AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE ZIGOTOS MURINOS AO HERPESVÍRUS BOVINO-1: UM MODELO EXPERIMENTAL PARA ESTUDOS DE INTERAÇÕES EMBRIÃO-VÍRUS

D’Angelo, M.; Galuppo, A.G.; Piatti, R.M.; Melo, G.M.; Zerio, N.M.C.; Souza, R.J.

doi:10.1590/1808-1657v72p1432005

RESUMO

O objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilidade de zigotos murinos ao herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), visando a obtenção de um modelo in vitro para estudos sobre a interação embriãovírus e sobre o potencial risco de transmissão de viroses através da técnica de fertilização in vitro (FIV). Foram utilizados camundongos fêmeas (Balb C) entre 6-8 semanas de idade, superovuladas com os hormônios eCG e hCG, acasaladas com machos inteiros para colheita dos zigotos. Esses foram separados em 3 grupos, controle e exposto 24h a duas concentrações da suspensão viral (10 µL e 30 µL). Cada grupo foi dividido para análise da morfologia e para avaliação da presença de partículas virais empregando a reação em cadeia pela polimerase (PCR), após o procedimento de lavagens seqüenciais e tratamento com tripsina. De acordo com os resultados obtidos, os zigotos murinos poderão fornecer subsídios como modelo experimental para estudos sobre a biologia das interações embrião-vírus, uma vez que se apresentaram sensíveis ao BoHV-1.

PALAVRAS-CHAVE BoHV-1; embrião; modelo experimental; PCR

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate mouse zygote susceptibility to BoHV-1, to obtain an in vitro model, to allow studies about embryo-virus interaction and the potential risk of the transmission of the virus through IVF techniques. Female mice (Balb C) aged 6-8 weeks were superovulated with the hormones eCG and hCG and mated for zygotes retrieval. The zygotes were divided in 3 groups: control and exposed to the virus for 24h (two different concentrations -10 µL and 30 µL). Each group was divided for morphological evaluation and polymerase chain reaction (PCR) analysis was performed after sequential washing procedures with trypsin treatment. According to the results, mouse zygotes could be used as an experimental model for embryo-virus biology interaction studies.

KEY WORDS BoHV-1; embryo; experimental model; PCR

INTRODUÇÃO

Atualmente, a produção de embriões in vitro tem sido extensivamente utilizada em pesquisa e também para fins comerciais, uma vez que maximiza o potencial genético de uma mesma fêmea e oferece a possibilidade de acelerar a produção animal (KRUIP et al., 2000). Entretanto, se não forem executadas corretamente, técnicas como a fertilização in vitro (FIV) e a criopreservação de sêmen e embriões podem facilitar a transmissão de diversas doenças infecciosas, como por exemplo, a Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR), Diarréia Viral Bovina (BVD) e Brucelose (PHILPOTT, 1993). Portanto, assim como na produção in vivo de embriões, nas técnicas artificiais de reprodução animal, o cuidado com a transmissão de doenças infecciosas também deve ser constante.

As fontes mais comuns de contaminação são o ambiente onde o material é manipulado, os gametas, tanto femininos quanto masculinos, o líquido folicular, o plasma seminal, células somáticas e materiais de origem animal utilizados no preparo dos meios de cultura (STRINGFELLOW & GIVENS, 2000). Visando assegurar o controle da transmissão de patógenos através da produção e transferência de embriões in vitro foi desenvolvido o método das lavagens seqüenciais juntamente com o tratamento com tripsina (STRINGEFELLOW, 1998). Entretanto, estudos demonstram que o herpesvírus bovino tipo-1 (BoHV-1) e o vírus da estomatite vesicular têm a capacidade de se aderir à zona pelúcida. Dessa maneira, embriões infectados, mesmo após as lavagens, podem ainda apresentarem-se como vetores de transmissão (BIELANSKI et al., 1996; VANROOSE et al., 1996).

Considerando que o BoHV-1 está disseminado em bovinos de todas as regiões do Brasil (DEL FAVA et al., 2003) e de outros países (STRINGFELLOW & GIVENS., 2000), interferindo diretamente nos índices reprodutivos dos plantéis infectados, seu controle é de extrema importância. Vários autores sugerem que o vírus pode ser encontrado em ovários, ovidutos e líquidos foliculares de animais aparentemente sadios (BIELANSKI & DUBUC, 1994; GUERIN et al., 1989).

