Efeito do Soil-borne wheat mosaic virus sobre o metabolismo de cinco genótipos de trigo com diferentes níveis de resistência à doença

Effect of the Soil-borne wheat mosaic virus on the metabolism of five wheat genotypes with different levels of resistance to the disease

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Efeito do Soil-borne wheat mosaic virus sobre o metabolismo de cinco genótipos de trigo com diferentes níveis de resistência à doença^*

Effect of the Soil-borne wheat mosaic virus on the metabolism of five wheat genotypes with different levels of resistance to the disease

Rocheli de Souza^I; Jurema Schons^I; Sandra P. Brammer^II; Ariano M. Prestes^II; Pedro L. Scheeren^II; Fernanda Nicolini-Teixeira^I; Dileta Cecchetti^I; Ariane C. Lanzarini^I

^IFaculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Passo Fundo, BR 285, Km 171, Cx. Postal 611, CEP 99001-970, Passo Fundo, RS, e-mail: [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Trigo, BR 285, Km 174, Cx. Postal 451, CEP 99001-970, Passo Fundo, RS, e-mail: [e-mail]

RESUMO

Com o objetivo de conhecer as alterações metabólicas promovidas pelo Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV), um dos vírus economicamente mais importantes da cultura do trigo (Triticum aestivum), foram analisados os níveis de proteínas solúveis e determinadas as atividades da peroxidase e da protease em quatro cultivares (BRS Guabiju, BRS 194, BRS 179, BR 23) e uma linhagem (PF 980524) de trigo com diferentes níveis de resistência ao vírus. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância, comparando-se as médias, pelo Teste de Duncan a 5%. Os níveis de proteínas solúveis foram mais elevados nas plantas sem sintomas, enquanto que as atividades da peroxidase e da protease foram maiores em plantas com sintoma de mosaico do que em plantas assintomáticas. Além disso, pode-se constatar que quanto maior a suscetibilidade do genótipo, maior o nível de atividade da protease. Estes resultados são promissores para estudos de inibição da protease para controle de viroses.

Palavras-chave adicionais: proteínas solúveis, peroxidase, protease, Furovirus.

ABSTRACT

The objective of this study was to verify the metabolic alterations induced by Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV), one of the most economically harmful viruses infecting wheat (Triticum aestivum) farming. The study analyzed the levels of soluble proteins and determined the activities of peroxidase and protease in four wheat cultivars (BRS Guabiju, BR 23, BRS 179, BRS 194) and one line (PF 980524) with different levels of resistance to the virus. The data obtained were submitted to analysis of variance, and averages were compared by Duncan's Test at 5%. Soluble protein levels were higher in plants without symptoms, while peroxidase and protease activities were higher in plants with mosaic symptoms than in assymptomatic plants. Moreover, it appeared that genotypes with high susceptibility to SBWMV have high protease activity. These results could help in the design of future studies aimed at controlling the virus through inhibition of protease.

Additional keywords: soluble proteins, peroxidase, protease, Furovirus.

INTRODUÇÃO

O trigo (Triticum aestivum L.) cultivado no estado do Rio Grande do Sul (Brasil) está sujeito ao ataque de diversas doenças, entre as quais se destacam a podridão da semente, podridão radicular, mal-do-pé, oídio, ferrugens, helmintosporioses, septorioses e as causadas por vírus, como o Barley yellow dwarf virus (BYDV) e o Soil-borne wheat mosaic virus (SBWMV), gênero Furovirus. O SBWMV se destaca como o agente causal de uma das mais importantes viroses da cultura do trigo no Brasil. O SBWMV é naturalmente transmitido através de zoósporos do fungo Polymyxa graminis Led, (Caetano et al., 1971). Ocorre, principalmente, no planalto do Rio Grande do Sul e no Sul do Paraná, causando danos elevados no rendimento de grãos. Lavouras inteiras podem estar infetadas embora a ocorrência em reboleiras e/ou em linhas seja mais comum (Reis et al., 1997).

A virose causada pelo SBWMV foi primeiramente observada em poucas plantas no município de Erval, no Rio Grande do Sul, em 1968 e, posteriormente, foi constatada em outros locais do estado. Em 1971, a expansão da doença já era alarmante, mostrada em levantamento realizado nas nove regiões tritícolas do Estado, constatando-se sua ocorrência em 25 municípios (Prestes et al., 1972 apud Caetano, 1982).

Em trigo, os sintomas induzidos pelo SBWMV variam do mosaico verde ao amarelo, ocorrendo mais facilmente em plantas cultivadas em áreas mais baixas e, conseqüentemente, mais úmidas. Dessa forma, em função do amarelecimento em reboleiras, as áreas infetadas são reconhecidas de uma certa distância, especialmente durante extensos períodos de frio e alta umidade, mas os sintomas tornam-se pouco visíveis quando ocorre a maturação das plantas ou quando há aumento da temperatura (Nyzaka et al., 1979).

