Identificação de espécies de Leishmania isoladas de casos humanos em Mato Grosso do Sul por meio da reação em cadeia da polimerase

Identification of Leishmania species isolated in human cases in Mato Grosso do Sul, by means of the polymerase chain reaction

ARTIGO ARTICLE

Identificação de espécies de Leishmania isoladas de casos humanos em Mato Grosso do Sul por meio da reação em cadeia da polimerase

Identification of Leishmania species isolated in human cases in Mato Grosso do Sul, by means of the polymerase chain reaction

Manoel Sebastião da Costa Lima Junior^I; Renato Andreotti^II; Maria Elizabeth Moraes Cavalheiros Dorval^III; Elisa Teruya Oshiro^III; Alessandra Gutierrez de Oliveira^III; Maria de Fatima Cepa Matos^IV

^IPrograma de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas e Parasitárias, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS

^IIEmbrapa Gado de Corte, Programa de Pós-Graduação em Doenças Infecciosas e Parasitárias da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS

^IIIDepartamento de Patologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS

^IVDepartamento de Famácia-Bioquímica, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

As leishmanioses são zoonoses endêmicas em Mato Grosso do Sul e têm por agentes etiológicos nessa região Leishmania (Leishmania) chagasi, Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis. Como método para identificação de espécies de Leishmania, a reação em cadeia da polimerase é uma ferramenta com elevada especificidade e sensibilidade. Analisaram-se 39 isolados de Leishmania criopreservados, obtidos por meio de aspirado medular e/ou biópsia de lesão, conforme a suspeita clínica. Os isolados foram submetidos à extração de DNA e à reação em cadeia da polimerase com os iniciadores: RV1/RV2 para Leishmania (Leishmania) chagasi, a1/a2 para a identificação de Leishmania (Leishmania) amazonensis e b1/b2 para Leishmania (Viannia) braziliensis. Leishmania (Leishmania) chagasi foi a única espécie identificada em 37 casos de leishmaniose visceral. Leishmania (Leishmania) amazonensis foi identificada em dois isolados de pacientes com diagnóstico de leishmaniose tegumentar. Os resultados obtidos confirmam a possibilidade do uso dos três pares de iniciadores como uma ferramenta na caracterização de isolados de Leishmania.

Palavras-chaves:Leishmania. Leishmaniose visceral. Leishmaniose tegumentar. Reação em cadeia da polimerase. Mato Grosso do Sul.

ABSTRACT

Leishmaniases are endemic zoonoses in the State of Mato Grosso do Sul. Their etiological agents in this region of Brazil are Leishmania (Leishmania) chagasi, Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensis. The polymerase chain reaction (PCR) is a tool with high specificity and sensitivity for identifying Leishmania species. This study examined 39 cryopreserved isolates of Leishmania that had been collected by bone marrow aspiration and/or lesion biopsy, depending on the clinical suspicion. The isolates were subjected to DNA extraction and PCR using the following primers: RV1/RV2 for identifying Leishmania (Leishmania) chagasi, a1/a2 for Leishmania (Leishmania) amazonensis and b1/b2 for Leishmania (Viannia) braziliensis.Leishmania (Leishmania) chagasi was the only species identified in the 37 cases of visceral leishmaniasis.Leishmania (Leishmania) amazonensis was identified in two isolates from patients with a diagnosis of cutaneous leishmaniasis. The results obtained confirm that it is possible to use these three pairs of primers as a tool for characterizing Leishmania isolates.

Key-words:Leishmania. Visceral leishmaniasis. Cutaneous leishmaniasis. Polymerase chain reaction. Mato Grosso do Sul.

As leishmanioses são zoonoses que se apresentam sob diferentes formas clínicas, a leishmaniose tegumentar cutânea, mucocutânea e cutânea difusa, e a leishmaniose visceral^{27 28}.

A identificação das espécies de Leishmania que circulam em determinado foco de transmissão, particularmente em regiões onde as diferentes formas clínicas ocorrem simultaneamente, é muito importante para o conhecimento da epidemiologia das leishmanioses e planejamento de estratégias de controle².

