Potencial de Bacillus spp. em promover o crescimento e controlar Fusarium verticillioides em milho

Potential of Bacillus spp. for growth promotion and Fusarium verticillioides control in corn

RESUMO

O tratamento de sementes com microrganismos visando promoção de crescimento e controle de Fusarium verticillioides é uma tecnologia que poderá ser utilizada para ampliar a sustentabilidade da cultura do milho. Para tanto, estudos com a utilização de microrganismos para tratamento de sementes visando ao controle de F. verticillioides e promoção de crescimento vegetal em milho são necessários para o desenvolvimento de bioprodutos. Onze isolados de Bacillus spp. foram testados quanto às características bioquímicas relacionadas com promoção de crescimento (produção de ácido cianídrico, ácido indolacético, sideroforos e catalase; solubilização de fosfato e assimilação de nitrogênio). Ainda in vitro foi avaliada a habilidade dos isolados de Bacillus em inibir o crescimento micelial e a germinação de conídios de F. verticillioides. Em casa de vegetação foi avaliado o efeito dos isolados de Bacillus spp. na promoção de crescimento e no controle de F. verticillioides em duas variedades de milho. Bacillus velezensis AP-03 e Bacillus sp. AP-210, não somente inibiram o crescimento micelial e a germinação de esporos, mas também promoveram o crescimento das plantas e controlaram F. verticillioides em sementes de milho em condições de casa de vegetação.

Palavras-chave
Zea mays ; biocontrole; tratamento de sementes

ABSTRACT

Seed treatment with microorganisms aiming to promote plant growth and Fusarium verticillioides control is a technology that can be used to improve the sustainability of corn crops. Therefore, studying the use of microorganisms for seed treatment with the aim of controlling F. verticillioides and promoting plant growth in corn is necessary for the development of bioproducts. Eleven isolates of Bacillus spp. were tested for their biochemical characteristics related to growth promotion (production of hydrocyanic acid, indoleacetic acid, siderophores and catalase; phosphate solubilization, and nitrogen assimilation). Also in vitro, the ability of Bacillus isolates to inhibit F. verticillioides mycelial growth and conidial germination was assessed. In a greenhouse, the effect of the isolates of Bacillus spp. was evaluated on growth promotion and F. verticillioides control in two varieties of corn. Bacillus velezensis AP-03 and Bacillus sp. AP-210 not only inhibited mycelial growth and spore germination, but also promoted plant growth and controlled F. verticillioides in corn seeds under greenhouse conditions.

Keywords
Zea mays ; biocontrol; seed treatment

O Brasil é o segundo maior produtor mundial de milho (Zea mays L.) com produção estimada para a safra 2019/2020 de cerca de 100 milhões de toneladas de grãos, em uma área de, aproximadamente, 18 milhões de hectares (⁹). A produção de milho no mundo é prejudicada pela ação de fungos fitopatogênicos, como os do gênero Fusarium, com ênfase para Fusarium verticillioides (FV) (Sacc.) Nirenberg (1976) [sinonímia: Fusarium moniliforme J. Sheld. (1904)], importante fitopatógeno habitante de solo para a cultura (¹⁴, ¹⁵, ²³, ²⁵, ²⁶). Fusarium verticillioides pode diminuir o estande (¹⁴, ²³, ²⁵), causar podridões de raízes e colo (¹⁴, ²⁵), também causar problemas nos homens e animais que consumirem grãos infectados devido à produção de micotoxinas, como as fumonisinas (²⁰, ³⁰). O patógeno pode ser transmitido horizontalmente e verticalmente (¹⁴, ²⁵), além de atacar outras gramíneas, como sorgo e milheto (²⁵). Outra característica importante é a produção de clamidósporo que permite sua sobrevivência por longos períodos no solo (²³, ²⁶).

Para o controle deste patógeno é utilizado o tratamento de sementes de milho com fungicidas (²⁵). Entretanto, na busca de maior sustentabilidade, técnicas têm sido pesquisadas para a realização do controle deste patógeno em sementes de milho (²³, ²⁶). Essas técnicas são necessárias no cenário atual do desenvolvimento tecnológico da produção de milho, por conta da sua importância mundial como cereal para a alimentação humana, direta ou indireta (²³). Dentre as tecnologias alternativas, o tratamento de sementes com agentes microbianos pode ser adequada para o controle de F. verticillioides (²³, ²⁶). Os agentes de biocontrole podem também promover o crescimento das plantas (¹, ¹⁸, ²², ²³, ²⁶). Dentre os organismos estudados, os do gênero Bacillus, por suas características, são os que estão recebendo maior atenção na atualidade (⁴, ⁸, ¹¹, ¹², ¹⁸, ²⁰, ²³, ²⁶).

Hussain et al. (¹⁸), Lin et al. (²²), Lizárraga-Sánchez et al. (²³) e Nguyen et al. (²⁶) descreveram que Bacillus spp., aplicados via tratamento de sementes de milho ou no solo, propiciaram maior aproveitamento de nutrientes do solo e aumentaram a biomassa das plantas, por meio da produção de substâncias que inibem a ação de patógenos da cultura. Lizágarra-Sánchez et al. (²³) observaram que Bacillus sp. B25 promoveu o crescimento de plantas de milho em 30%. Lin et al (²²) observaram que B. subtilis IN-937a, B. safenis SE-52, B. altitudinis INR-7, Lysinibacillus xylanilytics SE-56 e Paenibacillus peoriae E-681 promoveram acréscimo de 30% da produção de biomassa em plântulas de milho com a utilização de metade da adubação nitrogenada recomendada para a cultura. Hussein et al. (¹⁸) observaram que Bacillus sp. AZ6, formulado com óxido de zinco e cascas de laranja, promoveu o crescimento de milho em 25%.

