A reação em cadeia da polimerase na detecção da resistência à penicilina em Streptococcus pneumoniae

Resumos

BACKGROUND: Streptococcus pneumoniae is the most common etiologic agent of community-acquired respiratory infections. In recent years, S. pneumoniae resistance to antimicrobial agents has increased. Minimum inhibitory concentration (MIC) is routinely used to determine resistance. Polymerase chain reaction (PCR) detects the genes responsible for Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin within approximately 8 hours. OBJECTIVE: To compare the PCR and MIC methods in determining Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin. METHOD: A total of 153 Streptococcus pneumoniae samples, isolated from various anatomical sites, were evaluated in order to detect mutations in the genes encoding pbp1a, pbp2a and pbp2x, which are responsible for Streptococcus pneumoniae penicillin resistance. A correlation was found between mutations and penicillin MIP, as determined by the agar diffusion method. RESULTS: Overal Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin was 22.8% (16.3% intermediate resistance and 6.5% high resistance). In a statistically significant finding, we observed no mutations in the penicillin-sensitive samples and only one mutation, typically in the gene encoding pbp2x, among the samples with intermediate resistance, whereas mutations in all three genes studied were observed in the high-resistance samples. CONCLUSION: For determining Streptococcus pneumoniae resistance to penicillin, PCR is a rapid method of detection that could well be used in clinical practice.

Streptococcus pneumoniae; Penicillin resistance; Polymerase chain reaction

ARTIGO ORIGINAL

A reação em cadeia da polimerase na detecção da resistência à penicilina em Streptococcus pneumoniae^*

Eduardo Walker Zettler ^{(TE SBPT)}; Rosane M. Scheibe; Cícero A. G. Dias; Patrícia Santafé; José da Silva Moreira; Diógenes S. Santos; Carlos Cezar Fritscher

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: O Streptococcus pneumoniae é o mais freqüente agente etiológico de infecções respiratórias adquiridas na comunidade e sua resistência aos antimicrobianos tem aumentado nos últimos anos. A determinação da resistência é feita rotineiramente por método lento que depende do crescimento em cultura e determinação da concentração inibitória mínima (CIM). A reação em cadeia da polimerase (PCR) detecta os genes responsáveis pela resistência do Streptococcus pneumoniae a penicilina em cerca de 8 horas.

OBJETIVO: Comparar a PCR com o método da CIM no diagnóstico da resistência da Streptococcus pneumoniae a penicilina.

MÉTODO: Foram estudadas 153 amostras de Streptococcus pneumoniae, isoladas de diferentes sítios anatômicos, usando-se para detecção de mutações nos genes que codificam as proteínas ligadoras de penicilina 1a, 2b e 2x, responsáveis pela resistência à penicilina. A ocorrência das mutações foi correlacionada com a CIM de penicilina, determinada pelo teste de difusão em ágar.

RESULTADOS: A resistência global à penicilina do Streptococcus pneumoniae foi de 22,8% (16,3% de resistência intermediária e 6,5% de resistência alta). Em proporções estatisticamente significativas, as amostras sensíveis à penicilina não tinham mutações, as intermediárias apenas uma, geralmente na proteína ligadora de penicilina 2x, e as altamente resistentes tinham mutações nas três proteínas investigadas.

CONCLUSÃO: A PCR é um método rápido para a detecção da resistência à penicilina do Streptococcus pneumoniae, que poderá vir a ser utilizado na prática clínica.

Descritores: Streptococcus pneumoniae. Resistência à penicilina/métodos. Reação em cadeia por polimerase.

INTRODUÇÃO

Em todo o mundo, o Streptococcus pneumoniae é o mais freqüente agente etiológico de infecções adquiridas na comunidade que acometem o sistema respiratório e está associado com 3 a 5 milhões de mortes por ano⁽¹⁾. Nos EUA, é responsável por 500.000 casos anuais de pneumonia, 50.000 casos de bacteremia, 3.000 casos de meningite e cerca de 7 milhões de casos de otite média aguda^(2,3).

A resistência do pneumococo à penicilina vem aumentando de forma significativa nos últimos anos, particularmente em países europeus como Espanha, França e Hungria, onde alcança até 71% de resistência^(4,5). Nos EUA, ela chega a atingir 44% em alguns estados^(6,7). Já na Ásia, podemos encontrar alarmantes índices de 70% a 78% de resistência em Hong Kong, Coréia do Sul e Taiwan^(8-10).

