostras de milho foram examinadas no período de 1991/1992, sendo que 30 (65,2%) estavam contaminadas com DON (29-2752 ng/g), com valor médio de 310 ng/g (18). Na região da Ucrânia e Rússia Européia, de 40 amostras de milho investigadas, duas continham DON e uma toxina T-2, com o nível máximo de 2,4 e 3,3 mg/Kg, respectivamente (21).

SYDENHAM et al. (29) examinaram amostras de milho mofadas da África do Sul e observaram ausência de níveis detectáveis de toxina T-2. O DON estava presente em todas as amostras em níveis de 0,05 a 12,10 µg/g. LAUREN et al.(19) verificaram que amostras de milho da Nova Zelândia estavam altamente contaminadas com o DON (97 a 100%), com nível máximo de 8,5, 3,4 e 4,8 µg/g, nos anos agrícolas de 1992, 1993 e 1994, respectivamente. RAVA (27) observou que o nível médio de contaminação com DON, de vários produtos de milho branco e amarelo da África do Sul, foi de 87 e 157ng/g, respectivamente. Não foi detectada a toxina T-2.

Para verificar o potencial de contaminação de alimentos para consumo humano, ABZOUZIED et al. (1) analisaram 25 amostras de produtos a base de milho, vendidos em lojas de produtos naturais em Michigam (USA) e observaram que 16 amostras apresentavam níveis de DON na faixa de 1,2 a 19,9 µg/g, com valores médios de 3,4 µg/g. Na Nigéria, em 12 amostras de milho mofadas, colhidas em 1991, 3 apresentavam DON (4,0 a 18,8 µg/g ), sendo que a toxina T-2 não foi detectada (22).

Poucos países apresentam regulamentação para essas toxinas em alimentos. A ex. U. R. S. S. tem um nível máximo permitido de 1000 ng/g para DON em cereais, e o Canadá e a Áustria, 2000 ng/g e 500 ng/g, respectivamente, para trigo. Para a toxina T-2, Israel e U. R. S. S. apresentam nível de tolerância: 100 ng/g em grãos para rações e cerais, respectivamente. O Brasil não possui nemhuma legislação para tricotecenos em alimentos e rações (13). O presente estudo, apesar de abordar uma pequena parte da produção brasileira, enfatiza a necessidade do monitoramento e controle de tricotecenos em milho e em outros cereais no Brasil, permitindo fornecer subsídios para uma regulamentação oficial.

O fato dos tricotecenos, e em especial o DON e a toxina T-2, não serem destruídos durante o processamento usado para preparar produtos de milho para consumo humano (4) e a alta prevalência de espécies de Fusarium em milho do Brasil (25), devem ser motivos para os Ministérios da Saúde e da Agricultura estabelecerem valores de tolerância para DON e toxina T-2 em cereais e rações.

4 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS E CRÉDITOS

Os autores agradecem à EMBRAPA e à FAPEMIG pelo financiamento desse trabalho. A autora Solange O. Ferreira é bolsista de Aperfeiçoamento Científico da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG).

² Fundação Ezequiel Dias - Rua Conde Pereira Carneiro, 80 Gameleira. Belo Horizonte/Minas Gerais - 30510-010.

³ EMBRAPA/CTAA - Guaratiba - Rio de Janeiro.

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¹

Recebido para publicação em 23/07/97. Aceito para publicação em 02/12/97.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Dez 1997

Histórico

• Aceito
  02 Dez 1997
• Recebido
  23 Jul 1997