O potencial de Bacillus no biocontrole de fitopatógenos na cultura do milho foi demonstrado por diversos autores (⁸, ¹⁹, ²¹, ²³, ²⁶, ³²). Kulimushi et al. (¹⁹) observaram que Bacillus amyloliquefaciens promoveu o aumento de enzimas de defesa nas plantas contra Rhizomucor variabilis, e o crescimento de plântulas de milho e a ação do referido patógeno foi diminuída em cerca de 50%. Lizágarra-Sánchez et al. (²³) observaram que Bacillus sp. B25 controlou a produção de micotoxinas e a incidência de F. verticillioides entre 93 e 25%, respectivamente. Li et al. (²¹) verificaram que Bacillus vallismortis BV23 inibiu, in vitro, o crescimento micelial, a germinação e a produção de conídios de F. graminearum em 66%, 90% e 86%, respectivamente. Wang et al (³²) verificaram que B. velezensis BM21 controlou F. graminearum em plântulas de milho.

Assim, o objetivo deste trabalho foi selecionar isolados de Bacillus spp. com potencial de serem utilizados para tratamento de sementes, com a finalidade de controlar F. verticillioides e promover o crescimento de plântulas de milho.

MATERIAL E MÉTODOS

Os ensaios foram realizados no Laboratório de Microbiologia Ambiental “Raquel Ghini” e na casa-de-vegetação da Embrapa Meio Ambiente, Jaguariúna, SP. Nos ensaios in vivo foi utilizado um Latossolo Vermelho Amarelo com as seguintes características (0–20 cm): pH em água=5,8; MO=25,5 g kg⁻¹; P=3,5 mg cm⁻³; K=1,51, Ca=27,5, Mg=8,5, Al=1, H=35; CE=73,5 mmol dm⁻³; SB%=50,8 e argila=450 (g kg⁻¹).

Organismos

Os isolados utilizados no estudo foram: Bacillus velezensis AP-03; Bacillus siamensis AP-117 e Bacillus sp. isolados AP-12, AP-61, AP-85, AP-88, AP-115, AP-165, AP-210, AP-240 e AP-512 (³). Os isolados foram reativados em meio Batata-Dextrose-Ágar (BDA) (Himedia^©) a 28 ± 2ºC, por 48 h no escuro. Também foi utilizado o biofungicida Serenade^® (Bayer^©, México) à base de Bacillus subtilis QST 713. O isolado de Fusarium verticillioides F405, cedido pela Embrapa Milho e Sorgo (²⁰), foi multiplicado em BDA a 25 ± 2 ^oC, no escuro, por oito dias. Para obter a suspensão de conídios de F. verticillioides F405, 5 mL de água foram colocados sobre o micélio previamente crescido (sete dias, 25 ± 2ºC e fotoperíodo de 12 h), em seguida a superfície foi raspada com alça de Drigalski e a suspensão calibrada para 10⁶ conídios mL^-1. A patogenicidade do isolado foi avaliada em milho comum AL Bandeirante e milho pipoca IAC 367, de acordo com metodologia proposta por Machado et al. (²⁵). Os ensaios com plantas de milho foram realizados com as variedades de milho comum AL Bandeirante e de milho pipoca IAC 367.

Caracterização dos isolados de Bacillus quanto à produção de compostos promotores de crescimento das plantas

Os isolados de Bacillus foram previamente crescidos em Tripticaseina-Soja-Ágar (TSA) 45 g/1000 mL de água (Himedia^©) a 25 ± 2ºC, por cinco dias no escuro. Todos os isolados foram analisados quanto à produção de ácido cianídrico e ácido indolacético (⁷), sideróforos (²⁹) e catalase (⁶), solubilização de fosfato (⁷) e assimilação de nitrogênio (¹⁰). Os resultados obtidos foram considerados como positivos (+) ou negativos (-) para as características analisadas, mas não foi quantificada a produção.

Inibição do crescimento micelial e da germinação de conídios de F. verticillioides por Bacillus

A inibição do crescimento micelial de F. verticillioides F405 pelos isolados de Bacillus foi avaliada em placas de Petri plásticas contendo BDA. Discos de 0,5 cm de diâmetro (colônias crescidas em BDA) de Fusarium e de cada um dos isolados de Bacillus foram transferidos para placas de Petri (9 cm de diâmetro) com BDA, a 7 cm de distância cada, e incubados em sala climatizada (oito dias, no escuro e a 25 ± 2 ºC) (²¹, ²³). A cada 48 h foi mensurado o crescimento micelial de F. verticillioides, e, após oito dias, foi calculada a taxa de crescimento e crescimento total. Também foi avaliado o potencial dos isolados de Bacillus em inibir a germinação de conídios de F. verticillioides F405. Em microtúbulos de 3 mL foi transferida uma suspensão de conídios de F. verticillioides (obtida conforme descrito anteriormente, na concentração de 2,0 x 10⁶ conídios mL^-1) e misturada, na proporção de 1:1, com suspensão de isolados de Bacillus (cultivados em Tryptic Soy Broth a 28 ± 2ºC por 48 h, no escuro, em agitação constante de 150 rpm, na concentração de OD₅₅₀ = 0,1, correspondente a 10⁸ UFC mL^-1). Após incubação por 48 h, a 25 ºC e fotoperíodo com 12 h de luz foram avaliadas a germinação de 100 conídios de cada repetição. Para cada isolado de Bacillus foram utilizadas três repetições.

