Produção de betacianina em erva-de-jacaré cultivada in vitro com diferentes concentrações de sulfato de cobre

Betacyanin production in alligator weed, grown in vitro, with different concentrations of copper sulfate

ARTIGOS CIENTÍFICOS

DEFESA FITOSSANITÁRIA

Produção de betacianina em erva-de-jacaré cultivada in vitro com diferentes concentrações de sulfato de cobre

Betacyanin production in alligator weed, grown in vitro, with different concentrations of copper sulfate

Janieli Cristina Perotti^I,1; Isabel Corrêa da Silva Rodrigues^II; Alítcia Moraes Kleinowski^II; Márcia Vaz Ribeiro^II; Andersom Millech Einhardt^II; José Antonio Peters^II; Marcos Antonio Bacarin^II; Eugenia Jacira Bolacel Braga^II

^IUniversidade Federal de Pelotas (UFPEL), 960010-900, Pelotas, RS, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Botânica, UFPEL, Pelotas, RS, Brasil

RESUMO

A manipulação da concentração dos microelementos no meio de cultura representa uma boa estratégia para aumentar a produção de metabólitos secundários em cultura de tecidos. Este trabalho teve por objetivo demonstrar a influência do sulfato de cobre na produção de betacianina e na multiplicação de plantas de Alternanthera philoxeroides (erva-de-jacaré) cultivadas in vitro. Segmentos nodais, obtidos de plantas pré-estabelecidas e após três subcultivos, foram inoculados em meio MS, com diferentes concentrações de CuSO₄ (0; 25; 75; 125; 175; 200µM). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com seis concentrações de CuSO₄ e cinco repetições representadas por um frasco contendo quatro explantes. Os resultados foram submetidos à análise de variância, à regressão polinomial e a análises de correlação entre as variáveis morfológicas e a produção de betacianina. Concentrações acima de 75µM diminuíram a altura das plantas, o número de brotos e gemas e o crescimento radicular, enquanto que, na concentração de 125µM, houve a maior produção de massa fresca. A produção de betacianina aumentou 60% em relação ao controle com 175µM de CuSO₄. Ocorreu crescimento das plantas em todas as concentrações de CuSO₄ testadas, com exceção de 200µM, sendo esta considerada tóxica.

Palavras-chave: estresse abiótico, betalaínas, cultivo in vitro, Alternanthera philoxeroides, metabolismo secundário.

ABSTRACT

The manipulation of concentration of trace elements in the culture medium represents a good strategy to increase the production of secondary metabolites in tissue culture. This study aimed to demonstrate the influence of copper sulphate in the production of betacyanin and the multiplication of plants of Alternanthera philoxeroides (alligator weed) cultured in vitro. Nodal segments, obtained from plants pre-stablished and after three subcultures, were inoculated in basic MS with different concentrations of CuSO₄ (0, 25, 75, 125, 175, 200µM). The results were subjected to analysis of variance, polynomial regression and correlation analysis between the morphological variables and the production of betacyanin. The experimental design was completely randomized with six concentration of CuSO₄ and five replicates represented by a bottle containing four explants. Concentrations above 75µM decreased the height of the plant, number of shoots and buds and root growth, while the concentration of 125µM resulted in the highest fresh mass production. Betacyanin production increased 60% over control with 175µM CuSO₄. Plant growth occurred in all tested concentrations of CuSO₄, with the exception of 200µM which was toxic.

Key words: abiotic stress, betalain, in vitro culture, Alternanthera philoxeroides, secondary metabolism.

INTRODUÇÃO

Com o intuito de aumentar a produtividade de compostos vegetais de interesse, diversas técnicas vêm sendo utilizadas, incluindo a seleção de linhagens, a engenharia metabólica, a otimização das condições de cultivo e o emprego de elicitores (CHEN & CHEN, 2000). Alguns trabalhos têm demonstrado o efeito de microelementos na morfogênese in vitro e na produtividade de metabólitos secundários (TREJO-TAPIA et al., 2001; AKITA et al., 2002; KUMAR et al., 2004).