Tratando-se de leishmaniose visceral nas Américas, a única espécie considerada responsável pela doença é Leishmania (Leishmania) chagasi, embora já se tenha descrito Leishmania (Leishmania) amazonensis⁵ e Leishmania (Viannia) braziliensis⁴⁸ como agentes de leishmaniose visceral, destacando-se, portanto, a importância da identificação do agente causal por métodos específicos e não por correlação sintomatológica à espécie usualmente conhecida.

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica altamente sensível e específica, e pode detectar o DNA ou RNA do parasita^{49 52}, em diagnóstico humano⁴⁷, canino^{20 44} e em flebotomíneos^{24 35 36}, sendo também útil na caracterização de isolados humanos³⁷.

O DNA de cinetoplasto (kDNA) de Leishmania tem sido utilizado como uma ferramenta de diagnóstico pela PCR, devido a capacidade de detectar pequenas quantidades de DNA do parasito em materiais biológicos, o que se deve à abundância de minicírculos^{2 4 7 12}.

O alto grau de polimorfismo do kDNA juntamente com regiões conservadas^{10 12 14 17} favorecem a sua utilização para fins taxonômicos e genéticos². Por essa razão, os iniciadores utilizados neste trabalho possuem como alvo sequências do minicírculo, possibilitando a distinção entre Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis^{8 26}.

Os iniciadores RV1 e RV2 têm sido utilizados com sucesso na identificação de Leishmania (Leishmania) chagasi em sangue e urina de humanos^{15 29 47}, cães^{15 18 20}, e em flebotomíneos de Mato Grosso do Sul46, enquanto a1/a2 e b1/b2 são os iniciadores que permitem, respectivamente, a identificação de Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis em amostras provenientes de biópsia de lesão em humanos^{23 26 37}.

A utilização destes iniciadores na identificação de espécies de Leishmania em isolados humanos criopreservados, por meio da reação em cadeia da polimerase constitui o objetivo deste trabalho.

MATERIAL E MÉTODOS

Isolados. Trata-se de um estudo com 39 isolados de Leishmania sp criopreservados no Laboratório de Parasitologia do Departamento de Patologia do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), coletados no período de janeiro de 2007 a janeiro de 2008, à exceção de uma amostra do ano de 2003. Amostras de sangue medular ou de tecido da borda da lesão foram coletadas de pacientes com leishmaniose visceral e tegumentar, provenientes de diferentes instituições de saúde de Mato Grosso do Sul, e encaminhadas ao Laboratório de Parasitologia para diagnóstico, caracterizando-as como amostras de conveniência. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética para Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul.

Cultura. As amostras foram cultivadas em meio Nicolle, Novy e McNeal (NNN) com fase líquida Schneider´s medium, pH 7.2 e 20% soro fetal bovino. Após o isolamento e crescimento, para a obtenção de massa parasitária, a mesma foi armazenada com glicerol em nitrogênio líquido.

Extração de DNA. As extrações de DNA a partir das formas promastigotas em cultura foram realizadas pelo método de fenol-clorofórmio¹.

Reação em cadeia da polimerase. A reação foi padronizada com os DNAs controle fornecidos pelo Laboratório de Leishmanioses do Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz (Belo Horizonte, Brasil): Leishmania (Leishmania) chagasi (MHOM/BR/74/PP/75), Leishmania (Viannia) braziliensis (MHOM/BR/75/M2903) e Leishmania (Leishmania) amazonensis (IPLA/ BR/67/PH8), levando-se em consideração o tamanho do produto esperado e as temperaturas de anelamento dos primers.

Para Leishmania (Leishmania) chagasi foram utilizados os iniciadores RV1- CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG e RV2- CACCTGGCCTATTTTACACCA com produto esperado de 145pb²⁰, para Leishmania (Leishmania) amazonensis os iniciadores a1- TGCGAGGATAAAGGGAAAGAA e a2- TGCCCTGACTTGCATGTCTA com produto esperado de 62pb²⁶, e para Leishmania (Viannia) braziliensis, os iniciadores b1- GTGGGCGTATCTGCTGATGAC e b2 - CAAAAAGCGAGGGACTGCGGA com produto esperado de 103pb²⁶.

