Criopreservação de medula óssea e células pluripotentes periféricas utilizando um congelador programável: experiência em 86 congelamentos

Cryopreservation of bone marrow and peripheral blood stem cells using a controlled rate freezing system. Experience on 86 procedures

Artigo Original

Criopreservação de medula óssea e células pluripotentes periféricas utilizando um congelador programável: experiência em 86 congelamentos

C.M. Massumoto, S. Mizukami, M.F. Campos, L.A.G. SIlva, A. Mendrone Jr., A. Sakashita, E. Zambon, M. Ostronoff, M.C. A. Macedo, R. Medeiros, P. Dorlhiac, D. Chamone, F. Dulley

Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Departamento de Transplante de Medula Óssea da Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo, São Paulo, SP.

RESUMO — A infusão de células hematopoéticas totipotentes criopreservadas permite a recuperação da hematopoese após quimioterapia mieloablativa.

OBJETIVO. A formação de cristais de gelo durante o processo de congelamento é o fator principal que causa ruptura das estruturas celulares. A criopreservação dessas células a uma taxa constante preveniria os danos causados pelo congelamento brusco.

MÉTODOS. Vinte e três pacientes com mediana de 25 anos (variação 3-57) tiveram a medula óssea e/ou células-tronco periféricas (CTP) coletadas no período de março de 1993 a outubro de 1994, totalizando 86 congelamentos. Os pacientes apresentavam as seguintes neoplasias: linfoma não-Hodgkin (n=5), leucemia mielóide aguda (n=8), leucemia linfóide aguda (n=6), doença de Hodgkin (n=3) e mieloma múltiplo (n=1). O congelamento foi controlado por um computador, acoplado ao sistema, às seguintes temperaturas: -1°C/min até -45°C e depois a -10°C/min até -80°C. Após o congelamento, as células foram mantidas em freezer a -110°C até o momento da infusão. Para obtenção das CTP, empregou-se o fator de crescimento estimulante de granulócitos (G-CSF).

RESULTADOS. Uma mediana de 3,16 x 10⁸ céls./kg (variação 0,86-24,22) de CTP e 2,03 x 10⁸ céls./kg (variação 0,19-12,21) de medula óssea foi congelada. A mediana para atingir granulócitos maior ou igual a 500/µL e plaquetas maior que 20.000/µL foi de 12 dias (variação 8-40) e 31 dias (variação 8-80), respectivamente. Todos os pacientes tiveram recuperação hematopoética após a infusão das células criopreservadas.

CONCLUSÃO. A criopreservação em congelador programável permite o armazenamento de células hematopoéticas e, potencialmente, pode causar menor dano celular.

UNITERMOS: Transplante de medula óssea. Congelamento. Células primitivas.

INTRODUÇÃO

A utilização das células pluripotentes (stem cell) criopreservadas, presentes na medula óssea ou no sangue periférico após sua infusão, permite a recuperação medular após a administração de altas doses de quimioterapia¹. A formação de cristais de gelo durante o processo de criopreservação é um evento importante e é a principal causa de destruição celular e retardo na recuperação medular após infusão das células descongeladas.

Os cristais de gelo intracelulares, que, muitas vezes, promovem a ruptura mecânica das estruturas celulares, são formados durante o processo de congelamento rápido das células. No congelamento gradativo, com decréscimo gradual e constante da temperatura, a formação de gelo será primariamente extracelular, ocorrendo menor dano celular. A adição de crioprotetores penetrantes, tais como o dimetilsulfóxido (DMSO), diminui o volume de água para formação de cristais de gelo e, conseqüentemente, o grau de desidratação da célula. Isso resulta em uma adequada criopreservação das células hematopoéticas^1,2.

O objetivo do presente trabalho foi o de relatar a experiência do Serviço de Criobiologia da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade de São Paulo e da Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo, desde a sua implantação, e os resultados obtidos com o uso associado das células-tronco periféricas (CTP) e medula óssea autógena para reconstituição hematopoética após altas doses de quimioterapia.

