PROPRIEDADES EMULSIFICANTES E SOLUBILIDADE DA CASEÍNA BOVINA E DE SEUS HIDROLISADOS TRÍPTICOS: 1. EFEITO DO PH E DO TEMPO DE HIDRÓLISE

EMULSIFYING PROPERTIES AND SOLUBILITY OF CASEIN AND IT’S TRYPTIC HYDROLYSATES: 1. EFFECTS OF PH AND HYDROLYSIS TIME

PROPRIEDADES EMULSIFICANTES E SOLUBILIDADE DA CASEÍNA BOVINA E DE SEUS HIDROLISADOS TRÍPTICOS:

1. Efeito do pH e do tempo de hidrólise¹

Ângela Jardim DUARTE², Raquel Linhares CARREIRA², Roberto Gonçalves JUNQUEIRA², José Virgílio COELHO², Marialice Pinto Coelho SILVESTRE²,^*

RESUMO

Visando a aplicação industrial da caseína e de seus hidrolisados trípticos, foram estudados os efeitos da variação do pH e do tempo de hidrólise sobre suas características de solubilidade e propriedades emulsificantes. Testou-se os valores de pH de 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 e 8,0 e os tempos de hidrólise: 5, 10 15, 30 e 60min. Foram medidos a solubilidade, a capacidade emulsificante, o índice de atividade emulsificante, a estabilidade da emulsão, e calculdado o tamanho dos glóbulos de gordura. Os resultados obtidos para a caseína nativa indicaram que os melhores valores para estas propriedades funcionais foram encontrados em pH acima de 5,0. A hidrólise tríptica da caseína foi benéfica para sua solubilidade e capacidade emulsificante e prejudicou sua estabilidade, em todos os valores de pH e tempos de hidrólise, exceto no pH 5,0 com 5 min de reação. Por outro lado, este tratamento enzimático contribuiu para melhorar o índice de atividade emulsificante da caseína, entre valores de pH 3,0 e 5,0 e após 10 min de reação.

Palavras-chave: caseína, emulsões, propriedades emulsificantes, hidrólise, tripsina

SUMMARY

EMULSIFYING PROPERTIES AND SOLUBILITY OF CASEIN AND IT’S TRYPTIC HYDROLYSATES: 1. EFFECTS OF Ph AND HYDROLYSIS TIME. The effects of pH and hydrolysis time on the solubility and emulsifying properties were studied, in view of the industrial application of casein and its tryptic hydrolyzates. It has been tested the pH values of 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0 and 8,0 and the reaction times: 5, 10, 15, 30 and 60 min. It has been evaluated the solubility, the emulsifying capacity, the emulsifying activity index and the emulsion stability. The results show that the best values for the functional properties of native casein were achieved at pH above 5,0. The tryptic hydrolysis of casein favored the solubility and emulsifying capacity but reduced the emulsion stability, at all pH and hydrolysis times, except in pH 5,0 with 5min of reaction. Otherwise, this enzymatic treatment improved the emulsifying activity index of casein only between pH 3,0- 5,0, after 10 min of reaction.

Keywords: casein, emulsions, emulsifying properties, hydrolysis, tripsin

1 — INTRODUÇÃO

A crescente tendência na formulação e fabricação de alimentos tem sido aumentar a utilização de ingredientes nutritivos. As proteínas, devido a sua importância nutricional e suas características fisico-químicas, são componentes importantes em muitos alimentos. As propriedades funcionais das proteínas são influenciadas por diversos parâmetros intrínsecos, além de fatores relacionados às metodologias utilizadas no seu estudo [33, 18]. Os dados disponíveis em relação a estas propriedades são bastante variáveis e muitas vezes conflitantes, devido a fatores interferentes como pH, força iônica, concentração de proteína e temperatura do meio [4, 5, 17, 19, 21, 25, 29]. Assim, pesquisas visando ao melhoramento de propriedades funcionais de proteínas têm mostrado a necessidade de padronização dos métodos para quantificá-las [8, 31].

