Desenvolvimento inicial e crescimento in vitro de Cattleya violacea (Kunth) Rolfe em diferentes concentrações de sacarose

Initial development and in vitro growth of Cattleya violacea (Kunth) Rolfe in different sucrose concentrations

AGRONOMIA

Desenvolvimento inicial e crescimento in vitro de Cattleya violacea (Kunth) Rolfe em diferentes concentrações de sacarose

Initial development and in vitro growth of Cattleya violacea (Kunth) Rolfe in different sucrose concentrations

Renato Fernandes Galdiano Júnior^I; Cibele Mantovani^II; Aline Olian Cassano^III; Eliana Gertrudes de Macedo Lemos^IV

^IFaculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Campus de Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", UNESP, Jaboticabal - SP, e-mail: [e-mail]

^IIFCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, e-mail: [e-mail]

^IIILaboratórios de Biologia, Centro Universitário Unifafibe, Bebedouro - SP, e-mail: [e-mail]

^IVFCAV/UNESP, Jaboticabal - SP, e-mail: [e-mail]

RESUMO

O presente estudo teve por objetivo analisar os aspectos da germinação e avaliar o efeito de concentrações de sacarose no crescimento in vitro de Cattleya violacea. Sementes provenientes de cápsulas fechadas foram semeadas em meio de cultura Murashige e Skoog (MS) e a morfologia externa da semente à plântula foi fotodocumentada em estereomicroscópio e microscópio eletrônico de varredura. Plântulas com 90 dias após a semeadura foram repicadas em meio de cultura ½ MS (com metade da concentração de macronutrientes) com diferentes concentrações de sacarose (0, 10, 20, 30 e 40 g L^-1), incubadas nas mesmas condições in vitro por mais 150 dias e em seguida as plântulas foram avaliadas quanto ao número de raízes, comprimento da maior raiz, número de folhas, comprimento da parte aérea, massa fresca e seca total. Os dados biométricos foram submetidos à análise estatística e a eles ajustadas curvas de regressão. As sementes apresentaram testa reticulada com uma extremidade micropilar (aberta) e calazal (fechada); o embrião originou uma estrutura tuberiforme clorofilada denominada protocormo que pode apresentar rizóides, folíolos e quando provido de raiz é considerado plântula. A ausência de açúcar ou a maior concentração avaliada de sacarose foram prejudiciais ao crescimento da planta. A concentração de 27 g L^-1 proporcionou maior crescimento in vitro possibilitando maior eficiência para a propagação massal dessa espécie de elevado potencial ornamental.

Palavras chave: Germinação assimbiótica, orquídea nativa, carboidrato.

ABSTRACT

The aims of this study were to analyze the initial germination aspects and evaluate the effect of sucrose concentrations on in vitro growth of Cattleya violacea. Mature seeds from closed pods were sowed on MS (Murashige and Skoog) culture medium. The external morphology of seed and plantlets were documented by light and scanning electron microscopy. Plantlets with 90 days after sowing were subcultured on ½ MS (with half-strength macronutrients concentrations) culture medium with different sucrose concentrations (0, 10, 20, 30 and 40 g L^-1), incubated under the same in vitro conditions during more 150 days followed by the evaluation of root number, root length, shoot length, fresh and dry weight. The biometric data were statistically analyzed and regression curves constructed. The seeds showed reticulate seed coat with a micropylar (opened) and chalazal (closed) end; the embryo results a chlorophyllated tuberiforme structure called protocorm, which may have rhizoids, leaflets and is considered plantlet when it has root. Absence of sucrose or the highest evaluated sucrose concentration was detrimental for plant growth. The concentration of 27 g L^-1 provided the highest in vitro growth enabling great efficiency for mass propagation of this species of high ornamental potential.

Keywords: Asymbiotic germination, native orchid, carbohydrate.

INTRODUÇÃO

Orchidaceae compreende uma das maiores famílias das Angiospermas pertencem à ordem Asparagales (APG 2008) e consiste de cerca de 24.500 espécies em 800 gêneros (Dressler 2005). No Brasil ocorrem 235 gêneros e 2.419 espécies (Barros et al. 2011), sendo reportado, na Amazônia brasileira, a existência de 709 espécies em 131 gêneros conhecidos (Silva e Silva 2004).