Promoção de crescimento de milho por Bacillus spp.

Isolados de Bacillus spp. foram multiplicados em meio contendo 10 g de glicose; 10 g de peptona; 5 g de extrato de levedura; 3 g de NaCl; 1 g de KH₂PO₄; 0,5 g de MgSO₄ 7H₂O; 100 mL de água destilada e pH 6,0 a 28 ± 2ºC, por 48 h, no escuro e em agitação constante de 150 rpm. Após este período foram calibradas suspensões de cada isolado com o uso de espectrofotômetro (OD₅₅₀ = 0,1, correspondente a 10⁸ UFC mL^-1). As sementes das variedades AL Bandeirantes e milho pipoca IAC-367 foram imersas por uma hora nas suspensões, mantendo agitação constante das sementes. Como controle, sementes foram imersas em água nas condições descritas acima. As sementes tratadas foram semeadas em vasos plásticos contendo 500 mL de solo, sendo utilizadas 10 sementes por vaso. O ensaio foi conduzido em casa-de-vegetação por oito dias após a semeadura. Diariamente foram contadas as plântulas emergidas para a determinação do índice de velocidade de emergência (IVE) (²⁴). No final do ensaio foram avaliados o índice SPAD de clorofilas (SPAD-502 Plus – Minolta©) das folhas (¹¹, ¹²), a altura das plantas, o comprimento da raiz, o diâmetro do colo e massa fresca e seca (secagem por 72 h à 60 ºC) da parte aérea e do sistema radicular (²²).

Efeito dos isolados de Bacillus spp. no controle de F. verticillioides

Para a realização destes estudos foram selecionados isolados de Bacillus considerando os resultados de produção de ácido cianídrico, ácido indolacético, sideróforos e catalase, solubilização de fosfato e assimilação de nitrogênio e inibição do crescimento micelial e germinação de conídios de F. verticillioides F405. Além disto, foram considerados os resultados obtidos por Dorighello et al. (¹¹, ¹²) em testes contra outros patógenos.

Para obtenção de sementes de milho infestadas com F. verticillioides F405, o patógeno foi inoculado nas sementes pelo método de condicionamento osmótico (²⁵). Discos de micélio de F. verticillioides foram transferidos para placas de Petri contendo BDA + Manitol (73,5 g/L) e incubados por 120 h, a 25 ± 2 ºC e 12 h de luz. Após este período, sementes de milho foram colocadas sobre a colônia de F. verticillioides F405 formando uma camada única e mantidas nas mesmas condições anteriores por 48 h. As sementes inoculadas foram misturadas na proporção de 2:8 com sementes não inoculadas e esta mistura foi utilizada para a realização dos estudos (²⁵).

O tratamento das sementes inoculadas com F. verticillioides F405 com os isolados de Bacillus foi realizado de acordo com metodologia proposta por Machado et al. (²⁵). Os seguintes tratamentos das sementes foram avaliados: 1) controle inoculado (água destilada); 2) Carboxina (200 g L^-1) + Thiram (200 g L^-1) (Vitavax-Thiram^®, SC - Chemtura^©); 3) B. subtilis QST-713 10⁸ UFC mL^-1); 4) B. velezensis AP-03 e 5) Bacillus sp. AP-210 (10⁸ UFC mL^-1). Um tratamento com sementes não inoculadas (testemunha não inoculada) foi incluído. As sementes tratadas foram divididas em três lotes para a realização dos estudos.

As sementes foram semeadas em vasos contendo 500 mL de solo, conforme descrito anteriormente. Além de avaliar o IVE, teor de clorofila (¹¹, ¹²), altura das plantas e comprimento das raízes (cm), diâmetro do colo (mm) e massas frescas e secas da parte aérea e do sistema radicular (g/planta) (²²), foi avaliada a incidência de F. verticillioides nas plântulas (²⁵). Dez vasos foram semeados, sendo cinco utilizados para as avaliações de promoção de crescimento e cinco para determinação dos pigmentos fotossintetizantes, das atividades enzimáticas e da incidência da doença nas plântulas. Para avaliar a incidência de F. verticillioides nas plântulas foram recortados fragmentos, na altura do colo, de 0,5 cm e transferidos para BDA e incubados a 25 ºC por sete dias no escuro, quando foi determinada a porcentagem de fragmentos infectados com o patógeno (²⁵). As outras partes das plântulas foram utilizadas na determinação dos pigmentos fotossintetizantes e das atividades enzimáticas.

