Avaliação de bactérias endofíticas para o controle biológico da mancha foliar de Exserohilum turcicum em milho

Assessing of endophytic bacteria for biological control of northern corn leaf blight (Exserohilum turcicum)

RESUMO:

A eficácia de nove isolados de bactérias endofíticas foi avaliada no biocontrole da mancha foliar de Exserohilum turcicum, pela microbiolização das sementes e da parte aérea do milho híbrido AS-1548 (72 e 24 horas antes e no mesmo dia da inocula ção do patógeno) em condições de casa de vegetação. Verificou-se que Bacillus subtilis 0G, Bacillus lentimorbus, Streptomyces sp. e Bacillus agaradhaerens se destacaram dos demais, quando aplicados na parte aérea, em todos os intervalos testados, com um controle na ordem de 42 a 61%. Quando as bactérias foram aplicadas nas sementes, Bacillus lentimorbus, Streptomyces sp., Ewingella ameri cana e Xanthomonas axonopodis foram os mais eficientes, com um controle entre 37 e 59%.

PALAVRAS-CHAVE:
controle alternativo; queima de turcicum; bactérias antagônicas; Zea mays

ABSTRACT:

The efficacy of nine endophytic bacterial strains was evaluated on biocontrol of northern corn leaf blight (Exserohilum turcicum), by microbiolization of seeds and aerial parts of maize, hybrid AS-1548 (72 and 24 hours before and at same day of the pathogen inoculation) in greenhouse conditions. It was found that Bacillus subtilis 0G, Bacillus lentimorbus, Streptomyces sp. and Bacillus agaradhaerens highlighted from the others, when applied on aerial parts of maize, in all intervals tested, presenting control in order of 42 to 61%. When the bacteria were applied on seeds, Bacillus lentimorbus, Streptomyces sp., Ewingella americanaand Xanthomonas axonopodis showed more efficiency, presenting control between 37 and 59%.

KEYWORDS:
alternative control; Exserohilum turcicum leaf spot; antagonic bacteria; Zea mays

INTRODUÇÃO

A mancha foliar de Exserohilum, "northern corn leaf blight ou queima das folhas do milho, causada pelo fungo Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard & Suggs (teleomorfo Setosphaeria turcica), é uma das mais importantes doenças da cultura do milho. Ela ocorre de forma generalizada em todo o mundo, podendo causar danos superiores a 50%, como resultado de desfolhamento extensivo durante o período de enchi mento de grãos (Fernandes; Balmer, 2002). No Brasil, ocorre em todas as regiões produtoras, principalmente na região Sul e nas chapadas da região Centro-Oeste (Pereira, 1995), onde o patógeno encontra condições ambientais favoráveis ao seu desenvolvimento, como temperaturas moderadas (18 a 27°C), períodos prolongados de orvalho e dias nublados. O controle é feito, principalmente, por meio do uso de cultivares resistentes e químico com fun gicidas específicos (Pinto, 2004).

Devido aos problemas decorrentes da utilização indiscri minada de agrotóxicos, tem-se buscado alternativas eficientes e pouco impactantes no controle de fitopatógenos (Campanhola; Bettiol, 2003). Nesse contexto, os micro-organismos endofíticos têm se apresentado como uma alternativa promissora e viável para esse fim, pela ação de vários mecanismos, como antibiose, competição por espaço e nutrientes ou pela indu ção de resistência sistêmica no hospedeiro (Azevedo, 1998; Van Loon et al., 1998).

Para que haja um controle eficiente de um fitopató- geno por um determinado agente de controle biológico, há a necessidade de se levar em consideração alguns fatores, como, por exemplo, a melhor forma de introduzi-lo no hospedeiro (Silva et al., 2004) ou mesmo o momento mais adequado para a aplicação do agente de biocontrole na planta hospe deira (Shiomi et al., 2006).

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia da proteção conferida por bactérias endofíticas ao agente causal da mancha foliar de Exserohilum, aplicadas de diferentes for mas: pela semente e pela parte aérea das plantas de milho em diferentes períodos (72 e 24 horas antes e no mesmo dia da inoculação do fitopatógeno).

