Comparação do isolamento microbiológico e da reação em cadeia da polimerase no diagnóstico de salmonelose em bezerros infectados experimentalmente com Salmonella Typhimurium

Comparison of microbiological culture and polymerase chain reaction in the diagnosis of salmonellosis in Salmonella Typhimurium-infected calves

bovinos; fezes; isolamento bacteriano; Salmonella Typhimurium

cattle; feces; bacteriological isolation; Salmonella Typhimurium

COMUNICAÇÃO

Comparação do isolamento microbiológico e da reação em cadeia da polimerase no diagnóstico de salmonelose em bezerros infectados experimentalmente com Salmonella Typhimurium

Comparison of microbiological culture and polymerase chain reaction in the diagnosis of salmonellosis in Salmonella Typhimurium-infected calves

D.G. Silva^I; L.G. Ávila^II; R. Berg^III; D.R. Silva^I; S.O. Conde^IV; M.V.F. Lemos^IV; J.J. Fagliari^IV

^IAluna de pós-graduação - FCAV-UNESP - Jaboticabal, SP

^IIAluna de pós-graduação - Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba - FMVA-UNESP - Araçatuba, SP

^IIIAluna de graduação - FCAV-UNESP - Jaboticabal, SP

^IVFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - FCAV-UNESP. Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, s/n 14884-900 - Jaboticabal, SP

Palavras-chave: bovinos, fezes, isolamento bacteriano, Salmonella Typhimurium

ABSTRACT

The efficiency of microbiological culture and polymerase chain reaction (PCR) for detection of Salmonella Typhimurium is compared in fecal samples of Holstein calves experimentally infected with 10⁹ CFU of Salmonella Typhimurium. Seventy-two fecal samples were analyzed by microbiological culture and PCR associated with selenite cystine (SC) and Muller-Kauffmann tethrationate (TMK) selective enrichment broths. Regardless of the selective enrichment broth, the microbiological culture was significantly better than PCR for detection of positive samples of Salmonella Typhimurium. The selective enrichment broths SC and TMK had no effect on the efficiency of the microbiological culture. The SC broth was the best option as selective enrichment associated to PCR.

Keywords: cattle, feces, bacteriological isolation, Salmonella Typhimurium

As diarreias de bezerros recém-nascidos representam uma das principais causas de prejuízos à criação de bovinos, sendo a salmonelose uma das infecções naturais mais frequentes, principalmente aquelas relacionadas aos sorotipos Salmonella Typhimurium e Salmonella Dublin (Santos et al., 2002).

O método de isolamento tradicional da Salmonella inclui as etapas de pré-enriquecimento e/ou enriquecimento direto (seletivo), plaqueamento em meios semi-sólidos, análise bioquímica e tipificação sorológica (Paiva et al., 2006). Estes métodos de cultivo são muito utilizados, porém os resultados demoram de quatro a sete dias, podendo ocorrer falso-negativos quando a quantidade de bactérias na amostra é pequena (Oliveira et al., 2005). Vários métodos alternativos para detecção de Salmonella têm sido desenvolvidos. A reação em cadeia da polimerase (PCR), associada aos caldos de enriquecimento seletivo, tem sido considerada uma técnica promissora por facilitar e agilizar o diagnóstico de salmonelose a partir de amostras de fezes, uma vez que permite a multiplicação da bactéria-alvo e dilui células mortas e substâncias inibidoras da PCR (Schrank et al., 2001).

O objetivo do estudo foi avaliar a eficiência do isolamento microbiológico e da PCR, com a utilização de dois caldos seletivos de enriquecimento (selenito cistina e tetrationato Muller-Kauffmann), no diagnóstico da salmonelose em bezerros infectados experimentalmente com Salmonella Typhimurium.

Foram avaliadas amostras de suabes retais de 12 bezerros da raça Holandesa, com 10 a 15 dias de idade, distribuídos aleatoriamente em dois grupos experimentais, compostos de seis bezerros cada. Os do grupo 1 receberam, via oral, 10mL de caldo Brain Heart Infusion (CM0225, Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England) (BHI), e os do grupo 2 receberam, também pela via oral, 109 UFC de Salmonella Typhimurium (registro IOC 6333/06) diluídas em 10mL de caldo BHI. As amostras de suabes retais de cada bezerro foram colhidas em duplicata imediatamente antes da inoculação e, em seguida, a cada 24 horas até o final do experimento, ao sexto dia após a inoculação, totalizando 72 amostras. O estudo teve aprovação da Comissão de Ética e Bem-Estar Animal (CEBEA-FCAV), Protocolo nº 009986-07.

O isolamento microbiológico de Salmonella Typhimurium foi realizado a partir do enriquecimento dos suabes retais nos caldos selenito cistina (CM0699, Oxoid) (SC) e tetrationato Muller-Kauffmann (CM0343, Oxoid) (TMK), seguido de plaqueamento em ágar verde brilhante modificado (CM0329, Oxoid), testes bioquímicos presuntivos (ágar tríplice açúcar e ferro (CM0277, Oxoid) - TSI e ágar lisina ferro (CM0381, Oxoid) - LIA) e confirmação sorológica (soros polivalentes anti-O e anti-H de Salmonella)(Probac do Brasil, São Paulo, SP, Brasil).