Para a análise de pigmentos fotossintetizantes as terceiras folhas das plântulas, após oito dias da semeadura, foram coletadas e formaram uma amostra composta para cada repetição para analisar clorofilas a, b, a + b, carotenoides e clorofila a + b/carotenoides (³¹). O restante das plântulas foi coletado para realizar análises das proteínas totais (PT) e atividades das enzimas fenilalanina amônia-liase (FAL), peroxidase (PO) e polifenoloxidade (PPO). Amostras compostas de cada repetição, foram acondicionadas em envelopes de papel alumínio, imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em ultra freezer a -80 ºC, para posterior utilização. Em seguida 1 g de tecido vegetal, de cada amostra composta, foi macerado em almofariz com nitrogênio líquido. Após a obtenção de um pó fino e homogêneo foi adicionado 10 mL de solução tampão [C₆H₉NO a 1%, Na₃PO₄·12H₂O 50 mM, pH 6.5 e fluoreto de fenilmetilsulfonila 1 mM (PMSF)] e homogeneizado com o auxílio do pistilo. Estas suspensões foram colocadas em microtubos de plástico com capacidade de 10 mL, centrifugadas (3.000 rpm a 4 ºC, por 25 min), sendo o sobrenadante (extrato bruto) resultante do processo recuperado e armazenado em ultra freezer a -80 ºC (²). A quantificação da atividade das proteínas totais e das enzimas FAL, PPO e PO foi de acordo com Duangmal & Apenten (¹³), Halfeld-Vieira et al. (¹⁶), Hammerschmidt et al. (¹⁷) e Pascholati et al. (²⁷).

As avaliações da germinação, envelhecimento acelerado e sanidade das sementes foram realizadas de acordo com as metodologias descritas em Brasil (⁵). Para os ensaios de avaliação da germinação e do envelhecimento acelerado foram utilizadas oito repetições com 50 sementes e para o teste de sanidade 25 sementes para cada repetição (²⁵).

Análise estatística

Os ensaios de qualidade de sementes e biocontrole foram realizados em delineamento inteiramente casualizado com três repetições para os estudos de controle, quatro para as análises de sementes e oito para sanidade de sementes. As análises de pigmentos fotossintetizantes, atividades enzimáticas e sanidade das sementes foram realizadas obedecendo ao delineamento dos ensaios em vasos. Nos ensaios em vasos foram utilizados o delineamento em blocos ao acaso, com cinco repetições cada. As médias obtidas foram analisadas por meio da ANOVA e comparadas pelo teste Tukey (p<0,05) no programa estatístico R e as Figuras foram elaboradas no programa Sigma Plot.

RESULTADOS

Caracterização dos isolados de Bacillus quanto à produção de compostos promotores de crescimento das plantas

Os isolados AP-12 e AP-165 apresentaram quatro resultados positivos para a produção de compostos relacionados com promoção de crescimento (assimilação de nitrogênio, solubilização de fosfato, produção de sideróforos e ácido cianídrico). Por outro lado, os isolados AP-03, AP-85, AP-88, AP-117 e AP-210 apresentaram três resultados positivos, com destaque para a assimilação de nitrogênio para todos os isolados (Tabela 1). Os isolados AP-61, AP-240 e AP-512 apresentaram dois resultados positivos, o isolado AP-115 apenas foi positivo para assimilação de nitrogênio e o isolado AP-161 foi negativo para todas as características analisadas (Tabela 1). Os resultados não apresentaram uniformidade com respeito às características que foram positivas (Tabela 1).

Tabela 1
Caracterização bioquímica de isolados de Bacillus spp. quanto à produção de metabólitos promotores de crescimento (ácido indolacético - AIA, ácido cianídrico - HCN, sideróforos - SID e catalase - CAT), assimilação de nitrogênio (AN) e solubilização de fosfato (SP). Os resultados estão descritos como positivos (+) ou negativos (-).

ISOLADO	AN	SP	AIA	HCN	SID	CAT
Bacillus sp. AP-12	+	+	-	+	+	-
Bacillus sp. AP-165	+	+	-	+	+	-
B. velezensis AP-03	+	-	-	-	+	+
Bacillus sp. AP-85	+	+	-	-	-	+
Bacillus sp. AP-88	+	+	-	-	-	+
B. siamensis AP-117	+	+	-	-	-	+
Bacillus sp. AP-210	+	-	+	-	+	-
Bacillus sp. AP-61	-	-	+	-	+	-
Bacillus sp. AP-240	+	-	+	-	-	-
Bacillus sp. AP-512	+	+	-	-	-	-
Bacillus sp. AP-115	+	-	-	-	-	-
Bacillus sp. AP-161	-	-	-	-	-	-

Inibição do crescimento micelial e da germinação de conídios de F. verticillioides

Bacillus velezensis AP-03 reduziu o crescimento micelial e a germinação de conídios de F. verticillioides em 62,1% e 57,5%, respectivamente, com taxa de crescimento micelial de 1,4 cm/dia (Tabela 2). O isolado Bacillus AP-512 inibiu o crescimento micelial e a germinação de conídios em 66,0% e 52,2%, respectivamente, com taxa de crescimento de 1 cm/dia. O isolado de Bacillus AP-210 inibiu a germinação em 56,2% e apresentou uma taxa de crescimento de 1,5 cm/dia (Tabela 2).

Tabela 2
Efeito de Bacillus spp. na porcentagem de inibição do crescimento micelial (%) e da germinação de conídios (%) e taxa de crescimento micelial de Fusarium verticillioides.