MATERIAL E MÉTODOS

Neste estudo foram testados nove isolados de bactérias endofíticas, selecionados previamente em testes de antagonismo in vitro (Shiomi et al., 2008), consistindo de seis isolados endofíticos do milho: Escherichia coli Escherich GC subgrupo B; Morganella morganii (Winslow) Fulton; Ewingella americanaGrimont; Xanthomonas axonopodis Hasse; Microbacterium imperialeSteinhaus; Bacillus agaradhaerens Nielsen; e dos endofíticos: Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn 0G; Bacillus lentimorbus Dutky e Streptomyces sp. Waksman & Henrici, provenientes da coleção de micro-organismos do Laboratório de Microbiologia Ambiental da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna (SP).

Para a realização dos testes, foi utilizado um genótipo de milho suscetível à doença, híbrido simples, AS-1548 (Agroeste Sul Sementes S.A.). A semeadura foi feita em vasos com cinco litros de capacidade, contendo uma mistura de latossolo verme lho-amarelo não esterilizado, N-P-K (4-14-8) a 1,0 g.dm^-3 de solo, calcário calcítico a 1,5 g.dm^-3 de solo e substrato comercial Multiplant (Terra do Paraíso LTDA.), na proporção 1:3 (v/v), sendo mantidos sob condições de casa de vegetação e irrigação diária.

Preparo da suspensão de micro-organismos: culturas de E. turcicum com 15 dias de crescimento em meio batata-dextrose-ágar (BDA) foram utilizadas para a obtenção de uma suspensão de conídios e padronizadas em 3.10⁴ conídios.mL^-1, com o auxílio de hemocitômetro. Os micro-organismos endofíticos foram multiplicados e incubados em meio caldo triptona de soja-ágar (TSBA) a 25 ± 2°C por 48 horas, para posterior inoculação. As suspensões de células bacterianas foram padronizadas em 10⁹ufc.mL^-1, pelo ajuste de turbidez, na escala de McFarland.

Microbiolização da parte aérea: a aplicação das bactérias endofíticas se deu em 3 períodos diferentes: 72 e 24 horas antes e no mesmo dia da inoculação do patógeno, pela pulverização da parte aérea de plantas jovens (estádio de crescimento de 3 - 4 folhas) com uma suspensão do endofítico antagonista até o ponto de escorrimento. Foi adotado um delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro repetições (cinco plantas por repetição). Cada isolado endofítico testado representou um tratamento. A testemunha positiva consistiu da pulverização das plantas apenas com a suspensão do patógeno. A testemunha negativa consistiu da pulverização das plantas apenas com água destilada esterilizada, perfazendo um total de 11 tratamentos.

Microbiolização das sementes: sementes de milho foram imersas em suspensão contendo células do endofítico antago nista por 60 minutos e semeadas nos vasos contendo o subs trato. Cada isolado endofítico representou um tratamento em três repetições (cinco plantas jovens por repetição), em um delineamento inteiramente ao acaso. Como testemunha negativa foram utilizadas sementes tratadas com água desti lada e esterilizada, inoculadas posteriormente com água, em vez do patógeno; como testemunha positiva, sementes trata das com água e posteriormente inoculadas com o patógeno, totalizando 11 tratamentos.

Inoculação do patógeno: decorridos 14 dias após a semea dura, no estádio de crescimento de 3 - 4 folhas, realizou-se a inoculação da parte aérea das plantas, pela pulverização de uma suspensão de conídios do patógeno, com o auxílio de um compressor de ar (10 libras.pol^-2 de pressão). Antes e após a inoculação, as plantas foram submetidas a 24 horas de incu bação em câmara úmida e no escuro (23 ± 2°C), sendo, em seguida, transferidas para a casa de vegetação (25 ± 3°C), onde foram mantidas sob irrigação diária, até o momento da ava liação dos sintomas.

Avaliação dos sintomas: avaliou-se a severidade da doença, 14 dias após a inoculação do patógeno (Esteves, 1989), pela adoção de uma escala de notas, conforme o descrito por Fernandes; Balmer (2002):

• nota 1 - plantas limpas ou apresentando pontos cloróticos;

• nota 2 - pequenas lesões clorótico-necróticas de formato circular;

• nota 3 - lesões clorótico-necróticas maiores, podendo coalescer;

• nota 4 - lesões necróticas estreitas;

• nota 5 - lesões necróticas largas, com ou sem murcha e/ ou seca das extremidades das folhas.