Condições das PCR: a) RV1/RV2 com volume de 25µL: tampão 2X Phoneutria, dNTPs 0,2mM, MgCl₂ 0,3mM, iniciadores 0,16pmol, Taq polimerase Phoneutria 4U, DNA 0,5µL, água 19,4µL e termociclador BIOER modelo XP cycler. Os ciclos foram de 950C - 5min, 40 ciclos de: 940C - 30 seg, 700C- 1 min, 720C - 1 min e extensão final de 720C - 10 min. b) a1/a2 com volume de 25µL: tampão 2X Phoneutria (Belo Horizonte, MG), dNTPs0, 2 mM, MgCl₂ 0,3mM, iniciadores a1/a2 0,4pmol, Taq polimerase 4U Phoneutria, DNA 0,5µL, água 18,8µL e termociclador BIOER modelo XP cycler. Os ciclos foram de 950C - 5min, 35 ciclos de: 950C - 30 seg, 550C - 1 min e 30 seg, 720C - 1 min/ 30 seg e extensão final de 720C - 10 min. c) b1/b2 com volume de 25µL: tampão 2X Phoneutria, dNTPs 0,2mM, MgCl2 - 0,3mM, iniciadores a1/a2 1 pmol, Taq polimerase 4U Phoneutria, DNA 0,5µL, água 17,3µL e termociclador BIOER modelo XP cycler. Os ciclos foram de 950C - 5 min, 35 ciclos de: 950C - 30 seg, 700C - 1 min e 30 seg, 720C - 1 min/30 seg e extensão final de 720C - 10 min.

Eletroforese em gel de agarose. Realizou-se a eletroforese submarina horizontal em gel de agarose a 2% com tampão tris-EDTA-acetato (TAE) 1X pH 8,0 a 80v e 400mA (tris-acetato 0,04M, EDTA 0,001M⁴²). Os géis foram corados com brometo de etídeo (0,5µg/mL) e visualizados em luz ultravioleta. Para a análise dos produtos da PCR a1/a2, o gel foi de 3% em tampão TBE (tris base, ácido bórico e EDTA).

RESULTADOS

Os resultados da amplificação dos DNAs das cepas referência para as três espécies de Leishmania com os iniciadores RV1/RV2, a1/a2 e b1/b2 estão apresentados nas Figuras 1, 2 e 3, respectivamente, junto a alguns isolados do presente estudo.

Foram avaliados pela PCR 39 isolados humanos, sendo que 37 foram positivos para Leishmania (Leishmania) chagasi e dois para Leishmania Leishmania) amazonensis (Tabela 1). Não se identificou Leishmania (Viannia) braziliensis nas amostras analisadas.

DISCUSSÃO

A leishmaniose visceral em Mato Grosso do Sul encontra-se em franco processo de expansão, ocorrendo em 48 de seus 78 municípios, com crescente aumento no número de casos, e a confirmação de 1.519 casos, durante o período de 2000 a setembro de 2008. Destes, 258 ocorreram no ano de 2007, mantendo-se a morbidade como importante motivo de preocupação para a saúde pública⁴⁵.

A leishmaniose tegumentar é endêmica no estado, com registro de casos desde 1975, atingindo o homem quando este entra em contato com o foco natural da parasitose, demonstrando, até o momento, um padrão de transmissão de caráter ocupacional^{13 30}.

Embora a presença de Leishmania (Leishmania) chagasi, Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis já tenha sido constatada na população humana13 31 33, canina9 43 e em flebotomíneos^{32 43 46} do estado ainda são escassos os estudos sobre a identificação especifica dos agentes de leishmanioses em suas áreas de ocorrência.

No presente estudo, 37 isolados regionais eram de pacientes portadores de leishmaniose visceral e foram positivos para os iniciadores RV1/RV2 na reação em cadeia da polimerase, o que permitiu, mais uma vez, a identificação de Leishmania (Leishmania) chagasi como agente etiológico da parasitose, corroborando ainda, as citações da literatura quanto à utilização desses iniciadores na caracterização específica de Leishmania^{15 20}.

Estes mesmos iniciadores também foram úteis para a detecção dessa espécie de parasito em flebotomíneos capturados na área urbana de Campo Grande⁴⁶, município considerado de transmissão intensa, responsável por 55% dos casos confirmados no ano de 2007⁴⁵, e detentor do maior (29) número de amostras no presente trabalho.