Os principais distúrbios causados por vírus na célula do hospedeiro podem ser atribuídos às modificações da síntese protéica e, também, da atividade enzimática, especialmente da peroxidase (Abu-Jawdah & Kummert, 1983).

O presente trabalho teve como objetivo verificar alterações no metabolismo de plantas de cinco genótipos de trigo, infetadas com o SBWMV, através das determinações dos níveis de proteínas solúveis e das atividades da peroxidase e protease.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal e local de execução

Foram utilizados cinco genótipos de trigo, com diferentes níveis de resistência ao SBWMV, sendo: BRS Guabiju - moderadamente resistente; BRS 194 - resistente; BRS 179 - moderadamente suscetível; BR 23 - suscetível; PF 980524 - altamente suscetível (Indicações Técnicas da Comissão Sul-Brasileira de Pesquisa de Trigo, 2003).

Amostras dos cinco genótipos de trigo foram coletadas em experimento conduzido na área experimental da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa Trigo, e as análises foram realizadas no Laboratório de Virologia Vegetal da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Passo Fundo.

Delineamento experimental

O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso com três blocos. Cada parcela constituiu-se de cinco linhas de 5 m de comprimento, e com espaçamento de 0,2 m entre as linhas.

Na semeadura foram distribuídas 330 sementes viáveis/m² e a adubação foi efetuada com 450 kg/ha da fórmula NPK 5:25:25. A adubação de cobertura constou de 45 kg/ha de N, na forma de uréia. Os tratamentos fitossanitários foram realizados de acordo com o recomendado para a cultura de trigo. Em cada parecela, 45 dias após a emergância das plantas, foram coletadas aleatóriamente cinco plantas com sintomas e cinco sem sintomas da virose. A identificação das plantas sintomáticas foi feita visualmente, tendo em vista que os anti-soros testados por Elisa não apresentaram resultados satisfatórios. Considerou-se infetadas com o SBWMV as plantas com sintomas característicos de mosaico, aliado a presença de espóros de resistência do P. graminis nas raízes. Também das plantas assintomáticas confirmou-se a ausência do vetor no sistema radicular.

Determinação da atividade da peroxidase

Para a determinação da atividade da peroxidase foi utilizado o método descrito por Schons (1997).

O extrato enzimático foi obtido triturando-se 400 mg de tecido foliar fresco em 4 ml de tampão Fosfato de potássio 0,2 M pH 6,7 (gelado), seguido de centrifugação por 5 min a 5600 g a 4 ºC.

O sistema de reação continha 0,1 ml do sobrenadante do extrato enzimático, 0,9 ml de tampão, 0,5 ml de solução de peróxido de hidrogênio a 30% e 0,5 ml de solução de diclorofenol e aminoantipirina (163 mg de diclorofenol + 81,3 mg de aminoantipirina em 100 ml de água destilada). Os tubos de ensaio, contendo o sistema de reação, foram mantidos em banho-maria a 30 ºC por 5 min; a reação foi interrompida pela adição de 2 ml de álcool etílico. A leitura de absorbância foi realizada imediatamente em espectrofotômetro a 505 nm. A atividade da peroxidase foi expressa em mM de H₂O₂ decomposto/min.mg de proteína.

Determinação da quantidade de proteínas solúveis

A quantidade de proteínas solúveis foi analisada no extrato enzimático, descrito no item anterior, de acordo com o método de Bradford (1976).

O meio de reação continha 0,1 ml de extrato enzimático e 5 ml do reativo de Bradford. Após repouso de 5 min, realizaram-se as leituras de absorbância, em espectrofotômetro a 595 nm, as quais foram comparadas com a curva padrão de caseína. Os resultados foram expressos em mg de proteínas/g de matéria fresca (MF).

Determinação da atividade da protease

A atividade da protease foi analisada usando caseína como substrato, de acordo com o método descrito por Pai & Gaur (1981).

Triturou-se em almofariz gelado contendo areia previamente lavada, autoclavada e seca, 500 mg de tecido foliar em 10 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M, pH 6,0. Centrifugou-se a 10.000 g, durante 30 min, a 4 ºC, e utilizou-se o sobrenadante para determinar a atividade da enzima.

O meio de reação continha: 1 ml de extrato enzimático, 2 ml de solução de caseína a 0,5% pH 6,0 e 3 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 6,0. O sistema de reação foi incubado a 40 ºC, em banho-maria, por 2 h. Após esse período, foram adicionados 2 ml de ácido tricloroacético a 15%, gelado.