Os dados obtidos foram submetidos à análise de variân cia e aos testes F e de Tukey (5%).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Nos testes em que houve a aplicação da parte aérea das plantas com os agentes de biocontrole, os isolados B. subtilis 0G, B. lentimorbus, Streptomyces sp. e B. agaradhaerens se destacaram dos demais, em todos os intervalos de aplicação testados, com um controle na ordem de 42 a 61% (Tabela 1). Resultados semelhantes obtidos por Shiomi et al. (2006) mostraram que a eficiência de certas bactérias endofíticas em controlar alguns fitopatógenos pode variar em função do momento de aplicação do agente de biocontrole. Nos testes em que houve a microbiolização das sementes com os antagonistas, observou-se que os isolados B. lentimorbus, Streptomyces sp., Ewingella americana e X. axonopodis foram os mais eficientes, com um controle relativo variando entre 37 e 59% (Tabela 2).

Tabela 1:
Efeito da microbiolização da parte aérea do milho com endofíticos antagonistas no controle da mancha foliar de Exserohilum turcicum.

• *médias não seguidas pela mesma letra diferem entre si, com nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. C.R.(%) = (SD - SE)/SD x 100, sendo: SD = severidade da doença no tratamento controle com o patógeno. SE = severidade da doença no tratamento com o isolado endofítico

Tabela 2:
Efeito da microbiolização de sementes de milho com endofíticos antagonistas no controle da mancha foliar de Exserohilum turcicum.

• *médias não seguidas pela mesma letra diferem entre si, com nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. C.R.(%) = (SD - SE)/SD x 100, sendo: SD = severidade da doença no tratamento controle com o patógeno. SE = severidade da doença no tratamento com o isolado endofítico

Os endofíticos B. lentimorbus e Streptomycessp. foram os únicos que se mostraram eficientes no controle patógeno em todos os ensaios, indicando uma inespecificidade de ação ou mesmo a ocorrência de mais de uma forma de controle, como: antibiose, lise das estruturas do patógeno e competição ou mesmo por indução de resistência sistêmica no hospedeiro, uma vez que atividades de inibição foram observadas em testes específicos, como antagonismo in vitro (Shiomi et al., 2008) e pela aplicação dos agentes de controle biológico nas sementes ou sobre plantas de milho, em diferentes intervalos de tempo.

Dos endofíticos que se destacaram no presente trabalho, é conhecida a ação antagônica a fitopatógenos de B. subtilis0G, B. lentimorbus e Streptomyces spp., tanto em testes in vitrocomo em plantas (Amorim; Melo, 2002; Baumgartner; Warnock, 2006; Sabaratnan; Traquair, 2002; Shiomi et al., 2006). Alguns trabalhos demonstraram a capacidade de B. agaradhaerensem produzir enzimas extracelulares como endoglucanases, relacionadas à degradação da parede celular de fitopatógenos (Hirasawa et al., 2006). Embora não se tenha observado a ocorrência de Ewingella americana como agente de biocontrole de fitopatógenos, há relatos da sua aparente ação micopatogênica e quitinolítica a Burkholderia gladioli pv. agaricicola e a Agaricus bisporus, Lentinula edodes e Pleurotus ostreatus (Chowdhury; Heinemann, 2006; Reyes et al., 2004). Não foram encontrados relatos da ação de X. axonopodis no controle de fitopatógenos.

Dessa forma, neste trabalho, foi possível concluir que as bactérias endofíticas Bacillus subtilis 0G, Bacillus lentimorbus, Streptomyces sp. e Bacillus agaradhaerensreduzem a severidade da mancha foliar de Exserohilum turcicum,quando pulverizados na parte aérea de plantas de milho; B. lentimorbus, Streptomyces sp., Ewingella americana e Xanthomonas axonopodis reduzem a severi dade da doença, quando inoculados em sementes de milho; B. len timorbus e Streptomyces sp. reduzem a severidade da doença tanto pela microbiolização das sementes como da parte aérea de milho.

Ainda que se tenha evidenciado a ocorrência de isolados bacterianos promissores no biocontrole de fitopatógenos, há a necessidade da realização de mais estudos para a avalia ção do seu real potencial de uso para esse fim, como: o seu modo de ação, a sua aplicação em diferentes densidades popu lacionais, a sua ação conjunta ou mesmo a sua reação a fatores abióticos, como a exposição a agroquímicos.

