Acúmulo de minerais em Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith (Bromeliaceae), contaminadas com zinco em cultivo in vitro

Accumulation of mineral nutrients in Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith (Bromeliaceae) contaminated with zinc during in vitro culture

ARTIGOS ARTICLES

Acúmulo de minerais em Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith (Bromeliaceae), contaminadas com zinco em cultivo in vitro

Accumulation of mineral nutrients in Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith (Bromeliaceae) contaminated with zinc during in vitro culture

Maria Cristina Tessari Zampieri^I,*; Mitiko Saiki^I; Armando Reis Tavares^II; Gladys Flávia de Albuquerque Melo de Pinna^III

^IInstituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Avenida Professor Lineu Prestes 2242, 05508-000 São Paulo, SP, Brasil

^IIInstituto de Botânica, Núcleo de Pesquisas em Plantas Ornamentais, Caixa Postal 68041, 04045-972 São Paulo, SP, Brasil

^IIIUniversidade de São Paulo, Instituto de Biociências, Departamento de Botânica, Rua do Matão 321 Travessa 14, 05508-090 São Paulo, SP, Brasil

RESUMO

Com o objetivo de estudar a absorção e translocação de Ca, Co, Fe, K e Zn em Aechmea blanchetiana, plantas foram cultivadas in vitro em meios de cultivo contendo concentrações de Zn (0,0; 0,18; 1,8; 18 e 180 mg Zn L^-1). Após 16 semanas de cultivo, os sistemas aéreo e radicular foram separados e determinadas à massa seca para massa de matéria seca e para a análise por ativação com nêutrons (AAN). O procedimento consistiu em irradiar amostras e padrões no reator nuclear de pesquisa IEA-R1 por 16 h para análise por espectrometria de raios gama. O controle dos resultados foi avaliado por meio das análises dos materiais de referência certificados, com desvios padrão relativo de 9,1 % e erros inferiores a 12,9 %. Os resultados das determinações dos elementos mostraram que o Zn alterou absorção e translocação de Ca, Co, Fe, K e Zn. A espécie apresentou alta quantidade de Zn nos sistemas aéreo e radicular indicando, possivelmente, ser bioacumuladora desse elemento.

Palavras-chave: análise por ativação com nêutrons, bioacumuladora, índice de translocação

ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the absorption and translocation of Ca, Co, Fe, K and Zn in plants of Aechmea blanchetiana grown in in vitro conditions contaminated with Zn (0.0, 0.18, 1.8, 18 and 180 mg Zn L^-1). After 16 weeks of in vitro culture, root and shoot systems (leaves and stem) were separated, dried for dry mass measurements and neutron activation analysis (NAA). The results showed that the relative standard deviations were 9.1 % and errors were less than 12.9 %. The results obtained for A. blanchetiana indicated that Zn altered the absorption and translocation of Ca, Co, Fe, K and Zn. The species showed high values of zinc in root and aerial systems possibly indicating bioaccumulation of the element.

Key words: bioaccumulator, neutron activation analysis, translocation index

Introdução

Os metais pesados são componentes da biosfera, de ocorrência natural nos solos e plantas, contudo como consequências de ações antrópicas, os seus níveis têm aumentado no meio ambiente (Schüürmann & Markert 1998). O excesso de Cu ou Zn presente na água ou no solo pode ser de ações antrópicas tais como as aplicações de produtos fitoquímicos (fungicidas, pesticidas e inseticidas), adubações na agricultura (Marsola et al. 2005), resíduos sólidos industriais, mineradoras (Cunha et al. 2008), descarte de materiais metalúrgico, eletrônico, de bateria, pigmentos para tintas e da indústria de plásticos (Zeitouni 2003).

As raízes das plantas, auxiliado pelos agentes quelantes produzidos pelas plantas e as alterações induzidas pela planta no pH e nas reações redox, são capazes de solubilizar e absorver micronutrientes a níveis muito baixos no solo, mesmo a partir de precipitados insolúveis; estando, esses mesmos mecanismos envolvidos na absorção, translocação e armazenamento de elementos tóxicos (Tangahu et al. 2011).

Concentrações de zinco abaixo de 15-20 µg Zn por massa de matéria seca de folha são consideradas como deficiência do mineral e concentrações acima 100-300 µg Zn por massa de matéria seca são fitotóxicas (Marschner 1995). A toxidez por zinco pode ser induzida rapidamente em plantas não tolerantes, tendo como principal característica a inibição do crescimento radicular. A clorose das folhas também pode ser induzida pela toxidez do zinco, na maioria dos casos pela deficiência de magnésio ou ferro, devido a competição dos sítios entre os elementos (Navarro 2003).