A modificação da estrutura de proteínas, pela hidrólise enzimática tem sido empregada no intuito de melhorar as propriedades funcionais, devido à sua especificidade, segurança e capacidade de modificar uma grande variedade de grupos funcionais [30]. Entretanto, deve ser realizado um controle da hidrólise, uma vez que a melhoria dessas propriedades está diretamente relacionada ao tamanho da cadeia peptídica. De acordo com alguns autores, esse efeito benéfico da ação enzimática é observado para peptídeos contendo mais de 20 resíduos de aminoácidos [7, 24].

A caseína e seus hidrolisados enzimáticos possuem várias propriedades funcionais desejáveis e, por isto, a sua utilização em maior escala na indústria de alimentos apresenta grande interesse [35]. Segundo MULVIHILL [27], o estudo das propriedades emulsificantes de proteínas abrange, essencialmente, as determinações da Capacidade Emulsificante (EC), do Índice de Atividade Emulsificante (EAI) e da Estabilidade da Emulsão (ES). Além disso, torna-se importante estabelecer, para cada proteína estudada, a concentração ótima, na qual se obtém a EC máxima, uma vez que esta propriedade varia com o teor proteíco [8].

O presente trabalho teve por objetivo determinar a solubilidade e as propriedades emulsificantes da caseína e de seus hidrolisados trípticos, verificando o efeito do pH e do tempo de hidrólise.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Hidrólise tríptica da caseína

Para a hidrólise tríptica da caseína, foi utilizada a metodologia descrita por CHOBERT et al. [6], com algumas modificações. A caseína (caseína bovina, Sigma Chemical Co.) foi solubilizada em tampão fosfato dissódico (0,2 M)- ácido cítrico (0,1M), pH 8,0 em uma concentração de 5%. Posteriormente, foi adicionada a tripsina (de pâncreas bovino, tipo XIII, tratada com TPCK, Sigma Chemical Co); previamente solubilizada no mesmo tampão, de maneira a se obter uma relação enzima:substrato de 0,1%. A mistura foi, então, mantida em banho-maria a 37o C sob agitação, por intervalos de tempo variando entre 5, 10, 15, 30 e 60 minutos, para obter os hidrolisados trípticos T1, T2, T3, T4 e T5, respectivamente. Em todos os ensaios, a reação enzimática foi interrompida, reduzindo-se o pH da solução para 2,0 com ácido clorídrico. Os hidrolisados assim preparados foram, então, liofilizados (liofilizador, modelo L4KR, Edwards do Brasil) e mantidos em freezer a uma temperatura de -18º C, até o momento de utilização.

2.2. – Preparo das amostras

A caseína e seus hidrolisados trípticos foram solubilizados em solução tampão fosfato dissódico (0,2 M)- ácido cítrico (0,1 M), pH 7,0, na concentração de 0,1g %. Após 30 min, em banho-maria a 35ºC, estas soluções foram centrifugadas (modelo T-23, Janetzki) a 6.500g por 10 minutos e filtradas em papel de filtro (quantitativo faixa azul, Framex). Os filtrados assim obtidos foram utilizados, imediatamente, para as análises, ou então armazenados no freezer, a uma temperatura de -18º C até o momento de uso.

2.3 – Determinação da solubilidade

O teor de proteína solúvel, da caseína e de seus hidrolisados trípticos, foi determinado de acordo com o método de Lowry et al. [23], modificado por Hartree [16], utilizando-se a albumina (albumina sérica bovina, Sigma Chemical Co.) como padrão. Para esta determinação foi utilizada uma alíquota do filtrado obtido no preparo da amostra. O teor total de proteína (N x 6,38) foi determinado pelo método de Kjëldhal [1]. A solubilidade foi expressa em porcentagem (g %) de proteína solúvel.

2.4 – Concentração protéica ótima

Para estabelecer a concentração protéica a ser utilizada nos vários experimentos, foram preparadas soluções de caseína, cujas concentrações variaram de 0,025 a 3,0g %, em tampão fosfato dissódico (0,2M)- ácido cítrico (0,1M), pH 7,0. Em cada caso, determinou-se a EC, de acordo com o método descrito por VUILLEMARD et al [36]. Posteriormente, traçou-se uma curva de EC em função da concentração protéica.