CASUÍSTICA

Durante o período de abril de 1993 a setembro de 1994, 23 pacientes (11 do sexo masculino e 12 do feminino), provenientes da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP) e da Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo, receberam a associação de células-tronco periféricas (CTP) e/ou medula óssea (MO) autógena para a reconstituição hematopoética após o regime de condicionamento para o transplante de medula óssea.

Quanto ao diagnóstico, oito pacientes eram portadores de leucemia mielóide aguda (LMA), três com doença de Hodgkin (DH), cinco com linfoma não-Hodgkin (LNH), seis com leucemia linfóide aguda (LLA) e um paciente com mieloma múltiplo (MM) (Tabela 1).

Quanto ao estado clínico, no momento do transplante, sete estavam em primeira remissão e 16 com doença mais avançada (segunda remissão ou doença refratária).

Dezessete pacientes receberam somente quimioterapia como regime de condicionamento para o autotransplante e seis receberam quimioterapia associada à radioterapia (radiação corporal total).

A coleta de medula óssea seguiu o método proposto pelo grupo de Seattle³. Resumidamente, coletaram-se de 10-15mL/kg (de peso do paciente) de medula óssea por meio de múltiplas punções da região esternal e das cristas ilíacas superiores e posteriores. A seguir, a medula óssea foi filtrada por dois filtros de diâmetros diferentes (0,33mm e 0,22mm), respectivamente.

A coleta das CTP foi realizada por meio de leucoaférese, realizando-se um procedimento por dia durante três dias consecutivos, após estímulo com o G-CSF (5µg/kg). As aféreses foram realizadas em equipamento de fluxo contínuo Vivacell BT 798 (Dideco, Mirandola — Itália). Em cada coleta foram processados 10-12 litros de sangue do paciente, com fluxo de retirada de 50mL/min e fluxo de aspiração do buffy-coat de 3-4mL/min. A velocidade de centrifugação foi de 180 x G e utilizou-se ACD fórmula A como solução anticoagulante numa proporção de 1/10-1/12. O volume dos produtos obtidos em cada coleta foi reposto equivolumetricamente com solução de albumina a 4%.

O excesso de plasma contido no produto da coleta de CTP e da medula óssea foi removido por centrifugação em centrífuga Sorvall (3.000rpm/15min), colhendo-se, assim, a camada leucoplaquetária (buffy-coat). A contagem de células nucleadas foi feita antes e após a obtenção do buffy-coat, que foi congelado com igual volume de solução criopreservante contendo 20% de dimetilsulfóxido (DMSO, Cryoserv, Research Industries Corporation, Utah), 40% de meio de cultura (TC199, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo) e 40% de plasma autógeno. As células do buffy-coat foram congeladas em uma câmara de congelamento programável (CRYOMED, mod.1010, Ohio). A câmara é alimentada por cilindro de nitrogênio líquido VGL (White Martins, São Paulo, 116 litros de capacidade). A taxa de congelamento foi à razão de -1°C/min da temperatura ambiente até -45°C e, a seguir, a 10°C/min até -80°C, antes de serem transferidos para um freezer mecânico a -110°C (Forma Científica, mod 8380, Ohio) [ver gráfico na pág. seguinte].

Antes da reinfusão, as células foram rapidamente descongeladas (3 a 5 minutos), em banho-maria a 37°C, ao lado do leito do paciente. Foi adicionado anticoagulante (ACD) correspondente a 20% do volume total de cada bolsa, para evitar a formação de coágulos celulares. Os critérios de recuperação medular após o autotransplante foram: granulócitos superiores ou igual a 500/mLpor dois dias consecutivos e plaquetas superiores a 20.000/mL por uma semana sem transfusão.

Todos os pacientes receberam fator de crescimento (G-CSF) a partir do dia +1 do TMO até a recuperação hematopoética. Uma paciente (RGC) recebeu GM-CSF e outro (RRS), G-CSF e GM-CSF, alternadamente, como fatores estimulantes, por problemas de fornecimento.

RESULTADOS

Oitenta e seis congelamentos foram realizados naquele período. O número de coletas, tanto das CTP como de medula óssea, está relacionado na Tabela 2. A mediana de coletas de CTP e de medula óssea por paciente foi de 3 e 1, respectivamente. Todos os congelamentos foram registrados graficamente por meio de uma curva de congelamento (gráfico). A curva é composta de três fases (A: fase inicial; B: fase crítica e C: fase final).