Espécies do gênero Tillandsia (Bromeliaceae) são usualmente utilizadas como espécies biomonitoras de metais pesados presentes em poluição aérea, entretanto em estudo realizado por Elias et al. (2006) comparando a capacidade de absorção de diversas espécies de bromélias, concluiu que a espécie Canistropsis billbergioides (Schult. F.) Leme apresentou maior índice de acumulação, sendo indicada para avaliação da composição química em florestas tropicais; concluindo que, condições ambientais como luminosidade, depósito de serrapilheira e composição química atmosférica contribuíram para o maior acúmulo de elementos químicos nas folhas desta espécie, em relação a Tillandsia. A bromélia Aechmea blanchetiana (Baker) L.B. Smith, é uma espécie nativa do Brasil, de hábito herbáceo ou epifítico, as plantas formam touceiras com 60 a 90 cm de altura, a folhagem é verde clara e se apresenta em forma de roseta formando tanque (Lorenzi & Souza 2001). A espécie, devido ao seu uso paisagístico está adaptada a todas as regiões do Brasil e mostrou-se responsiva a aplicação de nutrientes (Kanashiro 2009) e metais pesados (Giampaoli et al. 2012), em condições de cultivo in vitro.

O objetivo do presente estudo foi aplicar o método de análise por ativação com nêutrons na determinação das concentrações de Ca, Co, Fe, K e Zn para cálculo do índice de translocação desses elementos, em plantas de Aechmea blanchetiana (Bromeliaceae) cultivadas in vitro em meios de cultura contaminado com Zn. Para a avaliação da exatidão e precisão dos resultados foram analizados os materiais de referência NIST SRM 1547 Peach Leaves e INCT-TL-1 Tea Leaves provenientes do National Institute of Standards and Technology (INCT).

Material e métodos

Obtenção da Aechmea blanchetiana e seu tratamento para as análises - O experimento de cultivo in vitro foi realizada no Laboratório do Núcleo de Pesquisas em Plantas Ornamentais do Instituto de Botânica, São Paulo, SP. As plantas foram obtidas da germinação in vitro de sementes de A. blanchetiana, em meio de cultivo MS modificado (Murashige & Skoog 1962), pelo período de 10 meses. Após esse período, realizou-se o preparo dos explantes com a poda das folhas na região mediana e poda total das raízes; sendo, inoculadas nos tratamentos. Foram realizados diferentes tratamentos com Zn (ZnSO₄) nas concentrações de 0 (controle); 0,18 (concentração máxima de Zn permitido no índice do padrão de potabilidade nas águas doces Classe I, de acordo com a resolução 357 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA, 2005)); 1,8; 18 e 180 mg Zn L^-1. As culturas permaneceram em sala de cultivo em temperatura de 25 ± 2 ºC, fotoperíodo de 16 h dia e 36 µmol m^-2 s^-1 de radiação fotossinteticamente ativa (PAR). Após 16 semanas, foram retiradas 30 plantas para cada tratamento realizado, incluindo também o material controle (testemunha). O material foi lavado por três vezes em água deionizada, e separado em sistemas aéreo (folha e caule) e radicular. As amostras foram submetidas à secagem a temperatura de 42 ºC por 48 h em estufa de circulação forçada de ar e, posteriormente, trituradas utilizando liquidificador com lâminas de titânio.

Procedimentos para análise por ativação com nêutrons (AAN) - Os padrões sintéticos dos elementos foram preparados, a partir de soluções diluídas contendo um ou mais elementos das soluções certificadas da Spex Certiprep USA. Alíquotas de 50 µL das soluções diluídas foram pipetadas sobre tiras de papel de filtro Whatman n. 40. As massas dos elementos nos padrões sintéticos foram Ca = 501,86 µg; Co = 150,15 µg; Fe = 351,12 µg; K = 500,8 µg e Zn = 35,97 µg. Após a secagem, as tiras de papel foram acondicionadas em invólucros de plásticos, previamente lavados com solução de ácido nítrico diluído e água purificada MILLIQ, e secos a temperatura ambiente.

O procedimento da AAN consistiu em irradiar de 150 a 200 mg das amostras do sistema aéreo, radicular e materiais de referência em invólucros de polietileno. As amostras e padrões sintéticos dos elementos foram envoltos em folhas de alumínio e colocados dentro de dispositivo cilíndrico de alumínio para irradiação no reator nuclear de pesquisa IEA-R1 do IPEN-CNEN/ SP. O tempo para irradiação utilizado foi de 16 h sob fluxo de nêutrons térmicos de 4 × 10¹² n cm^-2 s^-1 a 5 × 10¹² n cm^-2 s^-1. Depois de adequados os tempos de decaimento, de cerca de cinco dias, foram realizadas as medições das atividades gama dos radioisótopos formados, usando o detector semicondutor de Ge hiperpuro acoplado a placa ACE8K (EG & G ORTEC), microcomputador e sistema eletrônico associado. O sistema foi verificado diariamente por medição com fonte mista de ⁵⁷Co e ⁶⁰Co.