Isolados	Inibição do crescimento micelial	Taxa de crescimento micelial	Inibição da germinação de conídios
p	0,0043	0,0004	<0,0001
CV (%)	7,18	9,37	7,38
B. velezensis AP-03	62,1ab	1,4ab	57,5e
Bacillus sp. AP-12	23,9a	2,5bc	38,4cd
Bacillus sp. AP-61	24,5a	2,6c	35.8bcd
Bacillus sp. AP-85	23,2a	2,4bc	53,1e
Bacillus sp. AP-88	34,8ab	2,1ab	41,1d
Bacillus sp. AP-115	26,7a	2,4bc	34,0abcd
B. siamensis AP-117	43,3ab	1,9ab	27,8ab
Bacillus sp. AP-161	46,3ab	1,7ab	29,6abc
Bacillus sp. AP-165	30,1ab	2,6bc*	25,2a
Bacillus sp. AP-210	38,4ab	1,5ab	56,2e
Bacillus sp. AP-240	22,9a	2,5bc	41,5d
Bacillus sp. AP-512	66,0b	1,0a	52,2e

• ¹ Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si (Tukey 5%).

Promoção de crescimento de milho por Bacillus spp.

Para o ensaio com milho AL Bandeirantes não foram observados efeitos do tratamento das sementes com Bacillus no estante final das plantas, nos índices SPAD de clorofila, velocidade de emergência e no diâmetro do colo (Tabela 3). Contudo, foram observados efeitos significativos na altura, comprimento do sistema radicular e massas secas da parte aérea e do sistema radicular (p < 0,05) (Tabela 3).

Tabela 3
Efeito do tratamento de sementes de milho AL Bandeirantes com Bacillus spp. no estande final de plantas (EF), clorofila total (CLO), índice de velocidade de emergência (IVE), diâmetro do colo (DC), comprimento do sistema radicular (CR), altura das plantas (AL) e massas secas do sistema radicular (MSR) e da parte aérea (MSA).

	VARIÁVEIS1
Isolado	EF2 (%)	CLO2	IVE2	DC2 (mm)	CR (cm)	AL (cm)	MSR (g/planta)	MSA (g/planta)
p	0,7249	0,4870	0,1345	0,275	<0,0001	0,0059	<0,0001	<0,0001
CV (%)	8,13	5,85	12,74	11,74	4,99	10,99	8,64	9,82
Controle	95,0	30,0	9,4	2,5	25,1b	16,1b	0,24a	0,08b
B. velezensis AP-03	100,0	29,0	9,4	2,3	26,6b	17,8b	0,23a	0,09b
Bacillus sp. AP-12	90,0	29,5	9,4	2,5	26,3b	18,3b	0,28b	0,08b
Bacillus sp. AP-61	92,5	29,3	8,6	2,4	26,6b	18,7b	0,29b	0,10c
Bacillus sp. AP-85	97,5	29,2	9,9	2,4	26,0b	18,3b	0,30b	0,09b
Bacillus sp. AP-88	97,5	29,8	9,8	2,4	26,6b	18,5b	0,29b	0,10c
Bacillus sp. AP-115	92,5	28,0	9,0	2,2	26,3b	18,3b	0,25a	0,12d
B. siamensis AP-117	90,0	29,2	9,1	2,3	26,4b	18,6b	0,30b	0,08b
Bacillus sp. AP-161	97,5	29,7	9,8	1,9	22,5a	17,5b	0,28b	0,08b
Bacillus sp. AP-165	90,0	30,1	8,2	2,2	26,2b	17,2b	0,26a	0,09b
Bacillus sp. AP-210	95,0	30,3	9,3	2,3	26,3b	17,7b	0,31b	0,08b
Bacillus sp. AP-240	95,0	30,0	8,4	2,1	25,8b	17,4b	0,23a	0,07a
Bacillus sp. AP-512	95,0	27,3	7,4	2,3	20,9a	12,5a	0,22a	0,06a

• ¹
  Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si (Tukey 5%). CLO – índice SPAD de clorofila.
• ²
  NS: Não significativo (F 5%).

Para o ensaio com milho pipoca IAC 367 foram observados efeitos significativos para os índices SPAD de clorofila e velocidade de emergência; altura, massa seca da parte aérea e comprimento radicular (p < 0,05) (Tabela 4). Como não foram observadas diferenças expressivas entre os isolados na promoção de crescimento, o teste não permitiu selecionar os melhores isolados. Desta forma, B. velezensis AP-03 e Bacillus spp. AP-210, por apresentarem 100% de estante final, para as duas variedades de milho, foram selecionados para serem testados no controle de F. verticillioides (Tabelas 3 e 4).

Tabela 4
Efeito do tratamento de sementes de milho pipoca IAC 367com Bacillus spp. no estande final de plantas (EF), clorofila total [índice SPAD de clorofila] (CLO), índice de velocidade de emergência (IVE), diâmetro do colo (DC), comprimento do sistema radicular (CR), altura das plantas (AL) e massas secas do sistema radicular (MSR) e da parte aérea (MSA).