Cattleya é um gênero originário das regiões tropicais das Américas Central e do Sul composto de 48 espécies (Pridgeon 2006), mas em decorrência de recentes abordagens filogenéticas, este número pode ser ainda maior (Van den Berg 2008). O gênero compreende plantas epifíticas, encontradas em árvores de florestas úmidas, desde o nível do mar até 1500 m de altitude. Cattleya violacea (Figura 1) é uma espécie nativa, embora não endêmica do Brasil, encontrada em Estados das regiões Norte (Amazonas, Pará, Rondônia e Roraima), Centro-Oeste (Mato Grosso) e Sudeste (Minas Gerais) (Barros et al. 2011).

Atualmente, diversas populações naturais de plantas desta família têm sido afetadas por ações antrópicas decorrentes da destruição do habitat ou da coleta predatória (Arditti 1992), estimulada pelo valor que essas espécies adquirem no mercado. A regeneração natural dessas populações é dificultada pelo seu crescimento lento (metabolismo ácido das crassuláceas) e das interações mutualísticas que apresentam com insetos e microrganismos quer para a polinização ou para germinação (Roberts e Dixon 2008).

A micropropagação in vitro é reconhecida por ser uma técnica útil para produção, em larga escala, de plantas com elevada qualidade e uniformidade. Através do desenvolvimento de protocolos específicos torna-se possível o cultivo de espécies vulneráveis para comercialização ou para repovoamento (Amo et al. 2009). Sob este aspecto, a micropropagação proporcionou resultados expressivos com outras espécies classificadas "em risco" (Dutra et al. 2008; Ávila-Diaz et al. 2009; Roy et al. 2011).

Estudos morfológicos do desenvolvimento inicial de plantas nativas (em especial naquelas em processo de domesticação) podem fornecer subsídios à interpretação de testes de germinação e auxílio na análise do seu ciclo vegetativo, e são importantes para estudos botânicos, taxonômicos, ecológicos e no desenvolvimento de técnicas eficientes de propagação (Gentil e Ferreira 2005).

Por outro lado, no cultivo in vitro, a sacarose atua como uma fonte de energia e fornece carbonos que serão utilizados durante a respiração e são precursores para a biossíntese de componentes estruturais e funcionais como oligossacarídeos, aminoácidos e outras moléculas necessárias para o crescimento (Caldas et al. 1998). O suprimento exógeno de açúcar pode ampliar as reservas de amido e sacarose nas plantas micropropagadas e favorecer a aclimatização ex vitro bem como acelerar as adaptações fisiológicas (Hazarika 2003). No entanto, os explantes podem apresentar fotossíntese reduzida, provavelmente devido à presença de suficiente fonte de energia para outras atividades metabólicas (Rolland et al. 2002).

Objetivou-se com este estudo analisar (i) o padrão de germinação assimbiótica e o crescimento inicial in vitro de Cattleya violacea e (ii) avaliar o efeito das concentrações de sacarose no meio de cultura no crescimento dessa espécie nativa de elevado potencial ornamental.

MATERIAL E MÉTODOS

Desinfestação das cápsulas, viabilidade de sementes e semeadura in vitro

Cápsulas de Cattleya violacea var. tipo oriundas de autopolinização artificial, fornecidas por um orquidário comercial localizado no município de Itápolis - SP foram coletadas sete meses após a fecundação. Após coletadas, as cápsulas foram levadas ao Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", campus Jaboticabal - SP e armazenadas a 4 ºC, na ausência de luz, durante sete dias em sacos de papel contendo sílica.

As cápsulas fechadas foram lavadas externamente com detergente e água corrente e, no interior de câmara de fluxo laminar foram desinfestadas com etanol 70% durante 5 min. e hipoclorito de sódio com 1% de cloro ativo (obtido a partir de alvejante comercial) durante 30 min., seguido de três lavagens consecutivas em 200 mL de água destilada esterilizada em autoclave.

Em seguida as cápsulas foram abertas com o auxílio de bisturi e aproximadamente 1/5 das sementes foram semeadas em frascos de vidro com volume de 480 mL contendo 40 mL de meio de cultura MS (Murashige e Skoog 1962) previamente esterilizados em autoclave a 121 ºC e 1,1 atmosfera durante 15 minutos (Caldas et al. 1998). Outra amostra de 10 mg de sementes foi utilizada para avaliação da viabilidade pelo teste de tetrazólio, conforme protocolo descrito por Hosomi et al. (2011) e, a partir de diluições seriadas, três amostras de aproximadamente 1000 sementes foram observadas. Apenas sementes que apresentaram coloração rosa- avermelhadas foram contabilizadas como viáveis e assim obtido o percentual de viabilidade.

Os frascos contendo os meios de cultura e as sementes foram acondicionados em sala de incubação in vitro sob condições controladas (com temperatura de 25 ± 2 ºC e iluminação incidente nos frascos de, aproximadamente, 60 µmol.m^-1 por meio de lâmpadas fluorescentes branca Phillips^® e fotoperíodo de 16 horas luz) para promover a germinação e o crescimento.