Sendo assim, a compreensão da natureza da interação patógeno-embrião é fundamental para a melhoria do controle das doenças e possíveis riscos de transmissão de vírus por técnicas de FIV. O objetivo desse trabalho foi avaliar a sensibilidade de zigotos murinos ao BoHV-1, visando a obtenção de um modelo in vitro, para estudos sobre a biologia da interação embrião-vírus e sobre o potencial risco de transmissão de viroses através da técnica de FIV.

MATERIAL E MÉTODOS

Vírus

Foi utilizado o herpesvírus bovino tipo-1 (BoHV-1), amostra Los Angeles, 9ª passagem em células MDBK, com título de 10^7.5 TCID₅₀ /mL, mantida em meio Eagle MEM sem soro fetal bovino a -80° C.

Coleta e infecção dos zigotos

Foram utilizados camundongos fêmeas (Mus musculus), púberes, nulíparas, da linhagem Balb C entre 6 a 8 semanas de idade. Estas foram superovuladas com 5U.I. de gonadotrofina coriônica eqüina (eCG) e após 46h com 5U.I. de gonadotrofina coriônica humana (hCG) via intraperitoneal. Foram então colocadas individualmente com machos inteiros para acasalamento. Dezoito horas após a aplicação do hCG foi realizada a colheita dos zigotos (embriões de 1 dia) com zona pelúcida íntegra. Os zigotos foram lavados por 30 segundos em solução de pronase a 0,5% para remoção das células do cúmulos. Em seguida foram lavados novamente por 3 vezes em solução salina tamponada estéril (PBS), acrescida de 1% de soro fetal bovino (SFB) para inativação da enzima. Os zigotos foram separados em: grupo controle (não exposto ao vírus), e exposto 24h à duas concentrações diferentes da suspensão viral (10 μL e 30 μL). Cada grupo foi dividido para análise da morfologia e para avaliação da presença de partículas virais pela reação em cadeia pela polimerase (PCR). Os zigotos foram mantidos em meio TCM199 suplementado com 10% SFB, 0,2% de piruvato de sódio e bicarbonato em estufa 5% de CO₂ , 90% de umidade à 37º C.

Análise da morfologia

Os zigotos foram analisados quanto à presença de alterações morfológicas nos blastômeros e zona pelúcida, após 24, 48, 72 e 96h de incubação com o BoHV-1. A observação foi feita com o auxílio de um microscópio óptico invertido (100x).

Lavagem seqüencial associada ao tratamento com tripsina

Os dois grupos foram submetidos, separadamente, à lavagem seqüencial associada ao tratamento com tripsina padronizado pela International Embryo Transfer Society (STRINGFELLOW, 1998). Esse método consiste em 5 lavagens dos embriões em PBS, duas lavagens com tripsina 0,25% em solução de citrato de sódio, por 90seg e mais 5 lavagens em meio TCM199 acrescido de 10% de SBF, 0,2% de piruvato de sódio, bicarbonato e 100 µg/mL de gentamicina. No total, os zigotos foram lavados em 12 gotas de 100 µL com troca de ponteira a cada passagem, sendo que o volume transportado de uma gota para outra não excedeu 10 µL.

Extração do DNA

Para a extração do DNA, 50μL da amostra contendo os zigotos foram homogeneizados com 400 μL de TE (10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA pH 8,0) e centrifugados a 13.000 xg por 15min. O pellet foi ressuspenso em 300 μL de tampão de lise (195 μL de água milliQ, 60μL de TNE [500 mM NaCl, 50 mM Tris HCl, 125 mM EDTA pH 8,0], 30μL de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e 0,2 mg de proteinase K/mL) e incubado em banho-maria por 60min a 56º C. À suspensão foram acrescentados 150μL de fenol e, após agitação, a mistura foi centrifugada por 5min a 13.000 xg. Da fase aquosa foram colhidos 300 μL, aos quais foram adicionados 100 μL de uma solução de fenol clorofórmio álcool isoamílico (25:24:1) e, após agitação, a mistura foi centrifugada a 13.000 xg por 5min. A seguir, 200 μL da fase aquosa foi precipitada com 40μL de acetato de sódio 2 M e 480μL de etanol absoluto a -20º C por 12h. Seguido de centrifugação a 13.000 xg por 10min, o DNA foi ressuspenso em 40 μL de TE e estocado a temperatura de -20º C.

Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR)

A reação da PCR foi realizada em um volume de 50 μL, contendo 10μL de DNA, 10 mM de Tris HCl pH 9,0; 1,5 mM de MgCl₂, 200 μM de cada nucleotídeo (dNTPs), 5% de glicerol, 2,5U da enzima Taq DNA polimerase e 50 pmol de cada um dos primers sense e antisense descritos por VILCEK et al. (1994), respectivamente primer 1 (P1: 5’CAC GGA CCT GGT GGA CAA GGA G 3’) e primer 2 (P2: CTA CCG TCA CGT GCT GTG TAC G 3’) que amplificam fragmento de 468 pares de bases (pb) do gene gB do BoHV-1. As amostras foram inicialmente desnaturadas a 95^o C por 5min. A reação de amplificação foi feita com 35 ciclos repetidos de desnaturação (95º C por min), hibridização (57º C por 1min) e extensão (72º C por 1min30seg) e uma extensão final de 10min a 72º C. Como controle negativo foi utilizada a mistura dos reagentes e água milliQ.

Nested-PCR (nPCR)

Para o nPCR foram utilizados os primers 3 (P3: 5’ CCT CTG TGA ACT GCA TCG TGG A 3’) e 4 (P4: 5´TAG CCC TCG ATC TGC TGG AAG C 3’), que amplificam o fragmento interno de 175 pb da gB do BoHV-1 (D’ANGELO, 1998).

Detecção dos produtos amplificados

A detecção do produto amplificado foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE (Tris; Ácido Bórico, EDTA 0,5 M pH 8,0). O gel foi corado com brometo de etídio (5 μg/mL), visualizado em transiluminador U.V. e fotografado em câmera digital (Kodak Digital Science DC-40 Camera).

RESULTADOS

Os zigotos pertencentes ao grupo controle não apresentaram alterações morfológicas, seguindo normalmente seu desenvolvimento (Fig. 1A). Os zigotos infectados apresentaram alterações morfológicas visíveis ao microscópio óptico invertido (100x) após 72h de infecção. Foi observado bloqueio de clivagem no estágio de 2 células, com citoplasma granuloso e aumento de espaço periplasmático indicando contração citoplasmática (Fig. 1B). Após 96h de infecção todos os zigotos apresentavam-se com aspecto degenerativo.

Fig. 1
Embriões murinos do grupo controle (A) (100x) e após 72h de infecção com o BoHV-1 (B) (100x; 10x zoom).

Os zigotos contaminados com as amostras quando submetidos a reação da PCR, baseada em uma seqüência conservada do gene que codifica a gB do BoHV-1, não foram capazes de amplificar o fragmento de 468 pb. Quando estas amostras foram submetidas a nPCR foi detectado o gene da gB do BoHV-1 onde foi observado um fragmento de 175 pb que corresponde ao gene gB do BoHV-1 (Fig. 2).

Fig. 2
Detecção de BoHV-1 em zigotos murinos pela técnica da n-PCR. M-padrão de peso molecular (100-2000 bp). Coluna 1, zigoto controle. Coluna 2, zigoto exposto ao BoHV-1 e submetido à lavagem seqüencial com tripsina. Coluna 3, última gota controle. Coluna 4, última gota experimental.Coluna 5, controle positivo do BoHV-1. Coluna 6, controle negativo.

