Efeito imunomodulador de hormônios tímicos sobre o trauma térmico experimental

Immunomodulatory effect by thimic hormones in experimental burn

6 – ARTIGO ORIGINAL

Efeito imunomodulador de hormônios tímicos sobre o trauma térmico experimental¹

Immunomodulatory effect by thimic hormones in experimental burn

Lucy Resende Bevilacqua^I; Dan Linetzky Waitzberg^II; Adriana Dias Carrilho Soares^I; Gilson Alves Alves Bevilacqua^I

^IBiólogo(a)

^IIProf. Associado da Disciplina de Cirurgia Experimental do Depto. de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP)

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O trauma grave, em particular térmico, promove a imunodepressão. Hormônios tímicos podem modificar a resposta imune nesta comdição. O objetivo desta pesquisa foi investigar o efeito imunomodulador do hormônio tímico timoestimulina sobre a imunidade celular em trauma térmico, traduzida pela resposta dos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia. Na primeira etapa do experimento, ratos Wistar foram sensibilizados com KHL e posteriormente submetidos ao teste cutâneo de hipersensibilidade tardia (TCHT). Dez animais com resposta positiva foram submetidos a queimadura cutânea padronizada. Testes cutâneos seqüenciais revelaram significativa anergia cutânea no 21º e 30º dias pós-queimadura e interrupção do ganho de peso. Na etapa seguinte, ratos previamente sensibilizados e com resposta positiva ao TCHT, foram divididos nos grupos TAQ (seis ratos) tratados com timoestimulina, por via intramuscular, na dose de 0,25 mg, antes e após queimadura, grupo TDQ (seis ratos) tratados com a mesma dose de timoestimulina apenas após a queimadura e grupo CSQ (cinco ratos) tratados com solução salina, im, após a queimadura. Ocorreu aumento significativo do peso corpóreo e da resposta do TCHT a partir de duas semanas pós queimadura nos grupos TAQ e TDQ. Nas condições da presente pesquisa, timoestimulina misnistrada antes e após a queimadura experimental associa-se a melhora da resposta ao teste cutâneo de hipersensibilidade tardia e ganho de peso corpóreo.

Descritores: Queimaduras. Adjuvantes imunológicos. Hormônios do timo. Ratos.

SUMMARY

Severe trauma, mainly burn, may promote immunodepression. Thimic hormones may modify the immune response to this condition. The aim of this experimental research was to investigate, after burn, the immunomodulatory effect of timoestimulin, a thimic hormone, on celular immunity studied by the delayed hypersensitivity skin test (TCHT). On the first phase of the experiment, Wistar rats were sensitized with KHL and submitted to TCHT. Ten animals with positive tests were submitted to a standardized skin burn. Sequencial skin tests showed significant skin anergy at 21 and 30 days after burn and interruption of weight gain. In the next phase, positively sensitized rats were divided randomly in group TAQ (six) and treated with timoestimulin, 0,25 mg, im, before and after burn; group TDQ (six rats) treated with the same dosage of timoestimulin just after burn and group CSQ (five rats) treated with saline, im, after burn. There was a significant increase of body weight and skin test response at two weeks after burn in TAQ and TDQ groups. At the conditions of the present research, timoestimulin given before and after experimental burn was associated to improvement of delayed cellular hypersensitivity skin test and body weight gain.

Subjects headings: Burns. Imunologics adjuvants. Thymus hormones. Rats.

INTRODUÇÃO

Complicações infecciosas locais e sistêmicas que ocorrem após intervenções cirúrgicas ou trauma, continuam sendo freqüentemente responsáveis por alta morbidade e mortalidade. Mecanismos de defesa corpórea deficientes propiciam a invasão e favorecem o desenvolvimento de microrganismos patológicos permitindo, à partir daí, o início da infecção¹⁷. Tornando-se de interesse conhecer as defesas do organismo contra agentes infecciosos, em particular as de natureza imunológica, e tentar determinar qual o melhor procedimento para evitar o comprometimento do organismo após cirurgia ou trauma. Mediante isto, será possível manipular alterações nas defesas imunológicas e eventualmente, reduzir a porcentagem e variabilidade das complicações infecciosas pós-traumáticas.