Documentação da germinação inicial

A partir do início da germinação foram coletados, quinzenalmente até os 90 dias amostras de protocormos. Os diferentes estádios de crescimento foram visualizados e documentados em estereomicroscópio Leica (MZ12.5, Buffalo, NY, EUA), com aumento de até 50X.

Amostras de sementes e protocormos foram coletadas e prefixadas em solução de glutaraldeído (4%) em tampão K₂HP0₄ 0,1 M, pH 7,2, a 4 ºC por no mínimo 72 h. Em seguida foram lavadas três vezes na mesma solução tampão sem glutaraldeído e fixadas em tetróxido de ósmio 1% dissolvido em tampão K₂HP0₄ 0,1 M, pH 7,2, durante 1 h (Santos e Silveira 1999). As amostras foram desidratadas em série gradual de acetona (30-100%) por 30 min. a temperatura ambiente, secas ao ponto crítico em dessecador de CO₂ (Hitachi HCP-2, Tóquio, Japão), montadas em estruturas de alumínio e cobertas com 18 nm de ouro paládio em pulverizador metálico Hitachi E102. Micrografias foram obtidas a partir de um microscópio eletrônico de varredura (Jeol JSM 500, Tóquio, Japão) operado a 2.500 V. A observação das características dos protocormos procedeu-se conforme Arditti (1992).

Crescimento in vitro em diferentes concentrações de sacarose

Decorridos 90 dias da semeadura, explantes com presença de dois folíolos foram transferidos para frascos de vidro com volume de 480 mL contendo 40 mL de meio de cultura ½ MS, o qual foi composto de metade da concentração de macronutrientes, mas conteve as concentrações originais de micronutrientes, vitaminas, geleificado com 7,0 g L^-1 de ágar (Costa et al. 2009) e enriquecido com cinco concentrações de sacarose (0, 10, 20, 30 e 40 g L^-1). O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado e para cada tratamento utilizou-se cinco repetições contendo 12 explantes cada, totalizando 300 plântulas.

Após 240 dias do início do experimento foi avaliado o crescimento inicial in vitro das plântulas a partir de medidas biométricas do número de raízes, comprimento da maior raiz, número de folhas e comprimento da parte aérea por meio de um paquímetro; massa fresca e seca total obtidas a partir da secagem, em estufa de circulação forçada com renovação de ar (a 60 ºC durante 72h, até obtenção de peso constante).

Os dados biométricos do cultivo in vitro foram submetidos à análise de variância por meio do programa estatístico Sisvar (Ferreira 2008). Para os efeitos estudados que apresentaram significância a 5% de probabilidade foram ajustadas curvas de regressão.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Características das sementes e dos protocormos

As sementes de Cattleya violacea apresentaram 67 ± 1,09 % de viabilidade aos sete meses após a polinização (Figura 2a).

 

As sementes das orquídeas apresentam um padrão de germinação e crescimento inicial diferenciado da maioria das angiospermas. No princípio, ocorre o intumescimento do embrião, que provoca o rompimento da testa da semente, e a seguir a sua liberação (Kraus et al. 2006). O embrião se desenvolve em uma estrutura tuberiforme, geralmente clorofilada, chamada protocormo (Arditti 1992). O protocormo é constituído por células parenquimáticas revestidas pela epiderme e, conforme Kraus et al. (2006), pode ser considerada sinônimo de plântula por tratar-se de uma estrutura resultante do desenvolvimento do embrião zigótico germinado.

A testa da semente madura de Cattleya violacea é reticulada (Figuras 2b e 2c). Segundo Jeeja e Ansari (1994), a testa das sementes desta família é constituída de uma única camada de células, originada da epiderme unisseriada do integumento externo, sendo maior e geralmente aberta na extremidade micropilar e fechada na extremidade calazal, como observado na Figura 2b. De acordo com os mesmos autores, as paredes das células podem ser delgadas ou desenvolver alguns espessamentos lignificados.

Aos 60 dias depois da semeadura em meio de cultura MS, foi observada a completa formação de protocormos de Cattleya violacea (Figura 2d). Após algumas semanas do início do desenvolvimento, o protocormo desenvolve, na porção superior, uma região meristemática responsável pela formação do ápice caulinar vegetativo e, na porção inferior, tricomas uni ou pluricelulares, chamados de rizóides, com função principal de absorção (Cribb 1999; Kraus et al. 2006).