	VARIÁVEIS1
Isolado	EF2 (%)	CLO	IVE	DC2 (mm)	CR (cm)	AL (cm)	MSR2(g/planta)	MSA (g/planta)
p	0,4207	0,0165	0,00234	0,5681	<0,0001	0,0096	0,2236	0,0137
CV (%)	9,03	5,75	7,73	11,45	4,62	12,059	17,27	17,05
Controle	97,0	30,7ab	8,0ab	1,7	27,2bcde	19,8ab	0,09	0,04a
B. velezensis AP-03	90,0	31,6b	7,5ab	1,6	25,3ab	22,1ab	0,07	0,05ab
Bacillus sp. AP-12	97,5	31,4b	8,2b	1,6	30,6f	21,2ab	0,07	0,05ab
Bacillus sp. AP-61	95,0	30,4ab	7,7ab	1,6	29,9def	21,1ab	0,07	0,05ab
Bacillus sp. AP-85	92,5	33,2b	8,6b	1,6	29,2def	21,5ab	0,09	0,06ab
Bacillus sp. AP-88	95,0	30,1ab	8,4b	1,6	28,7cdef	18,9a	0,06	0,05ab
Bacillus sp. AP-115	100,0	30,0ab	7,7ab	1,6	29,5def	21,5ab	0,06	0,05ab
B. siamensis AP-117	95,0	30,6ab	7,8ab	1,6	25,3ab	20,9ab	0,07	0,05ab
Bacillus sp. AP-161	97,5	31,2ab	7,7ab	1,5	27,1bcd	20,9ab	0,06	0,04ab
Bacillus sp. AP-165	90,0	31,1ab	7,7ab	1,5	24,1ab	25,2b	0,08	0,05ab
Bacillus sp. AP-210	100,0	30,7ab	8,4b	1,5	26,1bc	21,1ab	0,07	0,05ab
Bacillus sp. AP-240	87,5	29,1ab	7,2ab	1,5	30,3ef	22,1ab	0,07	0,06b
Bacillus sp. AP-512	87,5	26,7a	5,4a	1,5	22,6a	15,9a	0,07	0,04a

• ¹
  Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si (Tukey 5%).
• ²
  NS: Não significativo (F 5%).

Efeito dos isolados de Bacillus spp. no controle de F. verticillioides

A germinação das sementes tratadas com os isolados de Bacillus QST-713, AP-03 e AP-210 foi estatisticamente (p < 0,05) maior do que as testemunhas inoculada e não inoculada com o patógeno (Figura 1A), não diferindo estatisticamente do tratamento com fungicida. Para o envelhecimento acelerado, os três isolados de Bacillus apresentaram germinação superior (p < 0,05) aos tratamentos com fungicidas e das testemunhas. Bacillus velezensis AP-03 apresentou germinação 72,5% acima da testemunha (Figura 1A).

Figura 1
Efeito de Bacillus subtilis QST-713, Bacillus velezensis AP-03 e Bacillus sp. AP-210 no tratamento de sementes de milho AL Bandeirantes inoculadas com Fusarium verticillioides sobre qualidade fisiológica (germinação e envelhecimento acelerado) (A), incidência de Aspergillus, Penicillium e Fusarium verticillioides (B) e pigmentos fotossintetizantes (C). Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si (Tukey 5%).

A mistura de fungicidas (carboxina + Thiram) foi eficiente em reduzir a presença de F. verticillioides e Penicillium nas sementes de milho (Figura 1B). Todos os isolados de Bacillus reduziram a incidência de F. verticillioides nas sementes (Figura 1B), mas foram menos eficientes do que os fungicidas. Os isolados de Bacillus spp. não diminuíram a porcentagem de incidência de Aspergillus spp. e Penicillium spp. nas sementes de milho. Contudo, nenhum tratamento foi eficiente em reduzir a presença de Aspergillus nas sementes (Figura 1B). Além desses fungos, foram detectadas a presença de F. graminearum, Cladosporium sp., Colletotrichum sp. e Rhizopus sp.

A incidência da doença foi estatisticamente reduzida com tratamento de sementes tanto com isolados de Bacillus como com a mistura de fungicidas (p < 0,05) (Tabela 5). Também massa seca da parte aérea e total, diâmetro do colo, altura e comprimento do sistema radicular foram significativamente (p < 0,05) influenciadas pelos tratamentos, com incremento para todas as variáveis. Estande, massa seca do sistema radicular e IVE não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos (Tabela 5). Maior produção de pigmentos (Clorofilas a, b e a/b) foi observada em todos os tratamentos com Bacillus e, também, com fungicidas (p < 0,05) (Figura 1C). Maior produção de carotenoides foi observada nas plantas originadas de sementes infestadas com Fusarium e sem tratamento sanitário (Figura 1C).

Tabela 5
Efeito do tratamento de sementes de milho com Bacillus spp. sobre o estande final de plantas (EF); massa seca do sistema radicular (MSR); massa seca da parte aérea (MSA); massa seca total (MST); diâmetro do colo (DC); altura (A); comprimento do sistema radicular (CR), índice de velocidade de emergência (IVE) e incidência da doença (IN) em plantas de milho AL Bandeirantes provenientes de sementes infestadas com Fusarium verticillioides.

	VARIÁVEIS1
TRATAMENTO	EF2 (%)	MSR2 (g/planta)	MSA (g/planta)	MST (g/planta)	DC (mm)	A (cm)	CR (cm)	IVE2	IN (%)
p value	0,3331	0,1296	0,0397	0,0342	<0,0001	0,0073	<0,0001	0,3116	<0,0001
CV (%)	11,23	13,34	12,03	10,76	6,69	4,24	6,03	11,01	19,31
Controle	88,0	0,318	0,080ab	0,39ab	1,85a	14,08ab	30,46b	4,19	36,6ab
Controle inoculado	76,0	0,272	0,066a	0,33a	1,59a	13,59a	24,47a	3,72	97,1c
Carboxina + Thiram	90,0	0,328	0,082ab	0,40ab	2,13b	14,71ab	32,77b	4,17	25,4a
B. subtilis QST 713	88,0	0,338	0,080ab	0,39ab	2,18bc	14,76ab	31,24b	4,11	41,1ab
B. velezensis AP-03	88,0	0,310	0,088b	0,38ab	2,33bc	15,24b	31,51b	4,21	40,7ab
Bacillus sp. AP-210	90,0	0,350	0,078ab	0,43b	2,44c	14,53ab	30,89b	4,40	54,1b

• ¹
  Médias seguidas de mesma letra nas colunas não diferem entre si (Tukey 5%).
• ²
  NS: Não significativo (F 5%).

