Flavonoides e sesquiterpenos de Croton pedicellatus Kunth

Flavonoids and sesquiterpenes of Croton pedicellatus Kunth

Croton pedicellatus; blumenol A; tiliroside

ARTIGO

Flavonoides e sesquiterpenos de Croton pedicellatus Kunth^#

Flavonoids and sesquiterpenes of Croton pedicellatus Kunth

Elton Luz Lopes^I; Manoel Andrade Neto^I; Edilberto Rocha Silveira^I; Otilia Deusdênia Loiola Pessoa^I,*; Raimundo Braz-Filho^II,**

^IDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, CP 12200, 60971-270 Fortaleza - CE, Brasil

^IIDepartamento de Química, Universidade Estadual do Norte Fluminense, 28013-602 Campos dos Goytacazes - RJ, Brasil

ABSTRACT

The chemical investigation of the ethanolic extract from leaves of Croton pedicellatus yielded the bis-nor-sesquiterpenes blumenol A and blumenol A glucoside, along with the flavonoids: tiliroside, 6"-O-p-coumaroyl-β-galactopyranosyl- kaempferol, 6"-O-p-coumaroyl-β-glucopyranosyl-3"-methoxy- kaempferol, kaempferol, 3-glucopyranosyl-quercetin and alpinumisoflavone, as well as 4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid. The identification of all isolated compounds was performed by spectrometric methods, including HR-ESI-MS, 1D and 2D NMR experiments, and by comparison with previously-described physical and spectral data.

Keywords:Croton pedicellatus; blumenol A; tiliroside.

INTRODUÇÃO

A subfamília Crotonoideae, pertencente à família Euphorbiaceae, consiste de aproximadamente 2.400 espécies, agrupadas em 67 gêneros e 12 tribos.¹ O gênero Croton, o segundo maior e mais diverso desta família, é constituído por cerca de 1.200 espécies, com distribuição pantropical, porém, com significativa concentração nas Américas e África.²

Muitas espécies de Croton gens de estradas, rios e clareiras de matas. Essas e outras características ecológicas, como a produção massiva de flores e frutos durante a maior parte do ano, fazem dos membros deste gênero candidatos ideais para a restauração de florestas degradadas. Neste contexto, pode-se citar o exemplo de Croton urucurana Spreng., o qual foi cultivado com a finalidade de reflorestamento de matas ciliares no Sul do Brasil e em outras regiões.³

Várias espécies de Croton são reconhecidas como medicinais, particularmente nas Américas, África e Ásia.⁴pêuticos abrangem tanto doenças complexas como câncer, diabetes e malária, bem como constipação intestinal, diarreia, cicatrização de feridas externas, febre, inflamações, dores e úlceras.⁵ O grande leque de atividades descritas para plantas deste gênero é reflexo da alta diversidade química produzida por esse grupo, particularmente rico em metabólitos secundários, especialmente terpenoides, alcaloides e flavonoides.⁶ Os terpenoides são os metabólitos secundários predominantes no gênero Croton, com destaque para os diterpenos de esqueleto clerodano, que formam um grupo de substâncias extremamente diversificadas, contando com mais de 800 compostos já conhecidos.⁵ Embora em proporções menores, outros diterpenos, como cembranoide, halimano, pimarano, caurano, labdano e traquilobano, também foram encontrados.⁷ Triterpenos pentacíclicos e esteroides também são frequentemente relados.⁸ As plantas deste gênero também são produtoras de diferentes classes de alcaloides, fato que aumenta macológico. Compostos fenólicos têm sido frequentemente relatados, predominando os flavonoides, lignoides e proantocianidinas. Óleos voláteis, ricos em mono e sesquiterpenos, e algumas vezes compostos derivados do chiquimato são outra característica do gênero.⁴

Apesar do grande número de substâncias já isoladas e das atividades biológicas investigadas, ainda é muito pequeno o número de espécies de Croton estudadas, quer seja do ponto de vista químico ou cológica envolvendo plantas deste gênero é de extrema importância para um melhor conhecimento do potencial dessas plantas. Neste trabalho apresenta-se o resultado obtido com o estudo químico de Croton pedicellatus, o qual está sendo relatado pela primeira vez.

