Síntese e avaliação da atividade antimalárica de compostos derivados da curcumina

Synthesis and evaluation of antimalarial activity of curcumin derivatives

curcumin derivatives; antimalarial chemotherapy; Plasmodium falciparum

ARTIGO

Síntese e avaliação da atividade antimalárica de compostos derivados da curcumina

Synthesis and evaluation of antimalarial activity of curcumin derivatives

Patrícia Ramos Gomes^I; Fábio Balbino Miguel^I; Michael Éder de Oliveira^II; Vanessa Viana Ferreira^II; Daniel Silqueira Martins Guimarães^II; Aline Brito de Lima^II; Camila de Souza Barbosa^II; Mariana Amorim de Oliveira^II; Mauro Vieira de Almeida^I; Gustavo Henrique Ribeiro Viana^II; Mara Rubia Costa Couri^I; Fernando de Pilla Varotti^II,*

^IDepartamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, Universidade Federal de Juiz de Fora, Cidade Universitária, 36036-900 Juiz de Fora - MG, Brasil

^IICentro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de São João Del Rei - Campus Centro Oeste, 35501-296 Divinópolis - MG, Brasil

ABSTRACT

One of the main challenges in the development of new antimalarial drugs is to achieve a viable lead candidate with good pharmacokinetic properties. Curcumin has a broad range of biological activities, including antimalarial activity. Herein, we report the antimalarial activity of six curcumin derivatives (6-12) and an initial analysis of their pharmacokinetic properties. Five compounds have demonstrated potent activity against the P. falciparum in vitro (IC₅₀ values ranging from 1.7 to 15.2 µg mL^-1), with moderate or low cytotoxicity against the HeLa cell line. The substitution of the carbonyl group in 6 by a 2,4-dinitrophenylhydrazone group (to afford 11) increases the Selective Index. These preliminary results indicate curcumin derivatives as potential antimalarial compounds.

Keywords: curcumin derivatives; antimalarial chemotherapy; Plasmodium falciparum.

INTRODUÇÃO

Segundo a OMS a malária é uma doença parasitária de grande importância epidemiológica considerada um problema grave de saúde pública.¹ No Brasil, dados do Ministério da Saúde demonstram que o número de casos da doença foi de aproximadamente a 200.000 no ano de 2011 e desses 99,9% foram originados nos Estados da Amazônia Legal.²

A malária é causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e cinco espécies são responsáveis pela infecção em humanos: Plasmodium ovale, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium falciparum e mais recentemente Plasmodium knowlesi,³ sendo o P. falciparum a espécie responsável pela forma mais grave da doença.⁴

Sem uma vacina eficaz, seu controle exige um programa integrado que inclui proteção individual contra a picada dos vetores e o tratamento quimioterápico específico dos pacientes infectados.¹ O atual arsenal terapêutico empregado no tratamento clínico da malária adota a utilização de associações medicamentosas de compostos 4- e 8-aminoquinolínicos sintéticos, como mefloquina e primaquina, com derivados endoperóxidossemi-sintéticos da artemisinina: o arteméter, o arteeter e o artesunato.⁵

No entanto, o elevado custo dessas associações⁶ somado à crescente resistência do Plasmodium à terapia convencional⁷ torna urgente a busca de novas classes de quimioterápicos capazes de combater o parasito causador da doença. Neste contexto, a triagem de novos compostos com ação antimalárica ainda configura-se como uma ferramenta útil no combate à cepas de Plasmodium resistentes.⁵

A curcumina, (Figura 1) é um polifenol natural abundante no rizoma da erva perene cúrcuma, Curcuma longa Linnaeus, também conhecida como açafrão da Índia. É amplamente usada como tempero e corante na culinária indiana.^8,9

A curcumina tem sido utilizada na medicina Ayuverdica, a medicina tradicional da Índia, por mais de 6000 anos com várias propriedades farmacológicas descritas, incluindo ação anti-inflamatória, anticarcinogênica e anti-infecciosa.^10-12

Os efeitos citotóxico e antiparasitário da curcumina já foram demonstrados em culturas contra Leishmania, Trypanosoma, Giardia e Plasmodium falciparum.^13,14

Neste trabalho descrevemos a síntese e a avaliação in vitro da ação antimalárica, contra Plasmodium falciparum, de seis compostos sintéticos derivados da curcumina.