No Brasil, alguns estudos mostram níveis de resistência próximos a 20%^(11-13), mas um trabalho recente detectou resistência à penicilina em 42,1% (26,8% de resistência intermediária e 15,3% de alta resistência) dos isolados oriundos de três países latino-americanos (Argentina, Brasil e México)⁽¹⁴⁾.

A resistência do S. pneumoniae aos antibióticos beta-lactâmicos deve-se exclusivamente a mutações nas proteínas ligadoras de penicilinas (PLP), que são o seu alvo natural, que impedem a ligação e as tornam indiferentes aos beta-lactâmicos, ou seja, diminuem a afinidade de ligação com essas drogas. Em isolados altamente resistentes ocorre uma redução da capacidade de ligação às moléculas de antibióticos em pelo menos 3 das 5 PLP existentes: PLP 1a, PLP 2x e PLP 2b^(15-17).

A determinação da resistência é realizada rotineiramente utilizando-se testes de mensuração da concentração inibitória mínima (CIM) do antibiótico testado, através de métodos laboratoriais como o teste de diluição em ágar, que é o recomendado pelo National Comittee for Clinical Laboratory Standards. Esses métodos apresentam como principal inconveniente o tempo necessário para a obtenção do resultado, geralmente superior a 48 horas⁽¹⁸⁾.Utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) é possível detectar-se as mutações responsáveis pela resistência do pneumococo à penicilina em tempo bem mais curto, próximo a 8 horas⁽¹⁹⁾ .

Com o atual crescimento da resistência do pneumococo, torna-se imperioso o desenvolvimento de uma técnica diagnóstica rápida e confiável, capaz de proporcionar uma terapêutica precoce e adequada aos casos de infecção por cepas resistentes. Assim, este estudo tem como objetivo principal comparar a PCR com o teste de diluição em ágar e determinação da CIM no diagnóstico da resistência do S. pneumoniae à penicilina.

MÉTODO

No período de janeiro de 1997 a setembro de 2000, no Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Pesquisas Biomédicas da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, foi realizado este estudo transversal de prevalência. Foram estudadas 197 amostras clínicas de S. pneumoniae, identificadas pelas técnicas laboratoriais convencionais, isoladas de qualquer sítio anatômico nos laboratórios de microbiologia de sete hospitais de Porto Alegre (RS), representativos da comunidade local, escolhidos por conveniência, e que colaboraram com o estudo (Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Irmandade Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre, Hospital da Criança Santo Antônio, Hospital Mãe Deus, Hospital Moinhos de Vento, Hospital Nossa Senhora da Conceição e Hospital São Lucas da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul)⁽¹⁸⁾. Foram consideradas amostras coletadas de um mesmo paciente, simultaneamente ou em tempos distintos. Amostras não identificadas como pneumococo através dos métodos convencionais padronizados pelo National Comittee for Clinical Laboratory ⁽¹⁸⁾, e amostras sem a identificação do gene lytA pela PCR, conforme técnica descrita a seguir, foram excluídas do estudo.

A CIM de penicilina foi medida através do teste de diluição em ágar em meio Mueller-Hinton (Oxoid Unipath Ltd.; Hampshire, Inglaterra) contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Os pontos de corte foram aqueles publicados pelo National Comittee for Clinical Laboratory ⁽¹⁸⁾: sensíveis (CIM £ 0,06 mg/mL), resistência intermediária (CIM de 0,12 a 1,0 mg/mL), e alta resistência (CIM ³ 2,0 mg/mL). A cepa de S. pneumoniae ATCC 49619 foi empregada para controle de qualidade do teste de susceptibilidade⁽¹⁸⁾.

As amostras isoladas nos meios de cultura foram simultaneamente submetidas à PCR para detecção do gene lytA do S. pneumoniae, conforme descrito por Ubukata et al.⁽¹⁹⁾, para confirmação da identificação bacteriana e de mutações nas PLP 1a, 2b e 2x, conforme protocolo introduzido por Jalal et al.⁽²⁰⁾, como descrito a seguir.

Colônias isoladas de S. pneumoniae foram retiradas do meio de cultura através de raspagem com alça de platina e colocadas em tubo com 50 ml de água bidestilada, para a extração do DNA bacteriano. A seguir, eram adicionados 50 ml de proteinase K. O material era então incubado a 50ºC durante 16 horas. Em seguida, era feita a inativação da proteinase K, a 95ºC por 10 minutos.