As contagens foram realizadas de cinco a oito dias após o término da irradiação por 5.400 s para os padrões e 20.000 s para as amostras, na primeira contagem. Na segunda contagem, após o tempo de decaimento de 13 a 18 dias da irradiação, foram utilizados os tempos de contagem de 5.400 s para os padrões e de 50.000 s para as amostras.

O processamento dos espectros gama foi realizado com o programa de computação VISPECT2, obtendo-se as energias e áreas dos picos dos espectros gerados. A identificação dos radioisótopos ⁴⁷Ca, ⁶⁰Co, ⁵⁹Fe, ⁴²K e ⁶⁵Zn foi realizada pelas energias dos raios gama e meia vida. As concentrações dos elementos nas amostras foram calculadas pelo método comparativo (De Soete et al. 1972).

Controle de qualidade dos resultados - A exatidão e precisão dos resultados foram avaliadas pela análise dos materiais de referência certificados INCT-TL-1 Tea Leaves (INCT 2002) e NIST SRM 1547 Peach Leaves (NIST 2003). A determinação das percentagens de umidade dos materiais foi realizada pesando-se cerca de 200 mg de material para secagem (16 h a temperatura de 85 ºC). Na secagem foram obtidos os valores 10,06% para NIST SRM 1547 Peach Leaves e 7,98% para INCT-TL-1 Tea Leaves utilizados nos cálculos das concentrações dos elementos na base seca do material.

Os valores Z-score_i foram calculados para os elementos que apresentaram valores de referência nos certificados, usando a relação (IAEA, 2001): Z-score_i = (C_i - C _{ref, i})/(σ_i² + σ_ref,i²)^1/2

(C_i : concentração do elemento i obtido na análise do material de referência; C_ref,i: concentração certificada para o elemento i; σ_i: desvio padrão da concentração obtida para o elemento i na análise do material de referência; σ_ref,i: incerteza do valor certificado para o elemento i).

Cálculo do índice de translocação e tratamento estatístico - O índice de translocação (IT%) dos elementos foi calculado utilizando a relação (Abichequer et al. 2003): IT = (PA/(PA+R)).100 (PA = concentração do elemento pela massa de matéria seca do sistema aéreo; R = concentração do elemento pela massa de matéria seca do sistema radicular).

O tratamento estatístico dos dados obtidos, a partir das plantas submetidas aos diferentes tratamentos (30 plantas tratamento^-1), foi realizado pela análise da variância (ANOVA) ao nível de 5% de significância, seguido pelo teste t Student utilizando o programa BioEstat4.0.

Resultados e Discussão

Os resultados obtidos no material de referência INCT-TL-1 Tea Leaves e NIST SRM 1547 Peach Leaves, e os valores do certificado estão apresentados na tabela 1. Os valores no material de referência INCT-TL-1 Tea Leaves indicam boa exatidão com porcentagens de erro relativo inferiores a 12,9%. A precisão dos resultados foi avaliada por meio dos desvios padrão relativos e os valores observados variaram entre 2,3 a 9,3% indicando a reprodutibilidade. Os resultados para o material de referência NIST SRM 1547 Peach Leaves indicaram boa exatidão com erros relativos inferiores a 14,5% e os desvios padrão relativos inferiores a 14,6% indicando a reprodutibilidade dos resultados.

Os valores de Z-score (tabela 1) para os resultados dos materiais de referência INCT TL-1 Tea Leaves e NIST SRM 1547 Peach Leaves estão dentro da faixa de valores no intervalo considerado |Z-score| < 2, nos materiais de referência analisados, indicando que os valores obtidos são concordantes com os valores certificados a 5% de significância. Resultados semelhantes foram observados por Elias et al. (2006), em que a técnica mostrou precisão analítica na análise de folhas de espécies de Bromeliaceae (Aechmea coelestis (K. Koch) E. Morren, Billbergia amoema (Loddiges) Lindley, Canistropsis billbergioides (Schultes f.) Leme, Nidularium cf. inocentii, N. krisgreeniae Leme, Tillandsia stricta Solander, Vriesea carinata Wawra, V. ensiformis (Vellozo) Beer, V. incurvata Gaudichaud e V. vagans (L.B. Smith) L.B. Smith), visando o biomonitoramento de poluição, para os elementos Br, Ca, Ce, Co, Cs, Fe, K, Na, Rb, Sc, Sr e Zn.