Os pacientes receberam uma mediana de 5,31 x 10⁸ cels./kg (variação 1,68-26,74) de CTP associada a medula óssea autógena. Dois pacientes (RGC e AGC) receberam apenas medula óssea, pois não foi possível coletar CTP devido ao peso dos pacientes.

A mediana do tempo de recuperação medular foi de 12 dias (variação 8-40) para os granulócitos e de 31 dias (variação 8-80) para as plaquetas.

Dos 23 pacientes admitidos no Programa de Transplante de Medula Óssea, 11 permanecem vivos e livres da doença, com mediana de 11 meses (variação 2-24) de seguimento clínico. Um paciente (RGF) teve recidiva precoce (dia +86) e morreu após três meses. Os demais pacientes morreram de outras causas (Tabela 3).

DISCUSSÃO

O tratamento com altas doses de quimioterapia, seguido da infusão de células precursoras hematopoéticas, está sendo incorporado ao contexto terapêutico com finalidades curativas para uma série de neoplasias⁴. A importância das células pluripotentes após a quimioterapia mieloablativa faz-se notar pela reconstituição hematopoética e, também, pela redução das intercorrências como neutropenia, infecções oportunistas e dias de hospitalização, entre outros, os quais podem ser reduzidos ainda mais se empregados fatores de crescimento, associadamente⁵.

O transplante autólogo ou autoplástico de medula óssea (TAMO) passa a ter papel importante quando se visa administrar altas doses de quimioterapia. A coleta das células precursoras para a realização do TAMO pode se dar por via direta das células mediante múltiplas punções das cristas ilíacas ou por meio de uma técnica mais recente, a das células pluripotentes periféricas⁶. Em nosso trabalho, utilizamos a associação da medula óssea autóloga e das CTP. Disso resultou um número superior a 5,0x 10⁸ cels./kg, garantindo recuperação medular para todos os pacientes.

Recentemente, vários procedimentos têm sido empregados para aumentar a coleta de células progenitoras^6,7,9. Richman et al. observaram aumento do número de CFU-GM (colony forming unit granulocyte-macrophage), presentes no sangue periférico de pacientes que receberam quimioterapia não-mieloablativa coincidente com a recuperação dos leucócitos⁸. O mesmo fenômeno foi observado durante o tratamento de indução na leucemia mielóide aguda e, após quimioterapia, para linfoma não-Hodgkin. Abrams et al. demonstraram um efeito semelhante em cães, que receberam ciclofosfamida¹⁰. Esses autores notaram que a coleta de células, após estímulo com o quimioterápico, resultou em número 12 vezes maior do que o obtido em animais-controle, sem estímulo.

Os fatores de crescimento também têm sido empregados para melhorar o rendimento da coleta das células. Socinski et al. relataram aumento médio de 15 vezes no número de CFU-GM no sangue periférico, após a infusão de GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor), com doses escalonadas de 4-64µg/kg, em pacientes com tumores sólidos que não receberam quimioterapia¹¹. Estudo semelhante, realizado por Gianni et al., resultou em aumento de CFU-GM circulante em 25 vezes com ciclofosfamida sozinha, e 100-1.000 vezes com ciclofosfamida mais GM-CSF¹².

Altas doses de quimioterapia, tais como com ciclofosfamida e VP-16, seguidas de G-CSF, talvez tornem desnecessárias múltiplas coletas de células e resultem em um produto com menor quantidade de células tumorais. Esse esquema também traz a vantagem de produzir uma citorredução inicial antes das altas doses de quimioterapia para o TAMO e, com isso, consegue-se avaliar a quimiossensibilidade do tumor.