DISCUSSÃO

Segundo BIELANSKI & DUBUC (1994), a análise quanto à presença do BoHV-1 em complexos oócitos-cumulus, líquido folicular e células da granulosa, do corpo lúteo e da tuba de animais portadores de infecção aguda apresentou-se positiva ao vírus. O BoHV-1 também foi isolado de embriões produzidos in vitro a partir de gametas provenientes de animais sabidamente infectados (BIELANSKI et al., 1998). SINGH et al. (1983) demonstraram que esse vírus pode ser encontrado no líquido de lavagem de embriões provenientes de doadoras infectadas e que não é facilmente eliminado da zona pelúcida de blastocistos intactos com o uso das lavagens sem tripsina. Entretanto, nesse mesmo trabalho, quando o tratamento com tripsina foi incorporado, todas as partículas virais foram eliminadas ou inativadas. O mesmo resultado foi encontrado por STRINGFELLOW et al. (1990), que também relataram a eficiência das lavagens com tripsina para o BoHV-4.

Entretanto, esses dados são controversos, pois experimentos visando avaliar a eficiência do procedimento de lavagem de embriões e do tratamento com tripsina apresentaram resultados contrários. Foram realizados testes com oócitos e embriões infectados experimentalmente e submetidos aos procedimentos de lavagem com e sem tripsina. Os patógenos estudados foram o vírus da língua azul, BoHV-1, BVDV, vírus da febre aftosa e Leptospira sp. Ao final foi verificado que os tratamentos não foram eficientes em remover nenhum dos patógenos completamente (STRINGFELLOW & GIVENS., 2000). Portanto, considerando esses resultados, surge a questão sobre como funcionaria o processo de interação dos patógenos com os gametas e embriões, para que dessa forma possa se desenvolver um método mais eficiente para o controle da transmissão de doenças infecciosas. Convencionalmente, acredita -se que a infecção de embriões ocorra apenas após penetração do agente através de uma falha na zona pelúcida, ou após o hatching, entretanto no caso de patógenos de tamanho extremamente reduzido, como os vírus, ou ativamente invasivos, como algumas bactérias, a zona pelúcida, mesmo estando intacta, não é uma barreira intransponível (STRINGFELLOW & GIVENS., 2000).

Os resultados do presente trabalho mostraram que os zigotos murinos são susceptíveis ao BoHV-1, apresentando alterações morfológicas pós-infecção, como o bloqueio de clivagem, citoplasma granuloso e aumento de espaço periplasmático (Figs. 1A e 1B). As amostras submetidas ao n-PCR demonstraram que mesmo após as lavagens e o tratamento com tripsina, os zigotos infectados ainda permaneciam com partículas virais, aderidas à zona pelúcida ou no interior do embrião (Fig. 2). GALUPPO & D'ANGELO (1999) verificaram que as lavagens seqüenciais não foram eficientes em remover partículas do BoHV-1 de embriões de camundongo experimentalmente infectados. Esses autores observaram a presença de efeito citopático, característico do BoHV-1, em células MDBK após inoculação dessas células com os embriões infectados após as lavagens, comprovando, portanto a presença de partículas com capacidade infectante. No caso do vírus estar presente no interior do embrião, as lavagens não teriam função, uma vez que ele estaria protegido no interior dos blastômeros. Em trabalho realizado por D'ANGELO (1998) foi verificada a presença de partículas semelhantes aos capsídeos virais, com auxílio de microscopia eletrônica de transmissão, no interior de oócitos experimentalmente infectados, após as lavagens e o tratamento com tripsina.

Mesmo considerando a capacidade de penetração do BoHV-1 nos blastômeros, não se deve descartar o uso das lavagens seqüenciais e do tratamento com tripsina, pois já está comprovado que o seu uso regular limita a possibilidade de transmissão de patógenos (STRINGFELLOW & GIVENS, 2000). Deve-se lembrar também que, de acordo com nossos resultados, os zigotos murinos poderão fornecer subsídios como modelo experimental para estudos sobre a biologia das interações embrião-vírus e o potencial risco de transmissão de doenças infecciosas

AGRADECIMENTOS

CNPq e CULTILAB/EMBRIOCARE

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Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
15 Abr 2022
Data do Fascículo
Apr-Jun 2005

Histórico

Recebido
07 Jun 2005
Aceito
30 Jun 2005

Este é um artigo publicado em acesso aberto (Open Access) sob a licença Creative Commons Attribution, que permite uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, sem restrições desde que o trabalho original seja corretamente citado.

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