PARTE EXPERIMENTAL

Os espectros de ressonância magnética nuclear de hidrogênio e de carbono 13 foram obtidos em um espectrômetro BRUKER AVANCE DRX/300. Como referência interna foi utilizado o tetrametilsilano (TMS). Os valores de deslocamento químico (δ) são referidos em partes por milhão (ppm) e os valores de constante de acoplamento (J) em Hz. Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados em um espectrofotômetro BOMEM-FTIR MB-120 utilizando-se pastilhas de KBr previamente dessecadas a 500 ºC como suporte para os compostos sólidos. Os valores para a absorção são referidos em números de onda, utilizando como unidade cm^-1. As faixas de fusão foram obtidas em aparelho digital MQAPF-Microquímica.

Síntese dos Compostos

Procedimento geral para a síntese das cetonas 6-10 ¹⁵

Em um balão de fundo redondo de 50 mL contendo uma mistura de solução aquosa de hidróxido de sódio (2,5 mmol) e acetona (1 mmol), foi adicionada gota a gota uma solução etanólica do aldeído aromático (2 mmol). A mistura reacional permaneceu sob agitação magnética à temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos quando observou-se a formação de um precipitado floculento. Por meio de CCD (Hexano/AcOEt 9:1 v/v; revelador: UV) foi constatado o fim da reação. O sólido formado foi então separado por filtração a vácuo, lavado com H₂O/EtOH e recristalizado em hexano/AcOEt (proporção de 3:1 v/v) ou em EtOH.

(1E,4E)-1,5-(difenilpenta)-1,4-dien-3-ona (6)

Rendimento 44%, sólido amarelo,T.F.129-130 ºC (Lit. 128-130 ºC).¹⁶ IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3052 (C-H aromático), 2961(C-H alifático), 1653 (C=O), 1630 (C=C aromático), 1597 (C=C olefina), 1250 (C_AR-O-C). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 7,74 (d, J= 16,0 Hz, 2H); 7,40-7,61 (m, 10H); 7,08 (d, J= 16,0 Hz, 2H). RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ=189,1; 143,5; 135,0; 130,7; 129,2; 128,6; 125,7.

(1E,4E)-1,5-bis(4'-metoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona (7)

Rendimento 98%, sólido amarelo,T.F. 110-111 ºC (Lit. 110-112 ºC).¹⁶ IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3054 (C-H aromático), 2997 (C-H alifático), 1651 (C=O), 1627 (C=C aromático), 1592 (C=C olefina). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 7,69 (d, J= 15,9 Hz, 2H); 7,54 (d, J= 8,7 Hz, 4H); 6,94 (d, J= 15,9 Hz, 2H); 6,90 (d, J= 8,7 Hz, 4H); 3,83 (s, 6H). RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ= 188,9; 161,7; 142,8; 130,2; 127,8; 123,7; 114,7; 55,5.

(1E,4E)-1,5-bis(3',4',5'-trimetoxifenil)penta-1,4-dien-3-ona (8)

Rendimento 76%, sólido amarelo, T.F. 125-126 ºC (Lit. 128 ºC).¹⁷ IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3008 (C-H aromático), 2943-2844 (C-H alifático), 1623 (C=O), 1583 (C=C aromático), 1128 (C_AR-O-C). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 7,67 (d, J= 15,8 Hz, 2H); 6,98 (d, J= 15,8 Hz, 2H); 6,85 (s, 4H); 3,92 (s, 6H) . RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ=188,7; 153,7; 143,6; 140,6; 130,5; 124,9; 105,4; 56,4.