De modo particular, vale a pena ressaltar os casos de trauma por queimadura extensa, aos quais tem se dado muita atenção devido ao alto índice de mortalidade¹⁰. Óbito pós queimadura pode ocorrer precocemente, devido a alterações hemodinâmicas e hidroeletrolíticas, ou mais tardiamente, em virtude do desenvolvimento de complicações infecciosas, quando o paciente falece, quase sempre, na vigência de um quadro de choque séptico.²⁹

Pacientes queimados são mais susceptíveis a infecções do que pacientes atingidos por outros fatores traumáticos²⁷. Tem sido também demonstrado, experimentalmente, em animais submetidos a condições de extensa queimadura, aumento da susceptibilidade a infecções por bactérias^20,26,28,29. Esta perturbação pode ser ligada, em parte, ao prejuízo dos mecanismos de defesa do hospedeiro, eventualmente em função da imunossupressão pós-traumática^9,19,29,38.

Deste modo, coloca-se a proposta de enfrentar a deficiência imunológica pós-traumática para conseguir reduzir as conseqüências da contaminação e infecção bacteriana em queimadura. Para enfrentar este estado de comprometimento imunológico, fora as medidas de caráter sistêmico e local, sabidamente conhecidas^17,27, pode-se lançar mão de substâncias supostamente capazes de efeitos imonumoduladores. Estas atuariam sobre o sistema imune, aumentando a proliferação de determinadas células deste sistema, ou alargando a eficiência das substâncias por elas produzidas^14,18,37.

Hormônios tímicos apresentam efeito imune restaurados em pacientes com imunodeficiência primária e secundária⁵.

Resultados preliminares obtidos clinicamente, mostram que pacientes queimados em determinadas situações de imunodepressão, podem se beneficiar com a aplicação de hormônios tímicos⁴.

A presente investigação tem como objetivo estudar, em ratos, submetidos a trauma térmico extenso, o efeito imunomodulador de hormônios tímicos representados pela timoestimulina, sobre a imunidade celular refletida por meio da resposta ao teste cutâneo de hipersensibilidade tardia. Busca também averiguar se a ministração de timoestimulina anteriormente ao trauma térmico cutâneo é eficaz em modificar a resposta imune celular.

MÉTODO

Amostra

Foram utilizados vinte e seis ratos Wistar, machos, adultos, jovens, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, com peso corpóreo aproximado de 180 gramas.

Procedimentos

Etapa 1 - Efeitos do Trauma Térmico Experimental

Nesta fase, foram utilizados dez animais , submetidosaos seguintes procedimentos:

Os animais foram sensibilizados, por meio de injeção subcutânea na pata traseira de 0,1ml de solução, contendo o antígeno KHL (KEYHOLE HEMOCYANIN LIMPET - Hoescht do Brasil), obtida da seguinte forma: inicialmente preparou-se uma solução de adjuvante completo de Freund (Instituto Butantã - Brasil) e soro fisiológico na proporção de 9:1 ml. A seguir preparou-se uma segunda solução diluindo-se o antigeno KHL na primeira solução, em uma concentração de 10 mg/ml.

Após a sensibilização os animais foram mantidos em gaiolas coletivas durante 16 dias, submetidos a ciclos diuturnos de luz, recebendo ad libitum água e dieta padrão de laboratório (NUVILAB CR1 - Nuvital). Durante este período foi observado o estado geral dos animais, sendo registrada a evolucão de seu peso corpóreo.

No 14º dia, eralizou-se o primeiro teste de hipersensibilidade cutânea tardia (TCHT1), por meio de injeção intradérmica de 0,1 ml de solução de KHL, diluído em soro fisiológico, a uma concentração de 3 mg/ml, na região do flanco esquerdo, previamente submetida a depilação e assepsia. Com paquímetro apropriado, mediu-se o maior diâmetro das endurações cutâneas obtidos 48 horas após TCHT1. Nessas condições, o teste cutâneo foi deinido como positivo quando a leitura do diâmetro da enduraçõe cutânea foi igual ou maior que 5 mm. Tais procedimentos foram realizados conforme descrito por WAITZBERG e col.³⁷ e visaram a eliminação dos animais não reativos ao KLH.

No 16º dia, após a leitura de 48 horas, foi realizada, sob anestesia geral (THIONEMBUTAL - Abbott), a queimadura cutânea padronizada, pela imersão em água a 75ºC, durante um minuto, da região dorsal do animal, depilada, delimitada por parâmetros anatômicos fixos, representando 30% a 34% da superfície corpórea total, conforme descrito por LIMA-GONÇALVES e col.²¹.

Após a queimadura, os animais foram acondicionados em gaiolas metabólicas individuais, durante 21 dias, nos quais receberam ad libitum água e dieta sistética normoproteica padronizada pelo laboratório (Quadro I). Nesta dase, foram registrados diariamente os valores correspondentes a ingestão de dieta e peso corpóreo. Neste mesmo período, foi também realizada diariamente limpeza da região queimada, utilizando-se água oxigenada 10 volumes, mercúrio-cromo e PVD-IODO DEGERMANTE (Drogasil).

