Diversidade molecular entre populações de Spodoptera frugiperda no Brasil avaliada por marcadores AFLP

Molecular diversity among populations of Spodoptera frugiperda in Brazil evaluated by AFLP markers

Resumos

O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade molecular, por meio de marcadores AFLP, de seis populações de Spodoptera frugiperda coletadas na cultura do milho, em diferentes regiões geográficas do Brasil. O DNA foi extraído de lagartas de quarto instar, e as reações de AFLP foram realizadas com sete combinações de oligonucleotídeos iniciadores. A partir das seis populações de S. frugiperda estudadas, foi identificado um grupo principal formado por três populações geneticamente mais relacionadas. As populações de S. frugiperda analisadas mostram alta variabilidade genética, com máximo de 58% de similaridade.

biótipo; distância genética; lagarta-do-cartucho; marcadores moleculares.

The objective of this work was to evaluate the molecular diversity, by AFLP markers, of six Spodoptera frugiperda populations collected in maize crops in different geographical regions of Brazil. DNA was extracted from fourth-instar larvae, and AFLP reactions were performed with seven oligonucleotide primer combinations. From the six studied S. frugiperda populations, a major group was identified, formed by three more genetically-related populations. The evaluated S. frugiperda populations show high genetic variability, with a maximum of 58% similarity.

biotype; genetic distance; fall armyworm; molecular markers.

A lagarta-do-cartucho, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), é praga-chave da cultura do milho no Brasil (Cruz, 2008). A espécie tem hábito alimentar polífago, com uma variedade de hospedeiros, principalmente milho, arroz e algodão (Busato et al., 2004; Martinelli et al., 2006). Também apresenta grande capacidade de dispersão e rápida disseminação nas plantas hospedeiras, o que determina a complexidade dos seus padrões genéticos e migratórios (Nagoshi & Meagher, 2008).

Para desenvolver práticas de manejo eficientes desse inseto-praga, torna-se necessário compreender a diversidade genética existente nas populações e o potencial de desenvolvimento de novas populações (Martinelli et al., 2006). Por essas razões, a caracterização molecular de indivíduos dessa espécie é essencial na compreensão de fluxos gênicos e derivas genéticas. Nesse contexto, o uso de marcadores moleculares tem se mostrado como ferramenta eficiente para caracterizar populações, uma vez que certos marcadores apresentam baixa interferência ambiental, alta taxa de reprodutibilidade e ampla distribuição nos genomas (Borém & Caixeta, 2009). Em relação a S. frugiperda, estudos de caracterização molecular são raros e não há disponibilidade de marcadores específicos para a espécie. Portanto, devem-se utilizar marcadores que não requeiram conhecimento prévio sobre o genoma. Entre estes, o "amplified fragment length polymorphism" (AFLP) possibilita caracterizar biótipos e detectar a variabilidade genética de S. frugiperda (Busato et al., 2004; Clark et al., 2007; Martinelli et al., 2007; Belay et al., 2012), por ser multilocos, com alta cobertura sobre o genoma, e por apresentar excelente reprodutibilidade.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade molecular, por meio de marcadores AFLP, de seis populações de S. frugiperda coletadas na cultura do milho, em diferentes regiões geográficas do Brasil.

O DNA foi extraído de cinco lagartas de quarto instar de populações coletadas na cultura do milho (Zea mays L.), em seis regiões geográficas do Brasil. As populações foram coletadas em: Pelotas, RS (31°38'12"S, 52°28'15.1"W, a 135 m de altitude); Vacaria, RS (28°30'23"S, 50°53'04"W, a 961 m de altitude); Inhaúma, MG (19°28'48"S, 44°23'41"W, a 753 m de altitude); e Varjão de Minas, MG (18°23'32"S, 46°01'59"W, a 956 m de altitude); Morrinhos, GO (17°47'58"S, 49°10'40"W, a 827 m de altitude); Brasília, DF (15°44'51"S, 47°54'49"W, a 1.069 m de altitude). As lagartas foram mantidas no Laboratório de Manejo Integrado de Pragas da Universidade Federal de Pelotas, no Município de Capão do Leão, RS, em sala climatizada a 25±1ºC, com umidade relativa de 70±10% e fotófase de 14 horas. As lagartas foram alimentadas com dieta artificial de acordo com Greene et al. (1976), e a criação seguiu o método descrito por Parra (2001).