(1E,4E)-1,5-bis(4'-deciloxifenil)penta-1,4-dien-3-ona (9)

Rendimento 11%, sólido branco, T.F. 70-71 ºC. IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3023 (C-H aromático), 2964 (C-H alifático), 1665 (C=O), 1609 (C=C aromático), 1515 (C=C olefina), 1264 (C_AR-O-C). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 7,49 (d, J= 8,5 Hz, 4H); 7,47 (d, J= 16,0 Hz, 2H); 6,90 (d, J= 8,5 Hz, 4H); 6,60 (d, J=16,0 Hz, 2H); 3,98 (t, J= 6,4 Hz, 4H); 1,74-1,81 (m, 4H); 1,25-1,45 (m, 28H); 0,88 (t, J= 6,4 Hz, 6H).RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ= 198,7; 161,5; 143,6; 130,2; 127,0; 125,1; 115,1; 68,4; 32,1; 29,8; 29,6; 29,5; 29,3; 27,6; 22,9; 14,3.

(1E,4E)-1,5-bis(4'-dodeciloxifenil)penta-1,4-dien-3-ona (10)

Rendimento 44%, sólido branco,T.F.72-73 ºC. IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3019 (CH aromático), 2957 (CH alifático), 1665 (C=O), 1606 (C=C aromático), 1264 (C_AR-O-C). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 7,49 (d, J= 8,5 Hz, 4H); 7,45 (d, J= 16,3 Hz, 2H); 6,90 (d, J= 8,5 Hz, 4H); 6,60 (d, J=16,3 Hz, 2H); 3,98 (t, J= 6,6 Hz, 4H); 1,72-1,83 (m, 4H); 1,26-1,45 (m, 40H); 0,88 (t, J= 6,6 Hz, 6H). RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ= 198,6; 161,5; 146,6; 130,2; 127,0; 125,1; 115,1; 68,4; 32,1; 29,8; 29,7; 29,6; 29,5; 29,3; 27,6; 26,1; 22,9; 14,3.

Procedimento geral para a síntese das hidrazonas 11 e 12 ¹⁵

Em um balão de fundo redondo de 50 mL, a solução metanólica das cetonas 6 e 9 foi adicionada gota a gota, sob agitação magnética e aquecimento (60 ºC) a uma solução ácida de 2,4-dinitrofenilhidrazina (ou 4-nitrofenilhidrazina) previamente preparada.¹⁵ A mistura reacional foi mantida sob agitação magnética e a 60 ºC por mais 5 minutos quando observou-se a formação de um precipitado. O desenvolvimento da reação foi acompanhado por CCD (eluente: hexano/AcOEt 7:3 v/v; revelador: UV). As hidrazonas 11 e 12 foram obtidas sob a forma de sólidos. O sólido formado foi então separado por filtração à vácuo e recristalizado em AcOEt/hexano (1:3 v/v).

(1E,4E)-1,5-(difenilpenta)-1,4-dien-3-ona-2,4-dinitrofenilhidrazona (11)

Rendimento 88%, sólido vermelho, T.F.178-179 ºC. IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3289 (N-H), 3056 (C-H aromático), 2998 (C-H alifático), 1615 (C=C olefinas), 1588 (C=N), 1498 (n_ass. NO₂), 1332 (n_sim. NO₂), 1091 (C_AR-NO₂). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 11,70 (s, 1H); 9,10 (d, J= 2,6 Hz, 1H); 8,30 (dd, J=9,6 Hz, J= 2,2 Hz, 1H); 8,10 (d, J=9,6 Hz, 1H); 7,30-,7,60 (m, 6H); 7,20 (d, J=17,0 Hz, 2H); 7,10 (d, J=8,0 Hz, 4H); 6,90 (d, J=17,0 Hz, 2H).RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ= 153,3; 144,3; 141,3; 137,1; 136,1; 130,1; 129,0; 127,4; 126,3; 123,6; 116,8, 116,4.