No 23ºdia (7 dias pós-queimadura), foi feito o primeiro teste cutâneo pós-trauma (TCHT2) e no 30º dia (14 dias pós-queimadura), realizou-se o TCHT3, ambos com leitura de 48 horas conforme realizado no TCHT1. No 32º dia, os animais foram sacrificados por inalação de éter anestésico.

Todos os dados obtidos foram submetidos a análise estatística adequada, representada pelo teste T de Student, nãp pareado, sendo estatisticamente significantes as diferenças quando p < 0,05³³.

Etapa 2 - Efeitos da Timoestimulina sobre o Trauma Término Experimental

A segunda etapa do projeto, contemplou a proposta de estudar a ação imunomoduladora da timoestimulina (TP1 SERONO - Serono Produtos Farmacêuticos Ltda.) em trauma térmico.

Todos os dezessete animais foram submetidos a período de adaptação de dois dias em gaiolas metabólicas, recebendo dieta sintética normoproteica.

Os animais foram distribuídos aleatoriamente em três grupos:

GRUPO TAQ (Timoestimulina Antes da Queimadura) - composto por seis animais que, no terceiro dia do experimento, foram sensibilizados com antígeno KLH. A partir do sétimo dia, receberam diariamente timoestimulina, por via intramuscular, na dose de 0,25 mg. No 15º dia, realizou-se o primeiro teste de hipersensibilidade tardia (TCHT1). Em todos os animais, após 48 horas, foi comprovada a reação positiva ao este cutâneo de hipersensibilidade tardia. A seguir os ratos foram submetidos a queimadura térmica e acompanhados durante 23 dias. Após a queimadura, os animais receberam injeção intramuscular diária de timoestimulina, na dose de 0,25mg, em dias alternados até o sacrifício.

GRUPO TDQ (Timoestimulna Depois da Queimadura) - Composto por seis animais submetidos aos mesmos procedimentos que os ratos do grupo TAQ. A diferença consistiu no início da administração de timoestimulina, que se deu a partir do dia da queimadura, por seis dias conseutivos e, em seguida, a cada dois dias, até o sacrifício, sempre por via intramuscular, em dose de 0,25 mg.

GRUPO CSQ (Controle-Salina + Queimadura) - Composto por cinco animais submetidos aos mesmo procedimentos experimentais dos ratos do grupo TDQ. A diferença consistiu na injeção de soro fisiológico intramuscular ao invés de timoestimulina, nos mesmos dias e dose referidas para o grupo TDQ.

Todos os animais desta etapa foram mantidos durante todo o experimento em gaiolas metabólicas individuais, determinando-se diariamente o peso corpóreo e ingestão de dieta.

A região traumatizada dos ratos foi tratada, usando-se PVP - IODO DEGERMANTE (Drogasil).

No 23º, 30º e 37º dias do experimento (respectivamente 7, 14 e 21 dias pós-queimadura) realizaram-se respectivamente os testes TCHT2, TCHT3 e TCHT4, praticando-se 48 horas depois as respectivas leituras. Após a leitura do TCHT4 (39º dia do experimento), os animais foram sacrificados por inalação de éter anestésico.

Todos os resultados obtidos, foram submetidos aos testes de análise de Variância e Scheffe, considerando-se diferenças significativas quando p < 0,05.³³

RESULTADOS

Etapa 1

Os resultados obtidos na primeira etapa figuram nas tabelas I e ^II e nas figuras 1 e 2.

A tabela I e a figura 1 apresentam a resposta aos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia, realizados nos diferentes períoos do experimento. A análise matemática identificou redução estatisticamente significativa nos teste realiaos 7 e 14 dias pós-queimadura (TCHT2 e TCHT3), quando comparado com o teste pré-queimadura (TCHT1).

A ^{tabela II} e a figura 2 apresentam dados referentes a evolução do peso corpóreo, onde são apresentados os dias da queimadura, dos testes cutâneos e respectivas leituras e alguns dias intermediários. Verificou-se ganho significativo do peso do 1º ao 16º dias. A partir da realização da queimadura (16º dia); a partir daí, até o final do experimento (32º dia), não houve ganho de peso.

Etapa 2

A tabela III e a figura 3 apresentam os resultados referentes as mensurações das endurações dos testes cutâneos de hipersensibilidade tardia. A análise matemática identificou diferenças estatisticamente significativas no teste TCHT4 (21 dias pós-queimadura), no qual os grupos TAQ e TDQ mostraram melhor resposta cutânea quando comparados com o grupo CSQ.

