Fungos endofíticos em Annona spp.: isolamento, caracterização enzimática e promoção do crescimento em mudas de pinha (Annona squamosa L.)

Endophytic fungi of Annona spp.: isolation, enzymatic characterization of isolates and plant growth promotion in Annona squamosa L. seedlings

Fungos endofíticos em Annona spp.: isolamento, caracterização enzimática e promoção do crescimento em mudas de pinha (Annona squamosa L.)¹

Endophytic fungi of Annona spp.: isolation, enzymatic characterization of isolates and plant growth promotion in Annona squamosa L. seedlings

Roberta Lane de Oliveira Silva^I; Jaqueline Silva Luz^II; Elineide Barbosa da Silveira^III; Uided Maaze Tiburcio CavalcanteIV, ²

^IBolsista de Iniciação Científica-PIBIC/FACEPE/CNPq ([e-mail])

^IIBolsista de Iniciação Científica-PIBIC/CNPq/UFRPE

^IIIUniversidade Federal Rural de Pernambuco, Departamento de Biologia, Rua Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, 52171-900 Recife, PE, Brasil ([e-mail])

^IVUniversidade Federal de Pernambuco, Departamento de Micologia, Centro de Ciências Biológicas, Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, 50670-420 Recife, PE, Brasil

RESUMO

A partir de folhas, caules e raízes de plantas de pinha e graviola coletadas em Pernambuco foram obtidos 110 e 90 isolados fúngicos endofíticos, respectivamente. Vinte e nove isolados foram selecionados e avaliados quanto à produção de enzimas extracelulares, através do método qualitativo em placas com meios sólidos específicos, e à capacidade de estimular o crescimento de mudas de pinha. Esses isolados foram identificados como pertencentes aos gêneros Acremonium (10,34%), Aspergillus (3,45%), Chaetomium (3,45%), Colletotrichum (10,34%), Cylindrocladium (13,8%), Fusarium (31,03%), Glomerella (3,45%), Nigrospora (6,9%), Penicillium (6,9%) e Phomopsis (10,34%). Dezenove isolados apresentaram atividade lipolítica, cinco atividade proteolítica e nenhum deles atividades celulolítica ou amilolítica. Onze isolados dos gêneros Acremonium (GFR6 e GRR1), Colletotrichum (GFR4 e PFR4), Phomopsis (PFR3 e GCR4), Cylindrocladium (GRR4), Chaetomium (GRR7) e Fusarium (GRR5, PRR1 e PRR6) promoveram eficientemente o crescimento vegetal. Os índices de aumento da biomassa seca da parte aérea de mudas de pinha variou de 23,2 a 32,7%, sendo que nenhum isolado promoveu a biomassa seca da raiz. Destaca-se também que 20 isolados apresentaram efeito deletério significativo (P = 0,05) na biomassa seca da raiz das mudas de pinha. Em tecidos aparentemente sadios de plantas de pinha e graviola são encontrados alguns fungos que podem promover o crescimento da parte aérea, como também reduzir o crescimento da raiz e outros sem efeito no crescimento de mudas de pinha.

Palavras-chave: fungos endofíticos, enzimas, graviola, pinha, crescimento vegetal, mudas

ABSTRACT

Endophytic isolates of fungi were obtained from leaves, stems and roots of 110 sweetsop and 90 soursop plants from Pernambuco. Twenty-nine isolates were analyzed for production of extracellular enzymes by qualitative assay in Petri dishes containing specific solid media, and for the capacity to promote growth of sweetsop seedlings. These isolates were identified as Acremonium (10.34%), Aspergillus (3.45%), Chaetomium (3.45%), Colletotrichum (10.34%), Cylindrocladium (13.8%), Fusarium (31.03%), Glomerella (3.45%), Nigrospora (6.9%), Penicillium (6.9%) and Phomopsis (10.34%). Nineteen isolates showed lypolytic activity while five showed proteolytic activity; cellulolytic and amylolytic activity were not detected. Eleven isolates of the genera Acremonium (GFR6 and GRR1), Colletotrichum (GFR4 and PFR4), Phomopsis (PFR3 and GCR4), Cylindrocladium (GRR4), Chaetomium (GRR7) and Fusarium (GRR5, PRR1 and PRR6) efficiently improved plant growth. Increase in shoot dry matter of sweetsop seedlings ranged from 23.2 to 32.7%; there was no increase in root dry matter. It is worthy of note that 20 isolates caused significant (P = 0.05) reduction in root dry matter of sweetsop seedlings. In apparently healthy tissues of sweetsop and soursop plants, some fungi promote shoot growth or reduce root growth, while others have no effect on growth of sweetsop seedlings.