(3E,4E)-1,5-difenil-4-penten-1-ol-3-ona-4-nitrofenilhidrazona (12)

Rendimento 69%, sólido laranja, T.F.135-136 ºC. IV (KBr) ν_max/cm^-1: 3438 (O-H), 3058 e 3023 (C-H aromático), 2917 (C-H alifático), 1596 (C=C aromáticos e olefinas), 1596 (C=N), 1506 (n_ass. NO₂), 1301 (n_sim. NO₂), 1109 (C_AR-NO₂), 1301 (νC-OH). RMN ¹H (300 MHz, CDCl₃). δ= 8,04 (d, J= 9,2 Hz, 2H); 7,17-7,47 (m, 12H); 6,97 (d, J= 9,8 Hz, 2H); 6,68 (d, J=16,5 Hz, 1H); 5,36 (dd, J=12,1 Hz, J=5,3 Hz, 1H); 3,78 (dd, J=17,1 Hz, J=12,1 Hz, 1H); 3,11 (dd, J=17,1, J=5,3 Hz, 1H).RMN ¹³C (75 MHz; CDCl₃): δ= 152,5; 148,2; 140,8; 139,5; 136,1; 135,8; 129,7; 129,0; 128,4; 128,0; 127,0; 125,9; 125,6; 124,9; 124,6; 120,8; 112,3; 111,8; 111,6; 63,5; 42,6.

Solubilização dos compostos

Os compostos foram diluídos em dimetilsulfóxido (DMSO) não ultrapassando a concentração de 0,05% final. O antimalárico controle, cloroquina, foi diluído com RPMI (SigmaAldrich). As soluções estoque (5 mg mL^-1) foram preparadas no dia dos experimentos.

Cultivo in vitro das fases intra-eritrocitárias de Plasmodium falciparum

Os parasitos da cepa W2 (cloroquina-resistente) e 3D7 (cloroquina-sensível) foram cultivados em hemácias humanas in vitro.^18,19 Resumidamente, os parasitos foram cultivados em placas de Petri com hematócrito a 5% usando meio RPMI 1640 suplementado com 25 mM de Hepes, 21 mM de bicarbonato de sódio, 300 mM de hipoxantina, 11 mM de glicose, 40 mg mL^-1 de gentamicina e 10% (v/v) de plasma humano inativado. As placas foram mantidas à 37 ºC em dessecadores nos quais a concentração adequada de O₂ foi obtida pela combustão de uma vela, sendo realizadas trocas diárias de meio. A parasitemia foi determinada diariamente por meio de esfregaços sanguíneos das culturas fixados com metanol e corados com solução de Giemsa. O cálculo da parasitemia foi realizado segundo a fórmula descrita abaixo:

Parasitemia=Nº de hemácias parasitadas/Nº de hemácias totais

Sincronização do cultivo de Plasmodium falciparum

As culturas de P. falciparum foram sincronizadas pelo método de sorbitol²⁰ para obtenção de uma amostra com predomínio de fase jovem (anel) para os ensaios in vitro.

Ensaio antimalárico in vitro

As culturas sincronizadas com 1-2% de parasitemia no estágio de anel e 2% de hematócrito foram distribuídas em microplacas de 96 poços. Os compostos testados foram adicionados a diferentes concentrações. Em paralelo, foi utilizado o antimalárico padrão cloroquina. Cada composto foi testado em triplicata, nas concentrações seriadas de 50 a 1,56 µg mL^-1. As placas foram incubadas por 48 h a 37 ºC e congeladas a -80 ºC por 24 h. Em uma nova placa de 96 poços foi adicionado 150 µl do anticorpo monoclonal anti-HRP2 (MPFM ICLLAB-55A®, USA) a 0,8 µg ml^-1. Após 24 h de incubação a 4 ºC, a solução foi descartada e a placa foi bloqueada com a adição de 200 µl/poço de uma solução PBS-ALB 5% (PhosphateBuffered Saline e Albumina Bovina) (Sigma-Aldrich). Após nova incubação por 3h a temperatura ambiente, as placas foram lavadas cinco vezes com PBS. Após esta etapa, foi adicionado 100 µl/poço da cultura pré-tratada como descrito acima. Após 2h de incubação a temperatura ambiente, a placa foi novamente lavada cinco vezes com PBS, e incubadas com 120 µl/poço do anticorpo secundário (MPFG55P ICLLAB®, USA), diluído 1:4000 por 2 h a temperatura ambiente. Após esta etapa, a placa foi novamente lavada cinco vezes com PBS e foi adicionado 100 µl/poço de TMB. Após a incubação por 30 min em ambiente protegido da luz, a absorbância a 450 nm foi lida em um espectrofotômetro de microplacas (Espectramax M5e/Molecular Devices).²¹P. malariae and P. ovale (pLDH A concentração que inibe 50% da viabilidade dos parasitos (IC₅₀) foi determinada em comparação com o controle sem a presença dos compostos (considerado 100% de viabilidade).