Para a extração de DNA, foi utilizado o protocolo fornecido pelo kit Dneasy Blood & Tissue (Qiagen, Valencia, CA, EUA). A quantificação do DNA das amostras foi feita em espectrofotômetro NanoVue Plus (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ, EUA). As reações de AFLP foram realizadas por meio do kit AFLP Analysis System I, de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies do Brasil Ltda., São Paulo, SP). Para isso, 125 ng de DNA genômico de cada amostra foram submetidos à digestão com enzimas de restrição EcoRI e MseI e ligação de oligonucleotídeos adaptadores. Foram usados os seguintes adaptadores:

EcoRI-A1 (5'- CTCGTAGACTGCGTACC-3'),

EcoRI-A2 (5'- AATTGGTACGCAGTCTAC-3'),

MseI-A1 (5'- GACGATGAGTCCTGAG-3') e

MseI-A2 (5'- TACTCAGGACTCAT-3'). O DNA foi amplificado por meio de sete combinações de oligonucleotídeos iniciadores:

EcoRI+AC/MseI+CAC, EcoRI+AC/MseI+CTC,

EcoRI+AC/MseI+CAT, EcoRI+AC/MseI+CAG,

EcoRI+AC/MseI+CTA, EcoRI+AC/MseI+CTT

e EcoRI+AC/MseI+CTG. Os fragmentos foram visualizados em gel desnaturante de poliacrilamida (6%) e corados com nitrato de prata, como descrito por Creste et al. (2001). A separação dos fragmentos foi realizada em eletroforese por 2 horas, a 60 W.

A diversidade gênica foi estimada por combinação do oligonucleotídeo inicializador, pela seguinte equação: D = 1/n ∑pi², em que n é o número de locos polimórficos avaliados; e pi é a frequência alélica por indivíduo (Shete, 2003). Para a análise dos dados, utilizou-se o sistema binário, em que foi identificada a presença ou a ausência de bandas, representada pelos números 1 e 0, respectivamente. A partir dessa matriz de dados e com uso do coeficiente de Jaccard, para análise de similaridade genética entre as populações de S. frugiperda, foi gerada a matriz de similaridade. Posteriormente, a partir dos dados de similaridade, foi realizada a análise de agrupamento no módulo "sequential, agglomerative, hierarchical and nested clustering" (SAHN), com auxílio do programa NTSYS-pc (Rohlf, 2000), por meio do método "unweighted pair group method using arithmetic averages" (UPGMA). O dendrograma de similaridade entre as populações foi construído conforme Hair Jr et al. (2009). Para verificar a consistência dos agrupamentos gerados no dendrograma, foi construída a matriz de distância cofenética. Em seguida, a matriz de similaridade original foi correlacionada à matriz de distância cofenética, com uso do módulo "matrix comparison-graphics" (MXCOMP) do mesmo programa, para mensurar a qualidade do ajuste da análise de agrupamento e obter o coeficiente de correlação cofenética (r), calculado com o teste de Mantel com 1.000 permutações. A estabilidade estatística dos agrupamentos foi estimada pela análise de "bootstrap" com 1.000 repetições, por meio do programa computacional Winboot, versão 1.0 (Yap & Nelson, 1996).

As sete combinações de oligonucleotídeos iniciadores utilizadas geraram 130 bandas de DNA, das quais 90,8% foram polimórficas (118 bandas). Entre essas combinações de iniciadores, apenas a combinação EcoRI+AC/MseI+CTC apresentou bandas monomórficas (12), num total de 30,8%. Todas as demais, EcoRI+AC/MseI+CAC (27), EcoRI+AC/MseI+CAT (8), EcoRI+AC/MseI+CAG (14), EcoRI+AC/MseI+CTA (11), EcoRI+AC/MseI+CTT (14) e EcoRI+AC/MseI+CTG (17) foram 100% polimórficas. Esses dados caracterizaram elevado grau de polimorfismo molecular nas populações estudadas, o que evidencia que os marcadores AFLP foram eficientes na detecção da variabilidade presente nas populações.