Desses trabalhos resultou que a melhor técnica de coleta das células precursoras hematopoéticas (CD34+) seria a combinação de quimioterapia seguida de fator de crescimento. Embora existam publicações recomendando um número mínimo de células (30x10⁴ CFU-GM/kg e 2,0x10⁶céls. CD34+/kg) para a recuperação hematopoética precoce, não foi possível, até o momento, estabelecer um número ideal de células a serem coletadas¹³. Parece ser importante que cada instituição defina, em função do protocolo de mobilização das células, qual será o número destas a serem coletadas¹². Mais recentemente, diversos autores têm realizado a determinação de células CD34 positivas no material de CTP¹⁴. Isto porque todas as células que crescem em colônias e algumas células mononucleares expressam o antígeno CD34. Algumas instituições^9,14 têm relatado o número mínimo de células CD34+ necessárias para obter uma recuperação medular precoce. Em nosso trabalho, os pacientes tiveram a medula óssea ou CTP coletadas após a quimioterapia de resgate ou sob estímulo com fator de crescimento. A maioria dos pacientes recebeu G-CSF após o TAMO com o intuito de acelerar a recuperação hematopoética. Uma mediana de 12 dias de recuperação dos granulócitos, após o autotransplante, foi observada no presente trabalho, estando de acordo com outros relatos da literatura⁹. A recuperação hematopoética é um bom índice para avaliar a criopreservação das células pluripotentes hematopoéticas⁷. O uso rotineiro de CTP tem reduzido o tempo de recuperação da hematopoese. Korbling et al., estudando pacientes com linfoma de Burkitt em remissão completa que receberam CTP após radioterapia corporal total e ciclofosfamida, observaram recuperação precoce de neutrófilos e plaquetas (dias 9 e 10 pós-transplante, respectivamente)¹⁵. Não houve nenhum caso de falência medular em nossa casuística. Uma paciente (ESL) teve, durante a recuperação hematopoética, pneumonia intersticial de causa não identificada, sendo necessário o uso do ganciclovir; neste caso, a paciente teve recuperação medular tardia, possivelmente por mielotoxicidade do ganciclovir. Em outra paciente (BLVS), a recuperação medular ocorreu no dia +40 após transplante de medula óssea. Tratava-se de paciente com LMA secundária à adenocarcinoma de mama, intensamente tratada com quimioterapia, motivo pelo qual deveria ter poucas células CD34+ na medula óssea.

O uso de CTP tem facilitado uma recuperação medular precoce, e isso se traduz por menor morbidade, menor mortalidade e, principalmente, menor custo, permitindo ampliar seu uso terapêutico^16,17.

SUMMARY

Cryopreservation of bone marrow and peripheral blood stem cells using a controlled rate freezing system. Experience on 86 procedures

The cryopreservation of hematopoietic stem cells can be used for rescuing the hematopoiesis after high dose chemotherapy.

PURPOSE. The ice cristal formation during the freezing procedure is the key point that can be harmful to the cells. The cryopreservation of hematopoietic stem cells in a controlled-rate freezer could decrease the cell damage.

METHODS. Twenty-three patients with a median age of 26 years (range 03-57) had bone marrow and/or peripheral blood stem cells harvested from March 1993 through October 1994, ending up to 86 freezing procedures.

The patient's diagnoses are as follows: Non-Hodgkin's Lymphoma (n=5); Acute Myelogenous Leukemia (n=8); Acute Lymphocytic Leukemia (n=6); Hodgkin's disease (n=3); Multiple Myeloma (n=1). The cells were frozen away in a controlled-rate freezer chamber at the folowing rate: -1°C/min from room temperature to -45°C and then, at -10°C/min down to -80°C. After freezing, the cells were kept into mechanical freezers until the marrow infusion. To mobilize PBSC (peripheral blood stem cells), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor) was given.

RESULTS. A median of 3.16x10⁸ cells/kg (range 0.86-24.22) of PBSC and 2.03x10⁸ cells/kg (0.19-12.21) of bone marrow cells were frozen. The median time to reach granulocytes greater than 500/µL and platelets greater than 20,000/µL was 12 days (range 8-40) and 31 days (range 8-80), respectively. All patients had marrow engraftment after infusion of hematopoietic stem cells.

CONCLUSION. The cryopreservation procedure using a controlled-rate freezer can store hematopoietic stem cells and potentially, cause less damage to the cells. [Rev Ass Med Brasil 1997; 43(2): 93-8.]

KEY WORDS: Bone marrow transplantation. Cryopreservation. Stem cell.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Out 2000
• Data do Fascículo
  Jun 1997