Leishmania (Leishmania) amazonensis foi identificada em um paciente com a forma cutânea de leishmaniose tegumentar, com local de infecção em um município do interior do estado. Essa espécie já foi encontrada em outros casos humanos da parasitose¹³, além de já ter sido observada em felino⁵⁰, cães⁴³, e flebotomíneos^{43 46}, demonstrando que sua circulação e distribuição geográfica, podem ser mais amplas do que se supõe, considerando que os casos são procedentes de diferentes regiões do Estado.

O outro caso trata-se de paciente procedente do Estado do Amazonas, com a forma cutânea da parasitose, que teve como local de diagnóstico Campo Grande. Essa espécie de parasita é frequentemente relatada na região da Amazônia legal, juntamente com Leishmania (Viannia) guyanensis^{21 41}.

Assim, com os três pares de iniciadores, foi possível a identificação de duas espécies de Leishmania, tendo em vista a detecção de Leishmania (Leishmania) chagasi por meio de RV1/RV2, o encontro de dois isolados positivos para Leishmania (Leishmania) amazonensis quando da utilização de a1/a2, e a ausência de Leishmania (Viannia) braziliensis com b1/b2.

A ausência dessa espécie de parasito pode ter ocorrido pelo reduzido número de amostras analisadas, uma vez que, na maioria das vezes, o diagnóstico da leishmaniose tegumentar é realizado no município de origem do paciente, onde a infra-estrutura laboratorial não possibilita o isolamento do parasito para posterior identificação especifica do agente etiológico.

No caso da leishmaniose visceral, embora o número de amostras analisadas (37), possa parecer reduzido, vem contribuir no processo de diagnóstico da parasitose, tendo em vista que com sua recente introdução no estado, e as dificuldades ainda existentes no diagnóstico clínico e laboratorial, o Laboratório de Parasitologia, além de ser referência para a confirmação dos casos, vem realizando o isolamento e a criopreservação das amostras, possibilitando a ampliação dos estudos clínicos e epidemiológicos sobre essa parasitose no estado.

É importante ressaltar que outras técnicas, além da PCR, podem ser utilizadas para a identificação de espécies de Leishmania, tais como, eletroforese de enzimas¹⁶, considerada padrão ouro¹¹, anticorpos monoclonais^{25 40}, métodos moleculares como PCR multiplex^{19 38 39}, PCR-RFLP (PCR-polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição)^{6 22} e RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso)^{3 34}.

Enquanto o método de eletroforese de enzimas requer o cultivo e isolamento do parasita, a técnica de anticorpos monoclonais é limitada pela possibilidade de reações cruzadas. Já os testes moleculares baseados na PCR e variantes, exigem laboratórios equipados, reagentes de alto custo como enzimas de restrição no caso de PCR-RFLP, e a RAPD apresenta pouca reprodutibilidade. Por outro lado, a PCR padrão apresenta elevada sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade^{2 52}.

A escolha, neste trabalho, de três alvos de amplificação em separado, ao contrário da PCR multiplex, foi conseqüência da experiência anterior com os iniciadores RV1/RV2 por meio da PCR padrão, cuja utilização possibilitou a identificação de Leishmania (Leishmania) chagasi, em flebotomíneos na região⁴⁶. A padronização de um teste multiplex com os três pares de iniciadores testados poderá ser realizada em estudos posteriores.

Desta forma, a maior contribuição do trabalho é a descrição de Leishmania (Leishmania) chagasi, como o agente detectado nos casos de leishmaniose visceral, em Mato Grosso do Sul, além de possibilitar a implantação da PCR para no futuro permitir a identificação molecular das espécies que ocorrem em diferentes hospedeiros de Leishmania no estado, abrindo ainda a perspectiva de utilização desta técnica no diagnóstico individual das leishmanioses, possibilitando adequada conduta clínica e terapêutica dos pacientes.

AGRADECIMENTOS

À Fundect/MS pelo apoio financeiro e concessão de bolsa de pesquisa, à Embrapa Gado de Corte pelo apoio laboratorial, e ao Centro de Pesquisas René Rachou/Fiocruz (Belo Horizonte, Brasil), pela doação das cepas referência.

Recebido para publicação em 17/12/2008

Aceito em 03/04/2009

Apoio financeiro: Fundect/MS.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Ago 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Aceito
  03 Abr 2009
• Recebido
  17 Dez 2008