Alíquotas dos caldos TMK e SC foram submetidas à extração de DNA pelo método salting-out, segundo metodologia descrita por Silva (2007). A PCR foi realizada em volume final de 25µL, com 5µL de amostra de DNA adicionados a 20µL da mistura de reação contendo 3,5mM de MgCl2; 75µM de cada deoxinucleotídeo (Invitrogen, Carisbad, CA, USA) (dNTP); 1µM de cada primer (5'-AGA ATA TGT AAT TGT CAG e 5'-TAA CCG TTT CAG TAG TTC) e 1,5U de Taq polimerase (Kongmuang et al., 1994). A reação foi realizada em termociclador (PTC-100, MJ Research, Watertown, Massachusets, USA) utilizando-se desnaturação inicial por 10 minutos a 94ºC, 40 ciclos: 90ºC por 40 segundos, 53ºC por 30 segundos e 72ºC por dois minutos, seguido de extensão final a 72ºC por 10 minutos Os produtos da PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%, corados com brometo de etídeo, visualizados e registrados em fotodocumentador (Gel Doc 2000, Bio-Rad). As amostras contendo fragmento de 882pb foram consideradas positivas.

Os resultados do isolamento microbiológico e da PCR foram analisados pelo teste do qui-quadrado de McNemar, e o grau de concordância entre os testes foi avaliado pelo teste Kappa (Zar, 1999).

Não foi detectada Salmonella Typhimurium em nenhuma amostra de suabe retal dos bezerros do grupo 1 com a utilização do isolamento microbiológico. No grupo 2, todos os bezerros inoculados passaram a eliminar S.Typhimuriumnas fezes24 horas após a infecção experimental (Tab. 1). A utilização do caldo selenito cistina e do caldo tetrationato Muller-Kauffmann possibilitou a detecção de 33 amostras positivas para S. Typhimurium. O uso simultâneo dos dois caldos de enriquecimento permitiu o isolamento de 34 amostras positivas para Salmonella.

Assim como no isolamento microbiológico, não foi detectada Salmonella em nenhum dos animais do grupo 1 pela técnica da PCR. Nas amostras de suabes retais dos bezerros do grupo 2, também foi possível detectar Salmonella Typhimurium 24 horas após a inoculação (Tab. 2 e Fig. 1). A utilização do caldo selenito cistina possibilitou a detecção de 30 amostras positivas para S. Typhimurium, enquanto o caldo tetrationato Muller-Kauffmann possibilitou a detecção de 24 amostras positivas. O uso simultâneo dos caldos tetrationato Muller-Kauffmann e selenito cistina também permitiu a detecção de maior número de amostras positivas para Salmonella (32).

Pelo teste do qui-quadrado de McNemar, o isolamento microbiológico foi superior à PCR na detecção de amostras positivas para Salmonella Typhimurium em suabes retais, tanto com a utilização do caldo selenito cistina (33 amostras positivas pelo isolamento microbiológico contra 30 amostras positivas pela PCR) quanto com o uso do caldo tetrationato Muller-Kauffmann (33 amostras positivas pelo isolamento microbiológico contra 24 amostras positivas pela PCR) (P<0,05). A concordância entre os resultados do isolamento microbiológico e os resultados da PCR foi considerada moderada (0,63) com o uso do caldo selenito cistina, e fraca (0,31) com o emprego do caldo tetrationato Muller-Kauffmann pelo teste estatístico Kappa.

A maior parte das pesquisas relatam que a PCR é superior ao isolamento microbiológico convencional na detecção de Salmonella (Oliveira et al., 2003; Castagna et al., 2005; Freschi et al., 2005), entretanto os resultados obtidos mostraram melhor desempenho do isolamento microbiológico.

O menor número de amostras positivas detectadas com a utilização da PCR pode estar relacionado à presença de várias substâncias inibidoras da reação de amplificação nas amostras de fezes, como bilirrubina e agentes quelantes, que não são totalmente removidas durante o processo de extração do DNA (Oliveira et al., 2005). Contudo, vários estudos verificaram que a metodologia de extração de DNA, a partir de amostras de fezes, pelo método de salting-out é mais sensível do que as técnicas de extração por fervura-centrifugação e fenol-clorofórmio (Freschi et al., 2005; Silva et al., 2010). Além disso, o baixo desempenho da PCR associada ao uso do caldo tetrationato Muller-Kauffmann pode ser explicado pelo fato de que este meio contém em sua composição 10% de bile bovina, também considerada inibidora da PCR (Stone et al., 1994).

Assim, os resultados indicam que o isolamento microbiológico foi mais eficiente do que a PCR no diagnóstico da salmonelose a partir de amostras de fezes de bezerros infectados experimentalmente com Salmonella Typhimurium e que o caldo selenito cistina apresentou desempenho superior ao caldo tetrationato Muller-Kauffmann na detecção de Salmonella Typhimurium com a utilização da PCR.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à FAPESP, pela concessão de bolsa e pelo auxílio financeiro, e à Fundação Oswaldo Cruz, pelo fornecimento da cepa de Salmonella Typhimurium.

Recebido em15 de março de 2011

Aceito em 14 de julho de 2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  16 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Out 2011

Histórico

• Recebido
  15 Mar 2011
• Aceito
  14 Jul 2011