O cobre é um micronutriente essencial para o desenvolvimento normal das plantas, atuando como ativador ou constituinte de enzimas no transporte de elétrons, nos processos de oxirredução e na biossíntese de proteínas e carboidratos (NASSAR, 2004; NIEDZ & EVENS, 2007). O íon divalente Cu²⁺ tem demonstrado efeito positivo na produção de alguns metabólitos secundários, entre eles, diogenina em batata-do-ar (Dioscorea bulbifera) (NARULA et al., 2005) e quercetina em rasna (Pluchea lanceolata) (KUMAR et al., 2004), além de ter aumentado a produção de betacianina em beterraba (Beta vulgaris) (TREJO-TAPIA et al., 2001). A concentração dos nutrientes inorgânicos, incluindo o cobre, utilizada no meio em cultura de tecidos vegetais, é, na maioria das vezes, baseada nos níveis estabelecidos por MURASHIGE & SKOOG (1962) para a cultura de tabaco (Nicotiana tabacum). No entanto, tal concentração pode não ser a mais adequada para o cultivo de outras espécies e isso pôde ser observado quando o aumento da concentração de sulfato de cobre favoreceu a indução de calos, a indução e o alongamento de brotos e raízes (KOTHARI-CHAJER & SHARMAR, 2008).

Alternanthera philoxeroides, conhecida popularmente como bredo-d'água ou erva-de-jacaré (alligator weed), é uma espécie nativa da América do Sul que apresenta em seus extratos flavonoides glicosilados, saponinas e betalaínas. É utilizada na medicina contra alergia, como diurética e antipirética, e em tratamentos de feridas e úlceras, além de apresentar comprovada ação antitumoral e antiviral (JIANG et al., 2005; FANG et al., 2007; RATTANATHONGKOM et al., 2009).

As betacianinas são pigmentos nitrogenados, de coloração vermelho-violeta, classificadas quimicamente em quatro tipos: betanina, amarantina, gonferina e bougainvilina (VOLP et al., 2009). Esses pigmentos são pertencentes, juntamente com as betaxantinas, à classe das betalaínas, sendo amplamente utilizados como aditivo de produtos alimentícios. A tirosinase ou polifenol oxidase cataliza a hidroxilação da tirosina para dihidroxifenilalanina (DOPA) e a subsequente oxidação de DOPA na rota de biogêneses das betalaínas, incluindo as betacianinas e as betaxantinas (WANG et al., 2007).

A cultura de células vegetais vem sendo utilizada para a produção de compostos de interesse às indústrias de alimentos, cosméticos e fármacos (SHIM et al., 2010). Mesmo apresentando resultados satisfatórios, a produtividade desses compostos, como flavonoides e compostos nitrogenados, muitas vezes é menor em cultura de células se comparada a tecidos sintetizadores nas plantas e isso ocorre devido à falta de diferenciação das células em suspensão e cultura de calo de tecidos e órgãos (VERPOORTE et al., 2000; BOURGAUD et al., 2001).

Tendo em vista que a tirosinase trata-se de uma enzima cúprica que atua na rota de biossíntese de betalaínas e que o cobre pode exercer efeitos positivos na multiplicação de plantas e na produção de metabólitos secundários, objetivou-se com este trabalho demonstrar a influência de diferentes concentrações de sulfato de cobre na produção de betacianina e na multiplicação de plantas de A. philoxeroides (erva-de-jacaré) cultivadas in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Plantas de A. philoxeroides (erva-de-jacaré), proveniente do município de Rio Grande, no Rio Grande do Sul, tiveram sua identificação taxonômica confirmada por meio da chave de identificação para Amaranthaceae e catalogada no Herbário Pel sob o número 24.535. Para o estabelecimento in vitro, foram utilizados segmentos nodais de brotações novas, contendo uma ou duas gemas axilares, de plantas mantidas, por 15 dias, na casa de vegetação. Os segmentos foram lavados em água corrente e em água destilada sob agitação mecânica por 15 minutos. Posteriormente, o material vegetal foi imerso em hipoclorito de sódio 1%, com três gotas de tween (20min), e em álcool 70%, por 20 segundos. Todos os procedimentos foram intercalados com banhos em água estéril.