Em relação às enzimas estudadas, foram verificadas diferenças significativas entre os tratamentos, para as atividades de FAL (p = 0,0016), de PO (p = 0,004) e de PPO (p = 0,0472). A resposta a FAL foi maior nas plantas tratadas com isolado Bacillus sp. AP-210 (0,0760 µmol ác. cinâmico mg proteína^-1 min^-1), diferente estatisticamente dos demais isolados, e 78% acima da testemunha absoluta (0,0426 µmol ác. cinâmico mg proteína^-1 min^-1). Para PO os isolados B. subtilis QST-713 e B. velezensis AP-03 (2,198 e 2,066 U mg^-1 tecido min^-1, respectivamente), estimularam sua produção, sendo os valores observados superiores aos demais tratamentos, com a testemunha apresentando 1,932 U mg^-1 tecido min^-1. Para PPO somente o isolado B. subtilis QST-713 diferiu do tratamento com fungicida (1,586 e 0,513 U mg^-1 tecido min^-1, respectivamente), sendo que não houve diferença entre os outros tratamentos e a testemunha apresentou valor de 0,860 U mg^-1 tecido min^-1.

DISCUSSÃO

Setenta e cinco por cento dos isolados de Bacillus estudados foram assimiladores de nitrogênio (Tabela 1). Esta função é importante pois o milho é exigente em nitrogênio, requerendo grandes quantidades (em torno de 50 kg ha^-1) para o desenvolvimento (²¹, ²², ²³, ²⁶, ³²). Lin et al. (²²) observaram que Bacillus spp. promoveram o aporte de N necessário para a cultura do milho mesmo com diminuição da adubação nitrogenada em, cerca de, 50%. Estes autores discutem que a característica da assimilação de N, por isolados de Bacillus, deve ser considerada na seleção para utilização na cultura do milho.

Também foram descritos isolados de Bacillus com capacidade de solubilização de fosfatos (41% do total), evidenciadas em cinco diferentes isolados. A disponibilização deste elemento é importante para a agricultura brasileira, pois os solos cultivados tendem a ser deficientes em relação a este elemento, aumentando a necessidade da utilização de adubos fosfatados e encarecendo a produção agrícola (²¹, ²², ²³, ³¹). Cinco isolados também foram identificados como produtores de sideróforos (41% do total), que por sua vez tem a capacidade de quelatizar o ferro e suas moléculas presentes na suspensão do solo facilitando, assim, a sua utilização pelos vegetais e diminuindo sua disponibilidade para fitopatógenos (²², ²³, ²⁸). A produção de sideróforos é importante, segundo Kulimushi et al. (¹⁹), pois essa dualidade formada pela restrição da disponibilidade de Fe aos microrganismos e sua disponibilidade para as plantas favorece os cultivos. O ferro pode ser um micronutriente deficitário quando plantas são atacadas por patógenos presentes no solo, como F. verticillioides. Assim, é importante considerar essa característica na seleção de microrganismos (²⁸). Também foi constatada a produção de ácido indolacético e ácido cianídrico, em três (25%) e dois (16%) isolados, respectivamente. Esses fitohormônios promovem o crescimento e o desenvolvimento vegetal e o ácido cianídrico inibe fitopatógenos (¹, ¹⁸, ²⁸).

Nos dois experimentos de promoção de crescimento de plântulas utilizando as variedades AL Bandeirante (comum) e IAC 367 (pipoca) (Tabelas 3 e 4) as respostas não foram uniformes para as cultivares que pudesse claramente selecionar os isolados mais eficientes em promover o crescimento, provavelmente pela variabilidade genética. Lizágara-Sánches et al. (²³) e Nguyen et al. (²⁶) afirmaram que características bioquímicas analisadas em testes in vitro, com isolados microbianos, nem sempre são refletidas na presença de plântulas de milho.

A inibição do crescimento micelial e da germinação de conídios do patógeno (Tabela 2) está relacionada à produção de metabólitos, como por exemplo os lipopeptídeos (¹⁹, ²², ²³). O isolado Bacillus sp. AP-512 foi o mais eficiente em inibir o crescimento micelial, não diferindo estatisticamente dos isolados AP-03, AP-88, AP-117, AP-161, AP-165 e AP-210 (Tabela 2). O isolado B. velezensis AP-03 foi mais eficiente em inibir a germinação de conídios, não diferindo estatisticamente dos isolados AP-85, AP-210 e AP-512 (Tabela 2). Informações semelhantes são descritas por Kulimushi et al. (¹⁹), Li et al. (²¹), Lizágarra-Sánchez et al. (²³) e Wang et al (³²).