Para a seleção dos iniciadores, foram utilizados oligonucleotídeos iniciadores (primers) derivados do gene lytA do S. pneumoniae, e dos genes que codificam as PLP 2b e 2x de S. pneumoniae sensíveis à penicilina e a PLP 1a de S. pneumoniae resistente à penicilina, que apresentavam as seqüências a seguir:

Foram preparadas duas misturas para as reações, uma contendo os primers para amplificação dos genes das PLPs 2b e 2x e a outra contendo os primers dos genes da PLP 1a e do gene lytA, conforme descrição a seguir: 5 ml tampão específico para a Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl₂, 1U Taq DNA polimerase 5 U/ml (Gibco), 200 mM mistura equimolar dos nucleotídeos trifosfatados, 50 pmol de cada um dos dois pares de primers.

Para a preparação da amostra a ser amplificada e dos controles negativo e positivo, misturavam-se 2 ml do DNA extraído de S. pneumoniae com 48 ml da mistura-mestra. Como controle negativo da reação utilizavam-se 2 ml de água bidestilada adicionados a 48 ml da mistura de reação. Como controle positivo, na mistura 1, utilizavam-se 2 ml de DNA extraído da amostra de S. pneumoniae já identificada previamente como sensível à penicilina e, na mistura 2, 2 ml de DNA extraído de amostra identificada como resistente, adicionados a 48 ml de cada mistura de reação.

Com relação aos ciclos de amplificação, as amostra preparadas com os respectivos controles positivo e negativo eram colocadas no termociclador e submetidas a 35 ciclos, após uma desnaturação inicial a 94ºC por três minutos. Cada ciclo consistia de desnaturação a 94ºC durante 30 segundos, anelamento a 60ºC durante 30 segundos e extensão a 72ºC durante dois minutos. Após os 35 ciclos de amplificação, os tubos eram submetidos a uma extensão final a 72ºC durante sete minutos.

Para a eletroforese, separavam-se 20 ml da solução resultante, que eram aplicados no gel de agarose 2% (SIGMA), contendo 2 mg/ml de brometo de etídio (SIGMA). A eletroforese era realizada a 15 volts/cm, com duração de aproximadamente 30 minutos. O gel era visualizado sob luz ultravioleta e gravado no GELDOC 1000, utilizando-se o software Molecular Analyst (Biorad). As amostras positivas produziam uma banda visível com os seguintes tamanhos: PLP 2b: 359 pares de bases, PLP 2x: 277 pares de bases, PLP 1a: 423 pares de bases, gene lytA: 273 pares de bases (Figura 1).

A análise estatística foi realizada relacionando-se inicialmente o número de mutações em cada amostra, determinado pela PCR, com o grau de resistência das mesmas, determinado pela sua CIM. Em cada grupo de amostras com diferentes números de mutações (nenhuma mutação, 1 mutação, 2 mutações ou 3 mutações), foi feita uma comparação pareada entre os graus de resistência das mesmas (sensíveis x intermediárias, sensíveis x resistentes e intermediárias x resistentes), utilizando-se o teste do Qui-quadrado para comparação entre proporções (heterogeneidade), com um grau de liberdade, aplicando-se a correção de Yates, considerando-se um nível de significância estatística de 95% (p < 0,05). A seguir foi feita a relação entre as mutações em cada uma das três PLP estudadas com o grau de resistência das amostras determinado pela CIM. Em cada grupo de amostras com mutação numa determinada PLP (PLP 1a, PLP 2b ou PLP 2x) foi realizada uma comparação pareada entre o grau de resistência das mesmas (sensíveis x intermediárias, sensíveis x resistentes e intermediárias x resistentes), também se empregando o teste do Qui-quadrado para comparação entre proporções (heterogeneidade), com um grau de liberdade, aplicando-se a correção de Yates, sendo igualmente considerado um nível de significância de 95% (p < 0,05).

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul.

RESULTADOS

Das 197 amostras identificadas inicialmente como S. pneumoniae nos laboratórios de microbiologia dos hospitais de origem, 34 (17,2%) foram excluídas do estudo por não crescerem no meio de cultura após terem sido descongeladas (morte bacteriana), ou por não se confirmar a identificação da espécie bacteriana através dos testes microbiológicos.

Restaram 163 amostras que foram submetidas simultaneamente aos testes de determinação da CIM e à PCR para detecção das mutações nas PLP 1a, 2b e 2x e amplificação do gene lytA, para confirmação da identificação bacteriana. A presença do gene lytA foi verificada em 153 amostras. As 10 amostras que não apresentaram este gene foram excluídas da análise final.

A distribuição da resistência do S. pneumoniae nas 153 amostras restantes no estudo, testadas através do método de diluição em ágar de acordo com a sua CIM é mostrada na Tabela 1.