PARTE EXPERIMENTAL

Procedimentos experimentais gerais

Os espectros no infravermelho foram registrados em espectrômetro da Perkin-Elmer, Spectrum 100 FTIR equipado com assessório UATR. Os espectros de ressonância magnética nuclear (1D e 2D) foram obtidos em espectrômetro, modelo Avance DRX-500 (Bruker) equipado com sonda de 5 mm, operando nas frequências de 500 e 125 MHz para nuclídeos hidrogênio-1 e carbono-13, respectivamente. Os espectros de massa de alta resolução foram obtidos em espectrômetro LCMS-IT-TOF (Shimadzu), equipado com fonte de ionização por eletrospray.As amostras foram analisadas por injeção direta (5 µL) utilizando como fase móvel a mistura MeOH:H₂O 9:1. A separação dos compostos foi realizada em cromatógrafo líquido de alta eficiência delo FTD-M20A empregando coluna semipreparativa Phenomenex (C-18, 250 x 10 mm), com partículas de 5 µm. Nas cromatografias de adsorção em coluna (CC) utilizou-se gel de sílica 60 da Vetec (70-230 mesh) e Merck (40-63mesh), enquanto as cromatografias em camada delgada (CCD) foram realizadas em cromatofolha de alumínio (Merck) com indicador de fluorescência (F₂₅₄) e reveladas por aspersão de solução de vanilina/ácido perclórico/EtOH, seguida de aquecimento em estufa (≈ 100 ºC).

Material vegetal

As folhas de C. pedicellatus foram coletadas no município de Natal - Rio Grande do Norte, em agosto de 2008 (06º 05´19,7´´ S e 35º 07´33,0´´ W). A autenticação do material vegetal foi realizada pelo Prof. E. de P. Nunes (Departamento de Biologia - UFC). Uma exsicata representando a coleta da planta encontra-se depositada no Herbário Prisco Bezerra (EAC) da Universidade Federal do Ceará, sob o número 44459.