Ensaios de citotoxicidade

A citotoxicidade dos compostos sintéticos foi avaliada utilizando contra a linhagem celular HeLa (ATCC # CCl-2) pelo ensaio redução do 3-(4,5 dimetiltiiazol-2il)-2,5 difeniltretazólico (MTT). Para o ensaio de viabilidade celular as células foram transferidas para uma placa de 96 poços na concentração de 1x10⁵ células/poço e incubadas por 24 h em estufa a 37 ºC e atmosfera úmida de 5% CO₂. Os compostos testados foram adicionados em diferentes concentrações que variaram de 1000 a 0,1 µg mL^-1. Após 48 horas de incubação, os poços foram lavados com meio incompleto e foi adicionado o sal tetrazólico MTT na concentração de 5 mg mL^-1. Após 3 horas de incubação as placas foram centrifugadas por 5 min a 300 g. O sobrenadante foi descartado e foi acrescentado 50 µL de DMSO em cada poço para solubilizar os cristais de formazan. A leitura foi realizada em espectrofotômetro de microplacas (Espectramax M5e/Molecular Devices). A concentração que inibe em 50% o crescimento das células (IC₅₀) na presença dos compostos testes e dos antimaláricos controles foi determinada em comparação com células cultivadas sem a presença de compostos (considerada 100% de crescimento).

Determinação da concentração inibitória de 50% (IC₅₀) do crescimento dos parasitos e da linhagem celular HeLa

A inibição do crescimento de 50% dos parasitos e das células foi determinada através de curvas dose-resposta, em função de regressão não linear. Foi utilizado o programa Origin (OriginLab Corporation, Northampton, MA, EUA), para determinar o valor de IC₅₀.

Índice de seletividade

O índice de seletividade (IS) é a relação entre as atividades citotóxicas e antiparasitárias de cada composto. O IS foi obtido através da razão entre o valor de IC₅₀ para HeLa e IC₅₀ para P. falciparum (cepa W2):

IS = IC₅₀ linhagem celular HeLa / IC₅₀P. falciparum (cepa W2)

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Sete derivados sintéticos da curcumina foram sintetizados e caracterizados (6-12) com rendimentos que variaram de 11 a 98% conforme os Esquemas 1 e 2. Dentre estes, o composto 12 é inédito na literatura.

A primeira série de derivados sintéticos da curcumina 6-10 (Esquema 1) foi planejada de forma a verificar a influência da presença ou ausência de diferentes grupos alcoxila nos anéis aromáticos desses compostos sobre a sua ação antimalárica. A segunda série, com os compostos 11 e 12 (Esquema 2), foi sintetizada para se verificar a influência da conversão dos grupos carbonila em suas hidrozonas correspondentes sobre a atividade antimalárica. O composto 9 foi obtido com 11% de rendimento e não foi utilizado para a realização dos ensaios antimaláricos devido à pequena quantidade obtida.

Cinco dos seis derivados sintéticos da curcumina apresentaram valores de IC₅₀ entre 2,0 e 20,4 µg mL^-1 nos ensaios in vitro realizados em cultura de P. falciparum contra a cepa 3D7 cloroquina-sensível (Tabela 1). Os mesmos compostos, testados contra a cepa W2 (cloroquina-resistente), apresentaram valores de IC₅₀ semelhantes à cepa 3D7, variando de 1,7 a 15,2 µg mL^-1.

Dentre os derivados sintéticos da curcumina, o composto 6 apresentou o menor valor de IC₅₀ contra as cepas 3D7 e W2 de toda a série sintetizada(2,0 e 1,7 µg mL^-1, respectivamente).