Para o experimento com diferentes concentrações de sulfato de cobre (CuSO₄), foram utilizados como explantes segmentos nodais de aproximadamente (1cm), com duas gemas axilares, após três subcultivos (90 dias).

Seis concentrações (0; 25; 75; 125; 175; 200µM) de CuSO₄ foram adicionadas separadamente em meio MS, contendo 30g L^-1 de sacarose, 100mg L^-1 de mio-inositol e sem adição de reguladores de crescimento. O pH dos meios foi ajustado para 5,8, antes da adição de 7g L^-1 de ágar (marca Vetec^®) e da esterilização. Os frascos contendo os explantes e os meios de cultura foram vedados com papel alumínio e autoclavados por 20 minutos a uma temperatura de 121°C e pressão de 1,05kg cm^-2.

Os explantes foram inoculados nos meios de cultura em câmara de fluxo laminar, em condições assépticas. Em seguida, os frascos com os explantes foram colocados em sala de crescimento, onde permaneceram por 35 dias sob fotoperíodo de 16 horas e densidade de fluxo de fótons de 48?moles m^-2 s^-1, com temperatura de 25±2°C. Ao final desse período, foi avaliado o número de gemas axilares e brotos por planta, a altura das brotações (cm), a porcentagem de enraizamento, o comprimento médio das raízes (cm) e a biomassa fresca da parte aérea (mg).

Para análise das betacianinas, foram utilizadas as partes aéreas das brotações, as quais foram maceradas em 5mL de água destilada e, em seguida, centrifugadas a 15790rpm, a 4°C, por 25 minutos. A quantificação de betacianinas foi realizada em espectrofotômetro Ultrospec 2100 Pro da Amersham Bioscience^®, de acordo com a metodologia descrita por CAI et al. (1998).

A concentração de betacianina foi calculada e expressa como amarantina pela seguinte fórmula: Concentração de amarantina=((A536-A650) x P.M. x V x FD x100/εx BMF), em que: ε=coeficiente de absorção de amarantina (5,66x10⁴cm^-1 mol^-1L), A₅₃₆=absorbância a 536nm para a amarantina e A₆₅₀=absorbância a 650 para clorofila, P.M.=peso molecular (726,6g mol^-1), V=volume de extração (5mL), FD=fator de diluição e BMF=biomassa fresca das amostras. Os resultados foram expressos em mg de amarantina por 100g MF^-1.

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, com seis tratamentos (concentrações de sulfato de cobre); cada tratamento contendo cinco repetições, sendo cada uma representada por um frasco com cinco explantes. Os resultados foram submetidos à análise de variância e regressão polinomial com o auxílio do software estatístico WinStat (MACHADO & CONCEIÇÃO, 2002). Foram realizadas análises de correlação entre as variáveis morfológicas e a produção de betacianina.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Todos os explantes inoculados formaram brotações novas, independentemente da concentração de sulfato de cobre presente nos meios; porém, concentrações acima de 75µM foram prejudiciais a essa indução (Figura 1A). O número máximo de gemas (11,4) e altura (8,4cm) das plantas foi registrado em 75µM, ocorrendo, em concentrações superiores, diminuição significativa nas duas variáveis (Figura 1B e 1C).

Esses resultados corroboram NARULA et al. (2005), os quais, estudando segmentos nodais de Dioscorea bulbifera (batata-do-ar), observaram melhor resposta com 75µM de CuSO₄ no crescimento das brotações e número de gemas dessa espécie. A importância do cobre foi comprovada por JOSHI & KOTHARI (2007), quando observaram aumento significativo do número e comprimento dos brotos por explante de Capsicum annuum (pimentão), com a adição de 30 vezes a concentração normal do CuSO₄ no meio MS. O excesso e a ausência de cobre inibem o crescimento e prejudicam importantes processos celulares, como a fotossíntese, a síntese de pigmentos e o transporte de elétrons mitocondrial (NASSAR, 2004).