Key words: endophytic fungi, enzymes, soursop, sweetsop, plant growth, seedlings

Introdução

A pinha (Annona squamosa L.) e a graviola (Annona muricata L.) são anonáceas que produzem frutos dos mais apreciados, sendo cultivadas em regiões onde as condições climáticas, de temperatura e umidade, favorecem seus cultivos. A polpa desses frutos é utilizada para consumo in natura e na indústria de sucos, sorvetes, geléias e doces, destacando-se entre os frutos tropicais de maior interesse comercial. Entre as doenças que limitam o cultivo da pinha e graviola, destaca-se a "Podridão da raiz" causada por Phytophthora spp., que ocorre em plantas mantidas em viveiros ou pomares, afetando o transporte de água e nutrientes na planta (Gramacho et al. 2001).

A agricultura moderna tem enfrentado o grande desafio de aumentar a produção das culturas gerando sustentabilidade, baseando-se em enfoque que visa a proteção ambiental e, para atingir esse objetivo, uma das alternativas é a utilização de microrganismos promotores de crescimento vegetal. A capacidade de estimular o crescimento vegetal apresentada por esses organismos tem sido atribuída a mecanismos diretos tais como a fixação do nitrogênio, produção de fitohormônios e indiretos como antagonismo em relação a patógenos levando, conseqüentemente, ao aumento na taxa de germinação, crescimento das raízes e parte aérea, número de folhas e flores, área foliar e rendimento de culturas (Silveira 2001).

Os microrganismos endofíticos, sem considerar os fungos micorrízicos arbusculares, estão presentes no interior de órgãos e tecidos vegetais como folhas, caules e raízes de várias plantas, aparentemente sadias, podendo em alguns casos produzir danos à planta quando as condições ambientais e estado fisiológico do hospedeiro se tornarem favoráveis (Azevedo 1998). Dentre os fungos mais freqüentemente isolados endofiticamente incluem: Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc. in Penz., Cladosporium Link ex Fr., Phomopsis (Sacc.) Bubák., Fusarium Link:Fr. e Xylaria L. (Araújo et al. 2001; Mariano et al. 1997; Pereira et al. 1999; Photita et al. 2001).

Muitos fungos produzem enzimas extracelulares de importância na degradação e transporte de nutrientes para a célula e no processo de patogênese (Bateman & Basham 1976), podendo a produção de enzimas extracelulares ser indicativa da característica patogênica desses fungos. Como uma forma de estabelecer o papel funcional dos fungos endofíticos se faz necessário, dentre outros fatores, a detecção de enzimas extracelulares (Carroll & Petrini 1983).

Estudos envolvendo fungos endofíticos em fruteiras são poucos no Brasil, tendo sido relatados isolamentos de açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.) (Rodrigues 1994), bananeira (Musa acuminata Colla) (Pereira et al. 1999), coqueiro (Cocus nucifera L.) (Mariano et al. 1997), citrus (Citrus limon L.) (Araújo et al. 2001) e cajá (Spondias mombin L.) (Rodrigues & Samuels 1999). Em outras culturas como algodoeiro (Gossypium hirsutum L.) (Gasoni & Gurfinfel 1997), hortelã-pimenta (Mentha piperita L.) (Mucciarelli et al. 2003), milho (Zea mays L.) e fumo (Nicotiana tabacum L.) (Franken et al. 1998) resultados promissores têm sido obtidos com a utilização desses fungos na promoção do crescimento de plantas.

O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de isolar fungos endofíticos de folhas, caules e raízes de Annona spp., detectar a produção de enzimas extracelulares (amilase, celulase, lipase e protease) e avaliar o comportamento dos fungos em relação à capacidade de promover o crescimento de mudas de pinha.