Na Figura 3a observa-se uma estrutura que provavelmente é o ápice caulinar onde os folíolos serão originados. Nesta região existem grandes quantidades de células meristemáticas que se dividem rapidamente durante a germinação, que levam a formação da chamada "estrutura semelhante a folíolo" (Arditti 1992), como observadas nas Figuras 2d e 3b. Por essa razão o maior desenvolvimento da parte caulinar do protocormo é observado até os 60 dias após a semeadura.

 

Os aspectos da germinação inicial de Cattleya violacea neste trabalho foram semelhantes aos descritos em Cattleya aurantiaca por Arditti (1992). Nessa fase ocorre o desenvolvimento de dois ou mais folíolos na porção superior (Figuras 3c e 3d), enquanto na inferior forma-se a primeira raiz (Figura 3e), a qual é originada do tecido caulinar, e considerada por alguns autores como raiz adventícia. O tecido parenquimático entra em degeneração. Esse processo e a presença de raiz marcam o término do estádio de protocormo (Alvarez e Sagawa 1965).

Efeito de diferentes concentrações de sacarose em meio de cultura

Os meios de cultura acrescidos de sacarose entre 20 e 30 g L^-1 foram mais eficientes (p valor = 0,021) para o crescimento in vitro de Cattleya violacea (Figura 4). O número de raízes, comprimento da maior raiz e comprimento da parte aérea apresentaram maiores valores quando as plantas foram cultivadas com as concentrações de 26,67; 30,49 e 26,84 g L^-1 de sacarose (Figuras 4a, 4b e 4d, respectivamente). Quantidades inferiores ou superiores a estas propiciaram redução no crescimento.

 

Estes resultados diferem dos apresentados por Rego-Oliveira et al. (2003), com Oncidium varicosum e Sorace et al. (2008), com Oncidium baueri, nos quais o comprimento e número de raízes foram crescentes e maiores na concentração 40 g L^-1. O excesso de açúcares pode ocasionar efeitos deletérios tais como a diminuição da absorção de água, sais minerais, e assim interferir no crescimento da plântula (Fráguas et al. 2003; Besson et al. 2010), pois maiores concentrações de sacarose altera o potencial hídrico do meio de cultura (Paiva Neto e Otoni 2003).

Os resultados do presente estudo corroboram os de Dignart et al. (2009) e Besson et al. (2010), observados em Cattleya walkeriana e Miltonia flavescens, respectivamente, nos quais resultados semelhantes foram observados com a utilização de 30 g L^-1 deste carboidrato. Ressalta-se que, em cultura de tecidos de plantas, os trabalhos geralmente utilizam esta mesma concentração de sacarose conforme proposto por Murashige e Skoog (1962).

Os maiores valores do número de folhas (Figura 4c), da massa fresca (Figura 4e) e massa seca (Figura 4f) das plantas foram registrados com a utilização de 23,56; 24,14 e 23,3 g L^-1 de sacarose, respectivamente. Concentrações semelhantes foram propostas por Fráguas et al. (2003) para o híbrido Cattleya labiata x Laelia itambana e por Pivetta et al. (2010) para a orquídea amazônica Caularthron bicornutum. Tais resultados indicam que os tecidos de Cattleya violacea apresentam exigências de concentrações próximas, mas não respondem de maneira exata a aplicação de sacarose no meio de cultura.

Os resultados observados neste trabalho evidenciam a importância da suplementação do meio de cultura com sacarose. Para Cattleya violacea recomenda-se a concentração média estimada de 27 g L^-1 de sacarose para propiciar adequado crescimento in vitro de suas plântulas objetivando o sucesso da aclimatização.

CONCLUSÕES

A descrição dos principais aspectos morfológicos da germinação inicial de protocormos de Cattleya violacea pode ser útil para auxiliar nos estudos do ciclo biológico, da conservação e até mesmo no desenvolvimento de técnicas eficientes para a propagação.

A ausência ou a dose de 40 g L^-1 de sacarose foram prejudiciais ao crescimento dessa orquídea amazônica. A concentração média de 27 g L^-1 proporcionou maior eficiência para o crescimento in vitro de plântulas. Estes aspectos serão úteis para a propagação massal e aclimatização de C. violacea.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelas bolsas de pesquisa. Ao CEPeD/Unifafibe pelo auxílio financeiro e logístico.

BIBLIOGRAFIA CITADA

Recebido em: 07/02/2012

Aceito em: 02/05/2012

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Fev 2013
• Data do Fascículo
  Jun 2013

Histórico

• Recebido
  07 Fev 2012
• Aceito
  02 Maio 2012