Durante a prospecção de novas substâncias bioativas é desejável que os compostos avaliados com potencial ação antimalárica apresentem valores reduzidos de IC₅₀ nos ensaios in vitro. Isso minimiza o risco de falta de especificidade da droga por seu alvo, além de possibilitar a administração de doses menores, reduzindo assim a chance de ocorrerem efeitos adversos.²² Contudo, além do menor valor de IC₅₀, o desenvolvimento de novas drogas antimaláricas deve levar em consideração outros parâmetros além da potência. Atualmente é aceito que compostos com alta potência não resultam necessariamente em fármacos eficazes. Além da potência, fatores tais como a massa molecular e outras propriedades físico-químicas devem ser avaliadas quando administrados por via oral.²³ O atual arsenal terapêutico empregado no tratamento da malária, bem como novas alternativas em teste clínico preconizam a administração por via oral.^24-27 Nesse contexto, a regra dos cinco de Lipinski é uma forma simples de se avaliar a biodisponibilidade oral teórica de um composto.²⁸ Esta regra determina que uma melhor absorção oral está associada a compostos com massa molecular (M.M) <500, coeficiente de partição calculado octanol / água (cLogP) <5, número de átomos doadores de ligação de hidrogênio (HDB) <5 e número de átomos aceptores de ligação de hidrogênio (HAB) <10. Compostos que obedecem a três desses quesitos seguem a regra de Lipinski. Os resultados dessa análise para os compostos sintetizados encontram-se na Tabela 2.

A partir da análise dos dados da Tabela 2 pode-se perceber que os compostos 10 e 11 não seguem a regra de Lipinski, o que pode comprometer a sua permeabilidade e absorção por via oral. O composto 11, em especial, possui o índice de seletividade mais elevado de toda a série (IS=109,3) e o segundo menor valor de IC₅₀.

Comparando-se as propriedades do composto 11, listadas na Tabela 2, com as do análogo 6 da curcumina, que serviu como ponto de partida para as modificações de todos os demais derivados sintéticos dessa série, algumas correlações estruturais preliminares que modulam sua atividade/seletividade podem ser realizadas. Observou-se que em relação ao composto 6 a introdução de grupos substituintes na posição para do anel aromático do composto 10 elevou o valor de IC₅₀. No entanto, houve um incremento no índice de seletividade do derivado sintético 10. A substituição do grupo carbonila do composto 6 por um grupo 2,4-dinitrofenilhidrazona no composto 11 também elevou tanto o valor de IC₅₀ como o índice de seletividade a patamares semelhantes ao do composto 10. A associação em um único análogo da curcumina, o composto 11, de um grupo 2,4-dinitrofenilhidrazona e grupos substituintes na posição para dos anéis aromáticos levou a uma redução significativa no valor de IC₅₀ em relação aos compostos 10 e 12 além de gerar um grande incremento no índice de seletividade. Embora o composto 11 não seja um bom candidato para absorção oral conforme já foi discutido anteriormente, pode-se inferir, ainda que preliminarmente, que substituições no grupo carbonila e a presença de substituintes na posição para do anel aromático são benéficos para atividade antimalárica e seletividade desses análogos. Compostos semelhantes ao derivado 11 da curcumina poderiam ser otimizados posteriormente a fim de melhorar suas propriedades de permeabilidade e absorção por via oral.

CONCLUSÕES

Com a crescente preocupação de se buscar novos compostos com ação antimalárica, moléculas de síntese eficiente e de baixo custo tem sido alvo da quimioterapia antimalárica. A síntese dos derivados de curcumina segue este padrão. Os resultados promissores obtidos nesse trabalho demonstram o potencial dessa classe no desenvolvimento de um novo antimalárico.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o CNPq e FAPEMIG pelo auxílio financeiro durante a execução deste trabalho.

Recebido em 05/09/2013; aceito em 08/11/2013; publicado na web em 03/02/2014

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Maio 2014
• Data do Fascículo
  Jun 2014

Histórico

• Recebido
  05 Set 2013
• Aceito
  08 Nov 2013