Material e métodos

Isolamento de fungos endofíticos – Foram utilizadas 10 amostras de plantas de pinha e graviola, aparentemente sadias, coletadas em Pernambuco (Tab. 1) e separadas em folhas, caules e raízes, lavadas com sabão em água corrente, desinfestadas em alcool 70% por 30 segundos e hipoclorito de sódio a 1,5% (produto comercial com 2%) por quatro minutos, lavadas em água destilada esterilizada e colocadas para secar em papel de filtro esterilizado. Após desinfestação, foram retirados discos foliares (5 mm diâmetro) e fragmentos do caule e raiz (5 mm comprimento), transferidos para placas de Petri contendo o meio batata-dextrose-ágar (BDA) suplementado com o antibiótico cloranfenicol (100 mg L^-1) e incubados à temperatura ambiente (25±2 ºC). Após sete dias, foi determinada a taxa de colonização (TC) (Petrini et al. 1992), onde TC = número total de segmemtos com um ou mais isolados/total de segmentos da amostra, expressa em percentagem. As colônias fúngicas que se apresentavam distintas umas das outras, de acordo com observações macroscópicas (coloração e características de crescimento em meio de cultura), foram purificadas em meio BDA, preservadas pelo método da subcultura e armazenadas a ± 4 ºC. Para identificação, ao nível de gênero, dos 29 isolados selecionados, foram feitas microculturas utilizando bloco de ágar (Menezes & Silva-Hanlin 1997).

O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC) em arranjo fatorial de 5 × 3, correspondendo a cinco amostras de pinha ou graviola × três partes da planta (folha, caule e raiz), com cinco repetições, sendo a unidade experimental constituída por uma placa com oito discos de folha ou fragmentos de caule ou raiz.

Foram utilizados para diferenciar os isolados os seguintes códigos: a primeira letra indicando a anonácea graviola (G) ou pinha (P); a segunda letra, o órgão de origem folha (F), caule (C) ou raiz (R); a terceira letra, a repetição (R) e; a quarta, o número do isolado.

Atividade enzimática – A produção das enzimas hidrolíticas extracelulares amilase, celulase, lipase e protease foi avaliada em placas de Petri contendo meio de cultura específico para cada enzima (Hankin & Anagnostakis 1975; Sarath et al. 1989; Neirotii & Azevedo 1988). Discos (5 mm diâmetro) de micélio dos 29 fungos endofíticos cultivados em BDA por cinco dias, foram transferidos para o centro de placas de Petri contendo o meio de cultura da enzima específica, incubados à temperatura ambiente (25±2 ºC) e avaliados após cinco dias, quanto a presença ou ausência de halo de degradação. O experimento foi realizado em DIC com 29 tratamentos (isolados representando diferentes gêneros dos fungos encontrados) e quatro repetições, sendo a unidade experimental constituída por uma placa de Petri contendo um disco de micélio do fungo endofítico.

Promoção do crescimento em mudas de pinha – Sementes obtidas de frutos comercializados foram plantadas em potes plástico (50 mL) e após 30 dias, quando as plântulas apresentavam as primeiras folhas definitivas, foram transplantadas para potes (500 mL) contendo solo desinfestado. Antes do transplantio, discos com 5 mm do crescimento do fungo endofítico (três por pote) cultivado em meio BDA durante cinco dias, foram colocados no interior da cova de plantio de cada planta, em contato com o sistema radicular. Noventa dias após a inoculação foram avaliados: altura, número de folhas, biomassa seca da parte aérea e raiz. O trabalho foi realizado em casa de vegetação, em DIC com 30 tratamentos (29 isolados fúngicos e um controle não inoculado) e três repetições, sendo a unidade experimental constituída por uma planta.

Os dados obtidos nos experimentos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Duncan ou Scott-Knott (P = 0,05).

Resultados e discussão

Foram obtidos 110 isolados de fungos endofíticos de plantas de pinha e 90 de graviola. As taxas de colonização variaram de 74,8 a 100% (folha), de 67,2 a 100% (caule) e de 52,4 a 100% (raízes) de plantas de pinha; em graviola, essas taxas foram de 54,8 a 100%, 72,4 a 100% e 77,2 a 97,4% em folhas, caules e raízes, respectivamente (Tab. 2). Diferenças significativas (P = 0,05) na taxa de colonização em cada parte da planta foram observadas em uma das amostras de pinha que apresentou menores taxas no caule (67,2%) e raiz (52,4%) em relação às demais amostras e uma de graviola que teve menor taxa nas folhas (54,8%); quando as partes da planta foram comparadas, uma amostra de pinha apresentou maiores taxas nas folhas (100,0%) do que no caule e raiz enquanto em graviola, não se verificou diferença significativa entre as partes da planta, independentemente da amostra. Esses resultados indicam que qualquer uma das partes da planta pode ser utilizada no processo de isolamento de fungos endofíticos.