Extração e isolamento

As folhas (1 kg), após secas em estufa com ventilação e trituradas, foram submetidas à extração com 10 L de etanol (3 x), gerando 80 g de extrato bruto após destilação do solvente em evaporador rotativo sob pressão reduzida a 40 ºC. Uma alíquota de 6 g do extrato foi fracionada sobre 56,5 g de gel de sílica 60 (63-200 µm) utilizando como fase móvel os eluentes hexano, CH₂Cl₂, AcOEt e MeOH, puros ou em misturas binárias na proporção de 1:1, seguindo ordem crescente de polaridade. A fração obtida com AcOEt apresentou um precipitado amarelo que, depois de separado por filtração (410 mg), foi submetido à cromatografia flash (40-63 µm), empregando como eluente AcOEt/MeOH (97:3), resultando no isolamento de um sólido amarelo caracterizado como canferol (1, 8,6 mg).⁹ Uma outra alíquota do extrato bruto (40 g) foi dissolvida em 200 mL da mistura metanol/ água (1:1) e submetida à partição líquido-líquido (4 x 50 mL) com hexano, CH₂Cl₂, AcOEt e n-BuOH (2 x 30 mL), resultando nas frações CPFE-H, CPFE-D, CPFE-Ac e CPFE-Bu, respectivamente. A fração CPFE-D (6,52 g) foi submetida à CC sobre gel de sílica 60 (63-200 µm) resultando em 7 novas frações (CPFE-D 1 a 7). CPFE-D 2 (476 mg) foi submetida à cromatografia flash (43-60 µm) utilizando como fase móvel (hexano/AcOEt 7:3) dando origem a 70 frações que, após analisadas por CCD, foram reunidas em 6 frações (F1-F6). F2 (26,8 mg) foi ressubmetida à cromatografia flash utilizando hexano/ AcOEt (8,5:1,5), gerando cristais aciculares, e foi identificada como alpinumisoflavona (2, 15,8 mg).¹⁰ A fração CPFE-Ac (6,8 g) foi submetida à CC sobre gel de sílica desativada (sílica imersa em EtOH por 3 h, seguida por filtração a vácuo e lavagem com AcOEt) e como eluentes foram utilizados hexano e AcOEt puros ou em mistura binária seguindo ordem crescente de polaridade, seguido de MeOH, gerando 8 frações (CPFE-Ac 1 a 8), após monitoramento em CCD. A fração CPFE-Ac3 (60 mg) foi submetida à CLAE (fase móvel MeOH/H₂O 5,5:4,5; fluxo 4,72 mL/8 min) resultando no isolamento de dois compostos sólidos, um incolor e outro amarelo, caracterizados como blumenol A (3, T_R 6,2 min, 6,1 mg)¹¹ e ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico (4, T_R 4,6 min, 12,1 mg),¹² respectivamente. Uma alíquota de CPFE-Ac 4 (400 mg) também foi fracionada por CLAE (fase móvel H₂O/ACN 7,3:2,7; fluxo 4,72 mL/20 min) resultando no isolamento dos compostos: 6''-O-p-cumaroil-β-galactopiranosilcanferol (5, T_R 14,9 min; 7,6 mg);¹³ 6''-O-p-cumaroil-β-glicopiranosilcanferol (tilirosídeo) (6, T_R 15,6 min; pf 218,1-219,4 ºC, 102,3 mg)¹³ e 6''-O-p-cumaroilβ-glicopiranosil-3'-metoxicanferol (7, T_R 17,8 min; 15,8 mg).¹⁴ A fração CPFE-Ac 5 (1,2 g) após ser submetida à CC sobre gel de sílica desativada e eluída com hexano, AcOEt e MeOH, gerou 8 subfrações cionada por CLAE (fase móvel H₂O/ACN 9,3:2,7; 4,72 mL/10 min) resultando no isolamento de 3-glicopiranosilquercetina (8, T_R 4,6 min; 5,8 mg).¹⁵ram aplicadas à CLAE (fase móvel H₂O/ACN 8,5:1,5; 4,72 mL/10 min) fornecendo o composto roseosídeo (9, T_R 7,5 min; 14,8 mg).¹⁶

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A prospecção química do extrato EtOH das folhas de C. pedicellatus resultou no isolamento de 9 metabólitos secundários, cujas estruturas foram determinadas utilizando dados de RMN ¹H e ¹³C, incluindo experimentos bidimensionais como COSY, HSQC e HMBC ferol (1), alpinumisoflavona (2) e 3-glicopiranosilquercetina (8) e do ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico (4) (Figura 1) foram facilmente determinadas, entretanto, as estruturas dos demais flavonoides, em virtude da semelhança estrutural, assim como dos dois sesquiterpenos exigiram maior atenção quanto à interpretação dos dados espectrais.