Inicialmente, relacionou-se o número de mutações em cada amostra com o grau de resistência das mesmas, determinado pela CIM. Obteve-se a proporção de amostras sensíveis, de resistência intermediária e de alta resistência com determinado número de mutações e verificou-se a significância estatística das diferenças (Tabela 2).

Não ocorreram amostras resistentes no grupo de amostras sem mutações. A comparação entre amostras sensíveis e intermediárias mostrou-se significativa (c² = 33,89; p < 0,0005).

Não ocorreram amostras com alta resistência no grupo de amostras em que havia uma mutação. A comparação das amostras sensíveis com as de resistência intermediária mostrou-se significativa, com predomínio das sensíveis (c² = 16,277; p < 0,0005).

Com relação às amostras com duas e três mutações, não houve amostras sensíveis, e houve diferença significativa comparando-se as resistências intermediária e alta. Houve predomínio de cepas com resistência intermediária no grupo com duas mutações (c² = 0,006; p = 0,942) e de cepas com alta resistência no grupo com três mutações (c² = 21,843; p < 0,0005).

A seguir, correlacionou-se a presença de mutação em cada uma das três PLP isoladamente com os índices de resistência determinados pela CIM, aplicando-se o teste estatístico para analisar a significância das diferenças encontradas (Tabela 3).

A mutação na PLP 2b determinou ausência de amostras sensíveis. Houve predomínio de alta resistência em relação à resistência intermediária (c² = 18,308; p < 0,0005).

Quanto à mutação na PLP 2x, a comparação entre amostras sensíveis e intermediárias foi significativa: c² = 25,304 (p < 0,0005); a comparação entre amostras sensíveis e resistentes também foi significativa: Qui-quadrado = 18,388 (p < 0,0005); e a comparação entre amostras intermediárias e resistentes não foi significativa: c² = 0,572 (p = 0,4539).

Com relação à mutação na PLP 1a, não houve amostras sensíveis. Ela determinou predomínio de alta resistência (intermediárias x resistentes: c² = 21,843 (p < 0,0005) (Tabela 3).

DISCUSSÃO

A resistência do S. pneumoniae à penicilina em Porto Alegre aumentou consideravelmente nos últimos anos. No estudo de Chatkin et al.⁽²¹⁾, de 1989, era de apenas 3,2%, e atingiu 22,8% no período de nosso estudo. Este índice é semelhante aos encontrados por Sessegolo et al.⁽¹¹⁾ e Levin et al.⁽¹²⁾ no Estado de São Paulo na década de 1990 (24%). Mais recentemente, Mendes et al.⁽¹⁴⁾ estudaram amostras pneumocócicas isoladas em três países da América Latina (Argentina, Brasil e México) e encontraram níveis ainda mais elevados de resistência (42,1%).

É importante ressaltar que entre as cepas resistentes que encontramos, a maioria apresentou resistência intermediária à penicilina (16,3%), e apenas 6,5% demonstraram alta resistência. Conforme já descrito por diversos autores, as amostras com resistência intermediária têm apresentado boa resposta clínica à penicilina em altas doses^(22,23), enquanto que as altamente resistentes podem causar uma maior morbi-mortalidade^(24,25).

Em comparação com levantamentos realizados em outros países, a resistência do pneumococo em nosso meio ainda permanece em níveis inferiores. Nos EUA, por exemplo, o mais recente relatório epidemiológico, publicado por Karlowsky et al.⁽⁶⁾, investigando 27.828 cepas de S. pneumoniae isoladas em vários estados norte-americanos, revelou 18,4% de alta resistência à penicilina.

No presente estudo, encontramos uma associação significativa entre a presença de mutações nos genes que codificam as PLP do S. pneumoniae e os índices de resistência à penicilina in vitro, determinados pela CIM. As amostras sensíveis caracterizaram-se, em proporção estatisticamente significativa dos casos (p < 0,05), pela ausência de mutações nas PLP, as de resistência intermediária pela ocorrência de apenas uma mutação, geralmente na PLP 2x, e as altamente resistentes pela presença de mutações nas três PLP. A presença de mutação isolada na PLP 1a ou na PLP 2b ocorreu em número significativamente maior de amostras com alta resistência do que naquelas com resistência intermediária. Já a mutação na PLP 2x não foi capaz de ser discriminada entre amostras com resistência intermediária ou alta. A associação de mutações em duas ou três PLP correlacionou-se significativamente com a expressão de alta resistência à penicilina. Estes resultados estão em concordância com outros estudos que têm demonstrado que as mutações no genoma da PLP 2x isoladamente resultam em baixo nível de resistência à penicilina, enquanto que a alta resistência à penicilina requer alterações genéticas também nas PLP 1a e 2b^(26-30).