A tabela IV e a figura 4 apresentam dados relativos ao peso corpóreo, onde se identificou que se os grupos TAQ e TDQ, apresentaram peso significativamente maior que o grupo CSQ a partir do 32º dia (16º dia após queimadura).

DISCUSSÃO

A sépse é a maior causa de morbidade e mortalidade em pacientes com trauma térmico. Estima-se que 75% dos pacientes queimados podem apresentar infecções bacterianas.^20,26.

Os mecanismos de depressão e alterações imunológicas em trauma térmico podem ocorrer por modificações nos sistemas inflamatórios não específico e o imune-específico, entre as quais, modificações nas funções e no número de monócitos e células T, participantes nas reações de hipersensibilidade tardia.

No presente trabalho em concordânciacom as observações de Hansbrough e col.¹⁶, notou-se que após o trauma térmico houve uma significativa redução na resposta ao teste cutâneo de hipersensibilidade tardia expressando a ocorrência de anergia, que se prolongou por mais duas semanas.

O teste cutâneo de hipersensibilidade tardia consiste em uma avalição, ainda que grosseira, da função de imunidade celular, em particular dos linfócitos T e, quando aplicado conforme metodologia apropriada é reprodutível e sensível às condições que alteram a função do sistema imune celular.³⁷.

A timoestimulina corresponde a um complexo de polipeptídios termoestáveis, isolada do timo bovino¹⁹. Seu uso tem sido preconizado nos estados de imunodeficiência primária^3,13,31,36 e satisfatória, na imunodeficiência secundária. Induz a restauração das defesas imunitárias primárias⁷, favorecendo o aumento da imunocompetência dos linfócitos T⁸.

No presente trabalho a aplicação de timoestimiulina antes e depois do trauma térmico, em dose apropriada para o peso dos ratod, foi capaz de restituir a resposta cutâne ao teste de hipersensibilidade tardia, após a queimadura. É possível que este efeito favorável sobre a restauração de imunidade celular tenha sido mediada pela proliferação e diferenciação linfocitária, ocasionada pela ação da timoestimulina.^2,23 Em condições clínicas, existem relatos de efeitosbenéficos de TP1 em pós-operatório^12,15,34 e no controle de infecções cirúrgicas.³² Particularmente em queimadura, observou-se nos pacientes uma resistência a infecções, obtendo-se uma reução significativa da mortalidade.¹³

Em cobaias submetidas a trauma térmico e administração de TP5, princípio ativo de timopoietina, quando associadaa indometacina (bloqueadora da síntese de prostaglandina) houve uma melhora na resposta imune²⁵. De outro lado, o estímulo do sistema imune anteriormente a ocorrência do trauma térmico não trouxe vantagens, já que não houveram diferenças entre grupos com e sem estimulação pré-trauma.

Chamam a atenção, no presente trabalho, as favoráveis modificações de peso corpóreo perante trauma térmico e o uso de timoestimulina. Como não houveram diferenças significativas quanto a ingestão de dieta (dados não apresentados), pode-se admitir um efeito da timoestimulina a nível de consumo de substrato orgânico. Novos experimentos deverão ser delineados para abordar com detalhes estes aspectos.

No presente estudo verificou-se uma resposta benéfica tardia. É possível que com o uso de dosagens mais elevadas de timoestimulina obtenha-se efeitos mais precoces.

É bem verdade que, não se sabe no presente trabalho, qual a repercurssão clínica do estímulo da timoestimulina sobre a taxa de contaminação infectobacteriana e mortalidade dos animais. Novos estudos deverão ser desenvolvidos para contemplar e responder estas importantes questões.

CONCLUSÕES

Nas condições do presente experimento, concluímos que: a administração de hormônios tímicos a ratos submetidos a trauma térmico experimental, auxiliou a recuperação da resposta cutânea de hipersensibilidade tardia e o ganho de peso corpóreo. Não houve diferenças, porém, nos resultados obtidos com a administração dos hormônios tímicos antes e após o trauma térmico ou somente após o trauma.

Data do recebimento: 02.01.97

Data da revisão: 06.02.97

Data da aprovação: 07.03.97

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1

Trabalho realizado na Disciplina de Técnica Cirúrgica do Depto. de Cirurgia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Nov 2010
• Data do Fascículo
  Jun 1997

Histórico

• Aceito
  07 Mar 1997
• Recebido
  02 Jan 1997
• Revisado
  06 Fev 1997