O composto 3, um sólido branco com faixa de fusão de 110-112 ºC, apresentou a fórmula molecular C₁₃H₂₀O₃, a qual foi deduzida por espectrometria de massa de alta resolução (m/z 223,1339, [M-H]^-). No espectro de RMN ¹H (500 MHz, CDCl₃dos três sinais de hidrogênios olefínicos em δ 5,90 (sl, H-2), 5,78 (d, J = 15,5 Hz, H-7) e 5,84 (dd, J = 15,5 e 5,5 Hz, H-8), quatro grupos metílicos em δ 1,28 (d, J = 6,5 Hz, Me-10), 1,89 (s, Me-11), 1,07 (s, Me-13) e 1,01 (s, Me-12), dois prótons metilênicos em δ 2,44 (H-6a) e 2,23 (H-6b) (d, J = genado em δ 4,40 (q, J = 6,5 Hz, H-9). O espectro de RMN ¹³C (125 MHz, CDCl₃) exibiu 13 linhas espectrais, corroborando os dados de hidrogênio e destacando, entre outros, a presença de uma carbonila de cetona conjugada (δ 198,4, C-1) e dos carbonos oxigenados com deslocamento químico em δ 79,2 (C-4) e 68,2 (C-9) (Tabela 1). A combinação da fórmula molecular com os dados de RMN sugere a estrutura de um bis-nor-sesquiterpeno. Uma análise detalhada dos dados de RMN e comparação com informações da literatura levaram à conclusão de que o composto se tratava do sesquiterpeno blumenol A,¹⁷ previamente isolado de Croton tiglium.¹¹

O composto 5, sólido amorfo amarelo, pf 208,6-209,4 ºC, teve sua fórmula molecular C₃₀H₂₆O₁₃ determinada através do espectro de massa de alta resolução obtido com ionização por eletrospray (m/z 617,1243, [M+Na]⁺). O espectro de absorção na região do infravermelho apresentou bandas características de deformação axial de grupos hidroxila (3400 cm^-1) e carbonila (1690 cm^-1), além de bandas esqueletais (1610 e 1540 cm^-1). O espectro de RMN ¹H (500 MHz, CDCl₃) apresentou sinais em δ 8,48 (2H, d, J = 8,6 Hz, H-2'/6') e 7,19 (2H, d, J = 8,6 Hz, H-3'/5') para hidrogênios em posição orto em um sistema aromático p-substituído e sinais em δ 6,73 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-8) e 6,71 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-6) para hidrogênios meta posicionados, conforme valores das constantes de acoplamentos. Estes dados foram compatíveis com uma estrutura flavonoídica substituída nas posições 5, 7 e 4'.¹⁰ Os sinais em δ 7,84 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-7"') e 6,48 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-8"') revelaram uma dupla ligação com configuração trans, que em conjunto com os sinais em δ 7,52 (1H, d, J = 8,9 Hz, H-2"'/6"') e 7,16 (1H, d, J = 8,9 Hz, H-3"'/5"'), indicaram uma unidade p-cumaroil.¹¹ Os sinais em δ 6,12 (1H, d, J = 7,7 Hz, H-1"), 4,94 (1H, dd, J = 11,0 e 7,6 Hz, H-6"a), 4,80 (1H, t, J = 9,2 Hz, H-2"), 4,82 (1H, dd, J = 11,0 e 4,5 Hz, H-6"b), 4,43 (1H, m, H-4") e 4,32 (2H, m, H-3"/5") mostraram a presença de uma unidade de açúcar. A combinação dos espectros de RMN ¹³C-PND e DEPT 135 indicou a presença de grupos carbonilas, anéis aromáticos e de uma unidade monossacarídica, corroborando com as informações obtidas do espectro de RMN ¹H. Os dados espectrais observados quando comparados àqueles disponíveis na literatura foram compatíveis com a galactose. Deste modo, a estrutura do composto 5 foi identificada como sendo o flavonoide 6"-O-p-cumaroil-β-galactopiranosilcanferol.⁹

O composto 6, sólido amorfo amarelo, pf 218,1-219,4 ºC, também teve sua fórmula molecular C₃₀H₂₆O₁₃ determinada através do espectro de massa de alta resolução (m/z 617,1223, [M+Na]⁺). O espectro de absorção na região do infravermelho apresentou bandas características de deformação axial de grupos hidroxila (3461 cm^-1), carbonila (1710 cm^-1) e bandas esqueletais (1606 e 1500 cm^-1). Os espectros de RMN ¹H (500 MHz, MeOD) e ¹³C (125 MHz) revelaram uma estreita semelhança com aqueles do composto 6. As principais diferenças foram quanto aos dados referentes à unidade de açúcar que, após análise meticulosa e comparação com dados da literatura, foram compatíveis com uma unidade de glicose, cuja única diferença da galactose é quanto à posição da hidroxila em C-4''. Estes dados permitiram determinar a estrutura do composto 6 como 6"-O-pcumaroil-β-glicopiranosilcanferol, conhecido como tilirosídeo¹³ e frequente no gênero Croton.¹⁸