A mistura foi resfriada em banho de gelo, para completa precipitação da proteína, e centrifugada a 5.000 g por 20 min. Alíquotas do sobrenadante foram utilizadas para reação colorimétrica com o reagente Folin-Ciocalteau. As leituras de absorbância foram realizadas em espectrofotômetro a 660 nm e comparadas com a curva padrão de tirosina. A atividade da protease foi expressa em mM de tirosina . mg de proteína/min.

Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise de variância e as diferenças entre as médias comparadas pelo teste de Duncan a 5%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo como os dados da atividade específica da peroxidase referentes à infecção com o SBWMV (Tabela 1), pode-se observar que os cinco genótipos de trigo mantiveram a mesma tendência, ou seja, a atividade da peroxidase aumentou em função do aparecimento do sintoma da doença. As cultivares BRS 179, BR 23 e a linhagem PF 980524 apresentaram maior atividade da enzima, fato este que pareceu estar associado aos níveis de resistência das plantas ao SBWMV. Estes resultados corroboram o observado por Milicevic (1988), que relacionou a atividade da enzima ao grau de resistência de plantas de beterraba (Beta vulgaris L.) ao Broccoli necrotic yellow virus (BNYV), gênero Cytorhabdovirus. A atividade da peroxidase apresenta-se como um possível indicador bioquímico de resistência a diversas viroses, podendo ser utilizada em programas de melhoramento genético de plantas.

De acordo com Nicolini (2002), plantas de aveia (Avena sativa L.), infetadas com o BYDV, apresentaram a atividade da enzima maior quando comparadas às plantas sadias. Assim, vários autores relataram o aumento na atividade da peroxidase em plantas infetadas por vírus, sugerindo a utilização desta enzima como indicadora deste tipo de estresse (Andreeva, 1989).

Diferenças significativas nos teores de proteínas solúveis foram observadas quando comparou-se plantas sem e com sintomas de mosaico (Tabela 2). De um modo geral as plantas sem sintomas apresentaram níveis maiores de proteínas quando comparadas às com sintomas. Os resultados demonstraram que a virose reduziu os níveis de proteínas em todas as cultivares. Enquanto que Leal & Lastra (1984) observaram o mesmo efeito em plantas de tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) infetadas com Tomato yellow mosaic virus, Schons et al. (1995) obtiveram resultados diferentes quando utilizaram plantas de melancia [Citrullus lanatus (Thumb.) Matsumy & Nakai] infetada com o Papaya ringspot virus type W. Esta diferença nos resultados, provavelmente, é devida ao tipo de relação que cada vírus tem com as plantas hospedeiras. Do mesmo modo, quando folhas de Nicotiana tabacum L. são inoculadas com o Tobacco mosaic virus, surgem lesões locais e os níveis de proteínas aparecem aumentados (Van Loon, 1970).

Os dados referentes à atividade da protease em folhas de trigo com e sem sintomas de mosaico estão apresentados na Tabela 3. Os resultados evidenciaram diferenças significativas na comparação de plantas sem e com sintomas, observando-se uma tendência de aumento na atividade enzimática nas plantas com sintomas. As maiores atividades da protease foram observadas na cultivar BR 23 e na linhagem PF 980524, devido, talvez, à maior suscetibilidade destes genótipos ao SBWMV. Destaca-se que quanto mais suscetível é o genótipo ao vírus, maior a atividade da protease, podendo sua determinação ser utilizada na detecção de suscetibilidade ao vírus.

Conforme Estelle (2001), pouco se conhece sobre os mecanismos regulatórios e a identidade das proteases vegetais. Sabe-se, porém, que o período de atividade da maior parte das proteínas é significativamente mais curto do que o tempo de vida dos organismos que a produzem. Este fato é de extrema importância, pois assim as plantas conseguem, através da proteólise, controlar aspectos da regulação como fotomorfogênese, ciclo celular, fotossíntese, morte celular programada e respostas de defesa.

Pesquisas sobre o mecanismo de resposta da planta ao vírus têm revelado a indução de um grupo de proteínas relacionada à patogênese, entre as quais destaca-se uma única proteína endoproteolítica ativa, ou seja, uma protease (Vera & Conejero, 1988).

Resultados referentes à atividade da protease, quando comparadas às plantas de tomateiro sadias e infetadas com o Tomato mosaic virus (ToMV), gênero Tobamovirus, demonstraram que a expressão desta enzima foi maior nas plantas com sintomas da virose (Wojahn 2003). No presente estudo, as plantas com sintomas também apresentaram maior atividade da protease em relação às sem sintomas.

Aceito para publicação em 06/06/2005

Autor para correspondência: Jurema Schons

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Parte da dissertação de Mestrado do primeiro autor, Agronomia Área de Fitopatologia, Universidade de Passo Fundo (2004). Bolsista capes

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Out 2005
• Data do Fascículo
  Ago 2005

Histórico

• Recebido
  06 Jun 2005