Os valores de diversidade gênica das combinações de oligonucleotídeos iniciadores variaram de 0,02 a 0,22, com média de 0,10 entre as sete combinações avaliadas nas seis populações de S. frugiperda. As combinações EcoRI+AC/MseI+CAC, EcoRI+AC/MseI+CTC, EcoRI+AC/MseI+CAT, EcoRI+AC/MseI+CAG, EcoRI+AC/MseI+CTA, EcoRI+AC/MseI+CTT e EcoRI+AC/MseI+CTG obtiveram 0,22, 0,17, 0,10, 0,02, 0,11, 0,07 e 0,05, respectivamente, como valores de diversidade gênica. Essa diversidade foi eficaz em diferenciar as populações avaliadas.

O coeficiente de correlação cofenética (r) obtido foi de 0,98, o que indica a consistência dos agrupamentos gerados no dendrograma. Com o ponto de corte em torno de 0,29 de similaridade, obteve-se a formação de um grupo principal, pelas populações de Morrinhos, GO; Vacaria, RS; e Varjão de Minas, MG. As demais populações não foram agrupadas em nenhum grupo, o que mostra que são mais distantes geneticamente (Figura 1).

Figura 1:
Dendrograma, com base em agrupamento UPGMA, do coeficiente de similaridade de Jaccard, de seis populações de Spodoptera frugiperda. Os valores em percentual indicam o número de vezes que os insetos foram agrupados juntos em 1.000 ciclos de análise de "bootstrap".

No grupo principal, ocorreu a formação de dois subgrupos com similaridade genética mais próxima: um formado pelas populações de Morrinhos, GO, e Vacaria, RS; e o outro, pela de Varjão de Minas, MG. A população de Brasília, DF, foi a que evidenciou maior distância genética entre todas as populações estudadas. Contudo, as populações de Morrinhos, GO, e Vacaria, RS, apresentaram maior similaridade entre si, de 58%. A maior similaridade era esperada entre as populações de Vacaria e Pelotas, ambas do RS. No entanto, neste Estado, foram detectados os biótipos "arroz" e "milho" de S. frugiperda (Busato et al., 2004), o que justifica a distância genética apresentada entre Vacaria e Pelotas, RS, com similaridade inferior a 14%.

Foi observada alta variabilidade entre as populações de S. frugiperda, com apenas 58% de similaridade. Resultados semelhantes foram relatados por Clark et al. (2007), entre 23 populações advindas do México, do Brasil, dos Estados Unidos e da Argentina. Os autores, ao utilizar marcadores AFLP, verificaram que há grande variabilidade genética entre os organismos avaliados, e que a maior similaridade obtida foi de 73%, entre as populações do México (Jalisco) e da Argentina (Chaco). Nas demais populações, a similaridade genética foi, em média, de 44%, valor próximo ao encontrado no presente trabalho.

Resultado similar também foi obtido por Martinelli et al. (2006), ao analisar a diversidade genética de dez populações de S. frugiperda coletadas em milho e algodão, com uso de marcadores RAPD, em que a maior similaridade encontrada foi de 38,5% entre as populações de cultivos de milho no Mato Grosso e no Mato Grosso do Sul. Na sequência, Martinelli et al. (2007) obtiveram similaridade genética média de 45% entre as populações estudadas, ao utilizar marcadores AFLP. Estes autores concluíram que, entre todas as populações, BR5 (algodão) e BR7 (milho) foram as mais semelhantes; porém, não foi detectada a ocorrência de biótipos entre essas culturas. Este resultado foi atribuído à sobreposição espacial e temporal das culturas de milho e algodão, em algumas regiões do Brasil. Essa sobreposição não ocorreu no presente trabalho, em razão da presença de biótipos "milho" e "arroz" (Busato et al., 2004), caracterizados pela similaridade inferior a 14% entre Vacaria, RS, e Pelotas, RS (Figura 1).

A partir das seis populações de S. frugiperda avaliadas, foi identificado um grupo principal formado pelas três populações mais geneticamente relacionadas: de Morrinhos, GO; de Vacaria, RS; e de Varjão de Minas, MG. As populações de S. frugiperda analisadas mostram alta variabilidade genética no Brasil, com máximo de 58% de similaridade entre Morrinhos, GO, e Vacaria, RS.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Abr 2015

Histórico

• Recebido
  07 Ago 2014
• Aceito
  18 Mar 2015