A composição microbiana endofítica pode variar em função da espécie vegetal, distribuição geográfica, idade da planta, precipitação anual entre outros fatores (Carroll 1988). Entre os fungos obtidos foram identificados 29 isolados, 8 de pinha e 21 de graviola, pertencentes aos gêneros Acremonium Link:Fr. (10, 34%), Aspergillus P. Mich. ex Link:Fr. (3,45%), Chaetomium Kunze:Fr. (3,45%), Colletotrichum Corda in Sturm. (10,34%), Cylindrocladium Morg. (13,8%), Fusarium Link:Fr. (31,03%), Glomerella Spauld & H. Schrenk (3,45%), Nigrospora A. Zimmerm. (6,9%), Penicillium Link:Fr. (6,9%) e Phomopsis P. Mich. ex Link:Fr. (10,34%) (Tab. 2). Os gêneros Colletotrichum, Fusarium e Phomopsis foram encontrados nas duas espécies de anonáceas. Verificou-se que os isolados do mesmo gênero apresentaram-se iguais morfotipicamente. Alguns desses gêneros de fungos endofíticos já foram isolados de tecidos sadios de outras fruteiras, tais como coqueiro (Mariano et al. 1997), citrus (Dúran et al. 2005) e cajá (Rodrigues & Samuels 1999).

Dos 29 isolados testados, 19 (65,5%) de diversos gêneros (Acremonium, Chaetomium, Colletotrichum, Cylindrocladium, Fusarium, Glomerella, Nigrospora, Phomopsis) apresentaram atividade lipolítica (Tab. 2). Segundo Rollof et al. (1987) a produção de lipase por microrganismos não tem função totalmente conhecida, porém está relacionada com a localização e possibilidade de expansão da infecção em fungos patogênicos. Já para a atividade proteolítica, apenas cinco isolados (17,2%) apresentaram halo de degradação. Pouco é conhecido sobre o papel das proteases na penetração dos fungos nas plantas (Griffin 1994), porém, vale ressaltar que as proteases são complexos enzimáticos relativamente mais estudados em fungos e são de grande importância em processos industriais (Hancock & Millar 1965).

Apesar de alguns fungos endofíticos terem apresentado atividade lipolítica e proteolítica, isto não caracteriza a fitopatogenicidade, pois, segundo Annis & Goodwin (1997), as diferentes isoenzimas de cada grupo de enzimas que degradam a parede celular podem ter diferentes funções, incluindo a obtenção de nutrientes durante o crescimento saprofítico. A habilidade de várias espécies de fungos em produzir enzimas é bastante variável.

Os fungos endofíticos de pinha e graviola testados não produziram as enzimas hidrolíticas extracelulares celulase e amilase (Tab. 2), comuns em fungos fitopatogênicos, sugerindo que os fungos endofíticos isolados não apresentam enzimas relacionadas à patogênese. A produção de amilase por fungos filamentosos varia de acordo com o gênero e a espécie (Griffin 1994) e, segundo Dianese (1989), as amilases são comuns em fungos, permitindo a hidrólise do amido até glucose.

No teste de promoção de crescimento de mudas de pinha, os isolados fungicos endofíticos GFR6 (Acremonium), GFR4 (Colletotrichum), GRR7 (Chaetomium), GRR4 (Cylindrocladium), PFR3 (Phomopsis), GCR4 (Phomopsis), PRR1 (Fusarium), PRR6 (Fusarium), PFR4 (Colletotrichum), GRR5 (Fusarium) e GRR1 (Acremonium) diferiram significativamente (P = 0,05) da testemunha, com biomassa seca da parte aérea variando de 0,50 a 0,57 g (Tab. 2). Sabe-se que a fotossíntese fornece cerca de 90% a 95% da matéria seca ao vegetal, assim como a energia metabólica requerida para o desenvolvimento da planta (Magalhães et al. 2003), e a quantidade de biomassa produzida pelo vegetal pode ser definida por uma relação fisiológica simples, baseada na quantidade de radiação interceptada e em sua eficiência de conversão em matéria seca (Charles-Edwards 1982). Desta forma, o aumento da biomassa seca na parte aérea de pinha indica uma melhoria na qualidade das mudas, o que possibilitará uma redução do tempo das mesmas em viveiro. No que se refere a trabalhos envolvendo a utilização de fungos endofíticos na promoção de crescimento de plantas, a literatura é escassa. Dos poucos relatos existentes, pode ser citada a utilização do fungo endofítico Piriformospora indica, que é indicado para aplicação na floricultura, horticultura e agroflorestal, visando aumentar a produção comercial (Varma et al. 1999). Estudos da interação desse fungo com milho e fumo mostraram que a hifa coloniza o córtex da raiz com diferenciação intracelular, sendo a base para o efeito da promoção de crescimento uma maior absorção de fósforo pelas plantas (Franken et al. 1998).