O aumento da concentração de zinco no meio de cultivo, incluindo as doses superiores aos da Resolução CONAMA, promoveram alterações no crescimento de Aechmea. blanchetiana, com aumento e acúmulo de massa de matéria fresca e seca nos sistemas aéreo e radicular (tabela 2). No entanto, em estudo realizado por Giampaoli et al. (2012) com plantas de Aechmea blanchetiana submetidas às mesmas condições de cultivo, em MS modificado com Zn, e sem a poda das folhas e raízes, observou a diminuição no número de raízes e folhas, e nas massas de matéria seca foliar e radicular, indicando que a espécie apresenta sensibilidade à deficiência de zinco.

Os teores de K e Zn no sistema aéreo e Ca, Co, K e Zn no sistema radicular (tabela 3) aumentaram com a elevação das concentrações de zinco no meio de cultivo, havendo diminuição nas concentrações de Co, com o aumento da concentração de Zn. A quantidade e a localização de acúmulo de zinco nas plantas podem variar de acordo com o teor do metal existente no meio e a espécie vegetal (Lasat et al. 2000). O aumento das concentrações de zinco no meio de cultivo diminuiu as concentrações de Ca, K, Mg, Cu e P em folhas de Lolium perenne L. cv Apollo, em adição ao estresse causado pelo Zn, a deficiência dos íons poderiam alterar diversos processos metabólicos como a fotossíntese, redução dos níveis de nitrato, neutralização de radiais ácidos, etc. (Bonnet et al. 2000). Estudos em Thlaspi caerulescens J. Presl & C. Presl mostraram que, assim como em A. blanchetiana, houve acúmulo de Zn nos vacúolos das raízes da espécie, retardando a translocação do Zn e posterior fitotoxidez do sistema aéreo das plantas (Lasat et al. 2000). Estudo de nutrição mineral nos diferentes órgãos de Aechmea fasciata, mostrou que as folhas foram responsáveis por 43%, o caule 28% e as raízes 29% do total de Zn acumulado na planta (Sanches 2009). As plantas A. blanchetiana acumularam Zn no sistema radicular e no aéreo, provavelmente devido às características do cultivo in vitro, onde as folhas e raízes das plantas permaneceram em contato com o meio MS modificado tratado com Zn (líquido, sem adição de ágar). Giampaoli et al. (2012) observaram em A. blanchetiana que os teores variaram de 26,33 a 233,33 mg Zn kg^-1 quando as plantas foram contaminadas com 0 a 275 µM Zn e Elias et al. (2006) estudando a composição química foliar de 11 espécies de bromélias observaram valores de 11 a 57 µM Zn Kg^-1 em plantas coletadas em quatro diferentes unidades de conservação. A fitotoxidez por Zn acarreta inibição do crescimento e diminuição de produção de biomassa e é o resultado de interações complexas com íons como Cd⁺², Cu⁺² e Pb⁺² e Ca, Mg, Fe e P, estando envolvida com a competição pela absorção, inativação de enzimas e o deslocamento de elementos essenciais de seus sítios funcionais (Rout & Das 2003).

Os índices de translocação (tabela 4) aumentaram para os elementos K e Fe com a elevação das concentrações de Zn no meio de cultura, no entanto diminuíram para o Zn e Co. Os resultados estão de acordo com os obtidos por Paiva et al. (2003), nos quais o índice de translocação de Zn e Fe em Cedrela fissilis Vell. (cedro) foi crescente com as doses do metal em solução nutritiva, mostrando que na presença de concentrações elevadas, o elemento Zn transloca para a parte aérea em maiores proporções (52,4%) que a apresentada pelas plantas controle e que o metabolismo do Fe é inibido pelo aumento na concentração de Zn.

A técnica de cultivo in vitro de plantas permite isolar os efeitos dos metais pesados no metabolismo de plantas dos efeitos causados por outros fatores (Giampaoli et al. 2012) e ser responsiva à aplicação de nutrientes em meio de cultivo e contaminação por sais in vitro (Kanashiro 2009), apresenta as características para ser utilizada como um modelo no estudo de alterações metabólicas e de crescimento e desenvolvimento vegetal em função do estresse causado por metais pesados. As concentrações 1,8; 18 e 180 mg Zn L^-1, apesar de superiores aos índices permissíveis do CONAMA, apresentaram efeitos nutricionais no cultivo in vitro de A. blanchetiana e promoveram o aumento nos teores de Zn nos sistemas radicular e aéreo. Portanto, a espécie apresenta tolerância a altos níveis do metal, possibilitando a utilização de Aechmea blanchetiana no biomonitoramento de áreas contaminadas por Zn.

Agradecimentos

A FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, Processo 2008/55680-8) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Processo nº 305776/2009-6) pelo fomento a esta pesquisa.

Literatura citada

Recebido: 2.03.2012; aceito: 19.07.2012

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Dez 2012
• Data do Fascículo
  Set 2012

Histórico

• Recebido
  02 Mar 2012
• Aceito
  19 Jul 2012