O aumento da concentração de CuSO₄ até 125µM promoveu um incremento da biomassa fresca da parte aérea, apresentando associação linear positiva com a altura das plantas (Figura 1D, Tabela 1). Esse resultado pode ser devido ao cobre ser constituinte e ativador de enzimas envolvidas no transporte de elétrons e na biossíntese de proteínas e carboidratos. Tais resultados, porém, não foram observados em Dioscorea bulbifera (batata-do-ar), em que concentrações acima do controle promoveram diminuição da biomassa fresca, até mesmo na concentração de 75µM, em que as brotações apresentaram maior comprimento (NARULA et al., 2005). No entanto, o aumento de 50 vezes na concentração de CuSO₄, no meio MS, em Paspalum scrobiculatum (paspalum nativo), e cinco vezes em Stevia rebaudiana (estévia) promoveu um significativo aumento na biomassa dos calos e nos brotos das respectivas plantas (KOTHARI-CHAJER & SHARMAR, 2008).

O efeito do cobre foi bastante visível no comprimento das raízes, observando-se um estímulo no crescimento radicular até 75µM e um efeito deletério a partir dessa concentração. Plantas expostas às concentrações de 175 e 200µM tiveram uma diminuição de aproximadamente quatro vezes no comprimento da raiz, com engrossamento e diminuição de ramificações no sistema radicular (Figura 1E e Figura 2). Esse resultado está de acordo com NASSAR (2004) que observou, em brotos de banana, inibição total da rizogênese no meio de cultivo adicionado de 100µM de CuSO₄.

LLORENS et al. (2000), estudando o efeito do aumento da concentração de cobre em Vitis vinifera (videira), verificaram que os níveis de cobre aumentavam tanto nas folhas, como nas raízes após o estresse, com maior concentração desse nutriente nas raízes. Isso sugere a ocorrência de um mecanismo de imobilização nesse órgão, podendo ser esta a razão para o forte efeito das altas concentrações de cobre no sistema radicular.

A adição de CuSO₄ no meio de cultura, em concentrações maiores que as originais do meio MS, tem apresentado efeitos positivos na produção de metabólitos secundários. Em Dioscorea bulbifera (batata-do-ar), a adição de 75µM de CuSO₄ promoveu um aumento significativo no rendimento de diosgenina (NARULA et al., 2005). Os níveis de quercetina também aumentaram após a adição de 150µM de CuSO₄ em brotos de Plunchea lanceolata (rasna), e a adição de 100µM de CuSO₄ aumentou significativamente o conteúdo de lepidina em Lepidium sativum (agrião-do-seco) (SABA et al., 2000). Resultados semelhantes foram obtidos por TREJO-TAPIA et al. (2001), que verificaram estímulo na produção de betalaínas, em Beta vulgaris (beterraba), quando aumentavam em cinco vezes a concentração de Cu²⁺ em meio B5. Por outro lado, a ausência de cobre no meio de cultura não afetou a produção de betacianina nessa mesma espécie (AKITA et al., 2002).

Neste trabalho foi observado, a partir da concentração de 125µM de CuSO₄, um incremento na produção de betacianina, (Figura 1F), apresentando aumento de 59% no seu teor na concentração de 175µM em relação ao controle (Tabela 2). A análise de correlação demonstrou, com exceção do número de brotos por explante, associação linear negativa entre a concentração de betacianina e as variáveis morfológicas analisadas (Tabela 1).

Como o cobre é um elemento constituinte da enzima tirosinase, que cataliza a hidroxilação da tirosina para DOPA (dihidroxifenilalanina) e a subsequente oxidação desta na rota de biossíntese de betalainas (STEINER et al., 1999), o incremento da produção de betacianina, neste trabalho, pode ter sido influenciada pela maior disponibilidade desse íon.

CONCLUSÃO

Altas concentrações de sulfato de cobre estimulam a biossíntese de betacianinas, porém apresentam efeitos deletérios para o crescimento das plantas de A. philoxeroides (erva-de-jacaré).

Recebido para publicação 07.06.10

Aprovado em 17.08.10

Devolvido pelo autor 02.09.10

CR-3674

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1

Autor para correspondência.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Out 2010
• Data do Fascículo
  Set 2010

Histórico

• Aceito
  17 Ago 2010
• Recebido
  07 Jun 2010