Embora não estejam totalmente elucidados os mecanismos envolvendo a promoção de crescimento vegetal pelos fungos endofíticos, existe a possibilidade de que esses fungos promovam o crescimento mais rápido da planta devido à produção de fitohormônios (Azevedo 1998), aumento da capacidade de absorção de minerais como nitrogênio e fósforo (Gasoni & Gurfinkel 1997; Franken et al. 1998) e outras substâncias (Mucciarelli et al. 2003).

Todos os isolados que promoveram o crescimento das mudas de pinha (GFR6, GFR4, GRR7, GRR4, PFR3, GCR4, PRR1, PRR6, PFR4, GRR5, GRR1) apresentaram atividade lipolítica. Esses isolados não foram patogênicos a essa cultura, indicando que as lipases, neste caso, não têm função relacionada a patogenicidade.

Não foi verificada eficiência dos fungos endofíticos na promoção de crescimento das mudas de pinha quando analisada a variável biomassa seca da raiz (Tab. 2). Destaca-se também que 20 isolados (PRR18, GRR7, PRR6, GRR2, GRR8, GRR85, GCR8, GCR4, PRR37, GRR1, GCR5, GRR6, GRR9, GRR10, GFR1, GRR14, GFR3, PRR3, PRR5, PRR1) apresentaram efeito deletério significativo (P = 0,05) em relação à testemunha, reduzindo a biomassa seca da raiz, o que pode ter acontecido devido à competição por nutrientes do solo entre o fungo endofítico e a planta. Kloepper (1996) também verificou efeito deletério de rizobactérias associadas a plantas. Segundo esse autor, na interação entre os microrganismos endofíticos e a planta hospedeira podem ocorrer reações do tipo benéficas, neutras ou prejudiciais.

As plantas tratadas com os isolados de fungos endofíticos não diferiram significativamente do controle em relação às variáveis altura da planta e número de folhas.

Dos 11 isolados que beneficiaram a parte aérea das mudas de pinha, cinco (GCR4, GRR7, GRR1, PRR1 e PRR6) reduziram o peso da biomassa seca da raiz (Tab. 3). Desta forma, foram selecionados como eficientes na promoção de crescimento os isolados GFR6 (Acremonium), GFR4 (Colletotrichum), PFR4 (Colletotrichum), PFR3 (Phomopsis), GRR5 (Fusarium) e GRR4 (Cylindrocladium), com índices de aumento da biomassa seca da parte aérea, em relação ao controle, variando de 23,2 a 32,7% (Fig. 1).

Os isolados GFR6, GFR4, GRR5 e GRR4 que promoveram o crescimento das mudas de pinha são provenientes de graviola, evidenciando que isolados de um hospedeiro podem facilmente colonizar hospedeiros de espécies diferentes, até mesmo com maior intensidade. Este fato é comumente observado com isolados de bactérias endofíticas e epifíticas promotoras de crescimento de plantas (Silveira et al. 2004).

Os resultados evidenciam o potencial de alguns isolados de fungos endofíticos de pinha e graviola em promover o crescimento das mudas de pinha e as atividades lipolítica e proteolítica apresentadas por alguns isolados utilizados neste trabalho, sugerem que endofíticos de pinha e graviola podem ser uma fonte produtora de enzimas de interesse industrial.

Agradecimentos

Ao CNPq e FACEPE pela concessão das bolsas de Iniciação Científica.

Recebido em 15/12/2004. Aceito em 16/03/2006

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1

Monografia da primeira Autora, Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas, Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Brasil

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Fev 2007
• Data do Fascículo
  Set 2006

Histórico

• Aceito
  16 Mar 2006
• Recebido
  15 Dez 2004