REFERÊNCIAS

• AMORIM, E.P.R.; MELO, I.S. Ação antagônica de rizobactérias contra Phytophthora parasitica e P. citrophthora e seu efeito no desenvolvimento de plântulas de citros. Revista Brasileira de Fruticultura v.24, n.2, p.565-568, 2002.
• AZEVEDO, J.L. Microrganismos endofíticos. In: MELO, I.S.; AZEVEDO, J.L. Ecologia Microbiana Jaguariúna: Embrapa-CNPMA, 1998. p.117-137.
• BAUMGARTNER, K.; WARNOCK, A. A soil inoculant inhibits Armillaria mellea in vitro and improves productivity of grapevines with root disease. Plant Disease v.90, n.4, p.439-444, 2006.
• CAMPANHOLA, C.; BETTIOL, W. Panorama sobre o uso de agrotóxicos no Brasil. In:; CAMPANHOLA, C. BETTIOL, W. (eds.). Métodos alternativos de controlefitossanitário Jaguariúna: Embrapa Meio Ambiente, 2003. 279p.
• CHOWDHURY, P.R.; HEINEMANN, J.A. The general socrotory pathway of Burkholderia gladioli pv. agaricicola BG1 64R is necessary for cavity disease in white button mushrooms. Applied and Environmental Microbiology v.72, n.5, p.3558-3565, 2006.
• ESTEVES, M.C.F. Reações a Exserohilum turcicum (Pass.) Leonard & Suggs em milho (Zea Mays L.) e variabilidade do patógeno 1989. 55f. Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, 1989.
• FERNANDES, M.C.A.; BALMER, E. Variabilidade de isolados de Exserohilum turcicum em cultivares de milho (Zea mays)Revista Universidade Rural. Série Ciências da Vida v.22, n.1, p.1-5, 2002.
• HIRASAWA, K.; UCHIMURA, K.; KASHIWA, M.; GRANT, W.; ITO, S.; KOBAYASHI, T.; HORIKOSHI, K. Salt-activated endoglucanase of a strain of alkaliphilic Bacillus agaradhaerensAntonie van Leeuwenhoek v.89, n.2, p.211-219, 2006.
• PEREIRA, O.A.P. Análise da situação atual de doenças do milho no Brasil e disponibilidade de germoplasma resistente. Summa Phytopathologica v.21, n.1, p.67-70, 1995.
• PINTO, N.FJ.A. Controle químico de doenças foliares do milho, Revista Brasileira de Milho e Sorgo v.3, n.1, p.134-138, 2004.
• REYES, J.E.; VENTURINI, M.E.; ORIA, R.; BLANCO, D. Prevalence of Ewingella americana in retail fresh cultivated mushrooms (Agaricus bisporus, Lentinula edodes and Pleurotus ostreatus) in Zaragoza (Spain). FEMS Microbiology Ecology v.47, n.3, p.291 -296, 2004.
• SABARATNAN, S.; TRAQUAIR, J.A. Formulation of a Streptomycesbiocontrol agent for the suppression of Rhizoctonia solanidamping-off in tomato transplants. Biological Control v.23, n.3, p.245-253, 2002.
• SHIOMI, H.F.; MELO, I.S. MINHONI, M.T.A. Seleção de bactérias endofíticas com ação antagônica a fitopatógenos. Scientia Agraria v.9, n.4, p.535-538, 2008.
• SHIOMI, H.F.; SILVA, H.S.A.; MELO, I.S. NUNES, F.V.; BETTIOL, W.Bioprospecting endophytic bacteria for biological control of coffee leaf rust. Scientia Agricola v.63, n.1, p.32-39, 2006.
• SILVA, H.S.A.; ROMEIRO, R.S.; MACAGNAN, D.; HALFELD-VIEIRA, B.A.; PEREIRA, M.C.B.; MOUNTEER, A. Rhizobacterial induction of systemic resistance in tomato plants: non-specific protection and enzyme activities. Biological Control v.29, p.288-295, 2004.
• VAN LOON, L.C.; BAKKER, P.A.H.M.; PIETERSE, C.M.J. Systemic resistance induced by rhizosphere bacteria. Annual Review of Phytopathology v.36, p.453-483, 1998.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2015

Histórico

• Recebido
  15 Jul 2013
• Aceito
  04 Mar 2015