Kulimushi et al. (¹⁹) observaram que B. amyloliquefaciens inibiu o crescimento micelial e a produção de conídios em, aproximadamente, 50% de Rhizomucor variabilis. Lizágarra-Sánchez et al. (²³) observaram que Bacillus sp. B25 reduziu em 93% a produção de micotoxinas produzidas por F. verticillioides em condições de laboratório. O isolado de Bacillus vallismortis BV23 inibiu o crescimento micelial de F. graminearum em 66,2%, a germinação e a produção de conídios em 90% e 86%, respectivamente (²¹). No presente estudo B. velezensis AP-03 e Bacillus sp. AP-210 foram selecionados para a realização dos ensaios com controle biológico de F. verticillioides. Como não houve destaque de nenhum dos isolados a seleção foi baseado no fato dos isolados AP-03 e AP-210 apresentarem a maior % de inibição da germinação de conídios de F. verticillioides (Tabela 2), estrutura importante para ocorrer a infecção (¹⁴, ¹⁹, ²⁵). Também foi considerado o fato do isolado AP-210 produzir ácido indolacético importante para a promoção de crescimento das plantas (Tabela 1).

A porcentagem de germinação das sementes de milho AL Bandeirantes inoculadas com Fusarium foi semelhante entre as tratadas com isolados de Bacillus e com fungicidas (Figura 1A), diferindo das testemunhas. Também para o teste de envelhecimento acelerado, a germinação foi superior nas sementes que foram tratadas com os isolados de Bacillus (Figura 1A), provavelmente pela ação de metabólitos vegetais que atuam no crescimento (²²). Também as altas temperaturas utilizadas no teste de envelhecimento acelerado podem ter diminuído a efetividade do patógeno nas sementes (Figura 1) (²⁵). Esses resultados são importantes, pois de acordo com Machado et al. (²⁵) Fusarium spp. diminuem o estande da cultura. Assim, por meio destes resultados obtidos, pode afirmar que a qualidade fisiológica de sementes de milho, inoculadas ou não com o patógeno, pode ser melhorada com o uso de isolados de Bacillus spp., conforme observado por Kulimushi et al. (¹⁹), Li et al. (²¹), Lizágarra-Sánchez et al. (²³) e Wang et al (³²).

Na Figura 1B se observa que ocorreu transmissão de F. verticillioides para sementes de milho, conforme descrito por Machado et al. (²⁵). Também se observa que os tratamentos com a mistura de fungicidas e com os isolados de Bacillus foram eficientes em reduzir a presença deste patógeno nas sementes. Essa redução é de grande importância considerado os prejuízos que este patógeno causa na cultura. O tratamento de sementes de milho com Bacillus spp. pode melhorar a qualidade sanitária em sementes inoculadas com F. verticillioides (⁸, ¹⁸, ¹⁹, ²¹, ²², ²³).

Os valores de estande final; massa seca da parte aérea, do sistema radicular e total; diâmetro do colo; altura, comprimento do sistema radicular e índice de velocidade de emergência do controle inoculado com o patógeno foram os menores, pela ação deletéria do patógenos para as sementes e plântulas de milho (²⁵). Entretanto, somente para algumas variáveis se observa diferença significativa entre o tratamento controle inoculado e os tratamentos de sementes realizados com fungicida e com Bacillus (Tabela 5), provavelmente pela ação antagônica dos isolados de Bacillus e da molécula sintética testados nesta pesquisa contra F. verticillioides (⁸, ¹⁸, ¹⁹, ²¹, ²², ²³, ²⁵). Bacillus velezensis AP-03 diferiu estatisticamente do controle inoculado para as variáveis massa seca da parte aérea, altura, diâmetro da haste e comprimento do sistema radicular, indicando sua eficiência em estimular o crescimento das plantas na presença do patógeno. Resultados semelhantes foram observados para os isolados QST-713 e AP-210. Esses resultados estão de acordo com diversos autores que avaliaram a eficiência de isolados de Bacillus spp. na promoção de crescimento e no controle de patógenos em culturas comerciais como soja, feijão e milho (⁸, ¹¹, ¹², ¹⁸, ²¹, ²², ²³, ²⁸, ³²).

A incidência da doença foi estatisticamente reduzida com o tratamento das sementes tanto com os isolados de Bacillus, como com fungicida (Tabela 5), indicando que foram eficientes em controlar o patógeno. Esses resultados são semelhantes aos observados por Kulimushi et al. (¹⁹), Li et al. (²¹), Lizárraga-Sánchez et al. (²³) e Wang et al. (³²). O reflexo do controle do patógeno também pode ser observado nas variáveis de desenvolvimento das plantas, conforme relatado na literatura, como um importante sintoma da ação deste patógeno em sementes e plântulas de milho (⁸, ¹⁸, ¹⁹, ²¹, ²², ²³, ²⁵).

Os resultados aqui obtidos indicam que os isolados de Bacillus spp. selecionados são promissores para a cultura do milho por promover crescimento e controlar F. verticillioides. De maneira geral, os isolados de B. velezensis AP-03 e Bacillus sp. AP-210 apresentaram resultados semelhantes ao produto comercial à base de B. subtilis QST-713. Contudo, esses estudos devem ser realizados em condições de campo para comprovar a eficiência desses organismos nas condições ecológicas de cultivo.

AGRADECIMENTOS

Thiago C. Ferreira agradece ao CNPq pela bolsa de doutorado (CNPq 142376/2015-9). Wagner Bettiol agradece ao CNPq pela bolsa de produtividade (CNPq 307855/2019-8).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Mar 2022
• Data do Fascículo
  Oct-Dec 2021

Histórico

• Recebido
  24 Jul 2020
• Aceito
  12 Maio 2021