Ubukata et al.⁽¹⁹⁾ estudaram a presença de mutações em genes da PLP 2b de 1.062 amostras clínicas de S. pneumoniae através da PCR, encontrando correlação com os achados da CIM de penicilina em 98,9% das amostras sensíveis e 70,3% das resistentes.

Nagai et al.⁽³⁰⁾ avaliaram a presença de mutações nos genes das PLP 2b e 2x em 218 amostras de S. pneumoniae isoladas de crianças no Japão. As mutações na PLP 2x foram observadas em diversas cepas com resistência intermediária à penicilina. Em 41,3% das amostras sensíveis ao cefotaxime encontraram-se mutações nos genes da PLP 2x, o que sugere que o mecanismo de resistência pode ocorrer mesmo em cepas suscetíveis aos antimicrobianos, e pode preceder a resistência detectada in vitro. Em nosso estudo, este achado reproduziu-se, tendo sido encontradas em 84% das amostras com resistência intermediária à penicilina a presença de mutação na PLP 2x, o que mostra que este pode ser um marcador de menor nível de resistência. Assim, não foi possível a discriminação entre amostras intermediárias e altamente resistentes à penicilina utilizando-se as alterações na PLP 2x isoladamente, mas foi possível diferenciar significativamente as cepas sensíveis das que apresentavam algum grau de resistência (intermediária ou alta).

A detecção da PLP 1a através da PCR foi utilizada por du Pleiss et al.⁽²⁹⁾ em 183 isolados clínicos de S. pneumoniae, que obtiveram uma concordância de 98,3% entre os resultados da PCR e os dados de CIM de penicilina. Os valores preditivos positivo e negativo desta técnica molecular foram de 100% na detecção de amostras com CIM ³ 1 mg/mL. Similarmente, em nossas amostras com alta resistência à penicilina, encontramos a presença de mutação na PLP 1a em 90% dos casos (9/10 casos). Em apenas uma amostra, classificada como altamente resistente à penicilina pelas diretrizes do National Comittee for Clinical Laboratory, não se detectou alteração na PLP 1a. Essa amostra apresentava CIM = 2,0 mg/mL, valor que se encontra exatamente em cima do ponto de corte que divide as amostras entre intermediárias ou altamente resistentes à penicilina. No entanto, essa diferença entre os métodos fenotípicos e genotípicos neste caso isolado não afetou a efetividade do método.

O único estudo prévio que analisou a presença de mutações nas três PLP (1a, 2b e 2x), simultaneamente, relacionando-as com a resistência bacteriana, foi o de Jalal et al.⁽²⁰⁾, que, estudando 230 isolados clínicos de S. pneumoniae, identificou 93% das amostras sensíveis, 85% das intermediárias e 100% das altamente resistentes através da PCR. No entanto, as mutações na PLP 1a não tiveram boa correlação com a resistência in vitro e foram excluídas da análise de dados, que se limitou à avaliação das PLP 2b e 2x. Mesmo assim, os resultados alcançados foram considerados potencialmente úteis clinicamente, apesar de não ter sido feita uma análise estatística mais aprofundada.

Um fator muito importante na abordagem de um paciente com infecção pneumocócica é a introdução precoce da terapêutica antimicrobiana, o que pode ser decisivo na evolução e prognóstico da doença^(31,32). Através dos métodos microbiológicos convencionais leva-se, no mínimo, 24 horas para o crescimento e identificação do germe nos meios de cultura e mais 24 horas para a realização dos testes de suscetibilidade⁽¹⁸⁾. Todas as etapas da técnica da PCR descritas no presente estudo podem ser realizadas em até 8 horas, e há a confirmação do agente etiológico e a identificação do seu nível de resistência simultaneamente, o que possibilita um início de tratamento muito mais rápido e adequado.

Desta forma, através do presente estudo pretendemos demonstrar a potencial aplicabilidade clínica da técnica da PCR na detecção precoce da resistência bacteriana do S. pneumoniae, devido à sua rapidez e facilidade de execução em laboratórios adequadamente equipados.

Recebido para publicação, em 19/2/04.

Aprovado, após revisão, em 12/5/04.

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Trabalho realizado no Laboratório de Biologia Molecular do Instituto de Pesquisas Biomédicas da Pontificia Universidade Catolica do Rio Grande do Sul, PUCRS

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Abr 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Aceito
  12 Maio 2004
• Recebido
  19 Fev 2004