O composto 7, obtido como um sólido amarelo, pf 203,2-204,7 ºC e fórmula molecular C₃₁H₂₈O₁₄ (m/z 647,1330, [M+Na]⁺) também mostrou, através de seus dados espectrais, ter uma estrutura semelhante a 5. Os espectros de RMN ¹H e ¹³C evidenciaram a presença de um grupo metoxila, em δ 3,90 e 56,8, respectivamente, cuja posição foi definida através do espectro HMBC, bem como diferença no padrão de substituição do anel B quando comparado ao de 5. Para este anel foram observados sinais em δ 7,85 (d, J = 1,9 Hz, H-2'), 7,54 (dd, J = 1,9 e 8,4 Hz, H-6') e 6,82 (d, J = 8,4 Hz, H-5'), indicando um sistema de spins do tipo AMX. Com isto, a estrutura de 7minada como 6"-O-p-cumaroil-β-glicopiranosil-3'-metoxicanferol.¹⁴

O composto 9 obtido como um sólido resinoso amarelo, apresentou a fórmula molecular C₁₈H₃₀O₈ deduzida através da combinação dos dados de RMN ¹H e ¹³C (Tabela 1) e espectrometria de massa de alta resolução (m/z 385,1868, [M-H]^-). Exceto pelos sinais adicionais em δ_C 102,8-62,9/δ_H 4,34-3,63 correspondentes a uma unidade de glicose, todos os demais deslocamentos químicos para 9 mostraram-se semelhantes ao do composto 3 (Tabela 1). Através da correlação a longa distância entre o sinal em δ 4.34 (d, J = 7,8 Hz, H-1') com o carbono em δsível determinar com segurança a localização da unidade de glicose. Estes dados conduziram à estrutura de um derivado glicosilado do blumenol A, conhecido como roseosídeo, o qual foi previamente isolado de Tapirira guianensis (Anacardiaceae)¹¹ e Macaranga tanarius (Euphorbiaceae).¹⁹

CONCLUSÃO

O estudo fitoquímico de C. pedicellatus culminou no isolamento de metabólitos secundários de natureza terpênica e fenólica, comuns em espécies de Croton. No entanto, são relatados pela primeira vez na família Euphorbiaceae dois análogos do tilirosídeo, 6''-O-p-cumaroilβ-galactopiranosilcanferol e 6''-O-p-cumaroil-β-glicopiranosil-3'cetina e do ácido 4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzoico.

MATERIAL SUPLEMENTAR

Está disponível em http://quimicanova.sbq.org.br, em arquivo pdf, com acesso livre.

AGRADECIMENTOS

Às agências brasileiras de fomento à pesquisa CNPq/CAPES/ PRONEX e FUNCAP pelas bolsas de estudo, bolsas de pesquisador e auxílios financeiros concedidos para a realização deste trabalho.

REFERÊNCIAS

1. Webster, G. L.; Missouri Bot. Gard. 1994,81,33.

2. Maciel, M. A. M.; Cortez, J. K. P. C.; Gomes, F. E. S.; Revista Fitos 2006,2,54.

3. Carrenho, R.; Bononi, V. L. R.; Barbosa, L. M.; Hoehnea 1997,24,107.

4. Salatino, A.; Salatino, M. L. F.; Negri, G.; J. Braz. Chem. Soc. 2007,18,11.

5. Maciel, M. A. M.; Pinto, A. C.; Kaiser, C. R.; Magn. Resson.Chem. 2003,41,278.

6. Randau, K. P.; Florêncio, D. C.; Ferreira, C. P.; Xavier, H. S.; Rev. Bras. Farmacogn. 2004,14,89.

7. Palmeira Júnior, S. F.; Conserva, L. M.; Barbosa Filho, J. M.; Nat. Prod. Comm. (Online) 2006,1,319.

8. Brasil, D. S. B.; Muller, A. H.; Guilhon, G. M. S. P.; Alves, C. N.; Peris, G.; Llusar, R.; Moliner, V.; J. Braz. Chem. Soc. 2010,21,731.

9. Park, Y.; Moon, B.; Yang, H.; Lee, Y.; Lee, E.; Lim, Y.; Magn. Resson. Chem. 2007,45,1072; Vega, M. R. G.; Esteves-Souza, A.; Vieira, I. J. C.; Mathias, L.; Braz-Filho, B.; Echevarria, A.; J. Braz. Chem. Soc. 2007,18,1554.

10. El-Masry, S.; Amer, M. E.; Abdel-Kader, M. S.; Zaatout, H. H.; Phytochemistry 2002,60,783.

11. Gonzalez, A. G.; Guillermo, J. A.; Ravelo, A. G.; Jimenez, I. A.; J. Nat. Prod. 1994,57,400; Bu, W.; Shi, Y.; Yan, Y.; Lu, Q.; Liu, G.; Li, Y.; Cheng, Y.; Nat. Prod. Bioprospect. 2011,1,134.

12. Kanchanapoom, T.; Phytochemistry, 2007,68,692.

13. Silva, D. A.; Costa, D. A.; Silva, D. F.; Souza, M. F. V.; Agra, M. F.; Medeiros, I. A.; Barbosa-Filho, J. M.; Braz-Filho, R.; Rev. Bras. Farmacogn. 2005,15,1.

14. Gobbo-Neto, L.; Lopes, N. P.; J. Agric. Food Chem. 2008,56,1193.

15. Stark, T.; Bareuther, S.; Hofmann, T.; J. Agric. Food Chem. 2005,53,5407.

16. Correia, S. J.; David, J. M.; Silva, E. P.; David, J. P.; Lopes, L. M. X.; Guedes, M. L. S.; Quim. Nova 2008,31,2056.

17. Erosa-Rejón, G.; Peña-Rodríguez, L. M.; Sterner, O.; J. Mex. Chem. Soc. 2009,53,44; Kato-Noguchi, H.; Tamura, K.; Sasaki, H.; Suenaga, K.; J. Plant Physiol. 2012,169,682.

18. Aderogba, M. A.; McGaw, L. J.; Bezabih, M.; Abegaz, B. M.; Nat. Prod. Res. 2011,25,1224; Zou, G.; Su, Z.; Zhang, H.; Wang, Y.; Yang, J.; Zou, Z.; Molecules 2010,15,1097; Palmeira, S. F. J.; Alves, V. L.; Moura, F. S.; Vieira, L. F. A.; Conserva, L. M.; Lemos, R. P. L.; Rev. Bras. Farmacogn. 2006,16,397; Phan, M.; Lee, J.; Phan, T.; Tap Chi Hoa Hoc. 2004,42,125; Lencina, C.; Pires, V. S.; Gosmann, G.; Taketa, A. T. C.; Schenkel, E. P.; Rev. Bras. Farmacogn. 2001,11,89.

19. Matsunami, K.; Otsuka, H.; Kondo, K.; Shinzato, T.; Kawahata, M.;Yamaguchi, K.; Takeda, Y.; Phytochemistry 2009,70,1277.

Recebido em 25/4/12; aceito em 7/8/12; publicado na web em 5/10/12

Material Suplementar

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Artigo em homenagem ao Prof. Otto R. Gottlieb (31/8/1920-19/6/2011)

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Professor visitante emérito - FAPERJ/UENF/UFRRJ

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Nov 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  25 Abr 2012
• Aceito
  07 Ago 2012