2.5 – Determinação da Capacidade Emulsificante (EC)

Para a determinação da capacidade emulsificante, foi utilizado o método descrito por VUILLEMARD et al. [36], com pequenas modificações. Empregou-se um equipamento consistindo de funil de decantação, liquidificador e dois eletrodos acoplados a uma lâmpada de 120V. Um volume de 50ml do filtrado de caseína ou de seus hidrolisados trípticos, obtido como descrito no preparo da amostra, foi homogeneizado em liqüidificador (Fisher, mod. 14057-5, 18000rpm), na rotação máxima, enquanto óleo de milho (Mazola) foi adicionado em uma velocidade constante de 25mL/min, até ocorrer a inversão de fases da emulsão, detectada pela súbita queda da corrente elétrica, empregando-se uma lâmpada de 120V. A temperatura inicial do filtrado foi ajustada a 10º C, por imersão do recipiente em banho de gelo. Como o funil de decantação foi pesado antes e depois da adição de óleo, o peso gasto foi, então, encontrado por diferença e a EC foi calculada pela fórmula 1.

na qual OE e OB correspondiam à quantidade (g) de óleo emulsificada, respectivamente, pelas amostras e pelo branco (solução tampão sem caseína ou hidrolisado).

2.6 – Determinação do índice de atividade emulsificante (EAI)

Na determinação do EAI, a metodologia empregada foi baseada no trabalho de PEARCE e KINSELLA (31), com algumas modificações. Para a formação das emulsões, um volume de 30mL do filtrado, obtido como descrito no preparo da amostra e 10 mL de óleo de milho, foram homogeneizados durante um minuto na velocidade máxima. A temperatura das soluções foi ajustada a 207º C, antes da homogeneização. Imediatamente após a formação da emulsão, alíquotas de 1mL foram retiradas e diluídas (1/100) em uma solução a 0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS) e NaCl 0,1M. Os balões, contendo as emulsões diluídas, foram invertidos cinco vezes para se obter misturas homogêneas, e a absorbância foi lida a 500nm em espectrofotômetro (modelo 160-A, Shimadzu). O EAI foi calculado pela fórmula 2, proposta por CAMERON et al. [3].

sendo T a turbidez; q a fração de óleo gasto para formar a emulsão = 0,25 e C a concentração inicial de proteína ou hidrolisado = 0,1g%. Por sua vez, a turbidez foi calculada da seguinte maneira: T= 2,303 . A . fator de diluição / L (A= absorbância a 500 nm; fator de diluição = 100 e L = caminho óptico das cubetas = 0,01m

2.7 – Determinação da estabilidade da emulsão (ES)

O método relatado por CHOBERT et al. [6] foi utilizado para a determinação da estabilidade das emulsões (ES), com algumas modificações. As emulsões formadas para a determinação do EAI foram armazenadas sob refrigeração (4º C), por 24 horas e, após uma agitação leve por 30 segundos, as alíquotas foram retiradas e diluídas 100 vezes com SDS 0,1% para a leitura das absorbâncias a 500nm. O restante das emulsões foi aquecido a 80º C por 30min, resfriado até temperatura ambiente, novamente agitado e uma alíquota, diluída da mesma maneira como descrito para a determinação do EAI, teve sua absorbância lida a 500 nm. Calculou-se, então, o DEAI %, pela fórmula 3.

na qual o EAI max é o maior valor obtido para as emulsões diluídas logo após sua formação, e EAI min é o menor valor de EAI, obtido pelas alíquotas após o armazenamento por 24 horas ou pelas alíquotas após o aquecimento a 80º C. Os valores de ES foram calculados pela fórmula 4.

2.8 – Cálculo do tamanho dos glóbulos de gordura

O tamanho dos glóbulos de gordura da fase dispersa das emulsões foi estimado, de acordo com PEARCE E KINSELLA [31], empregando-se a fórmula 5.

na qual R é o raio médio dos glóbulos de gordura da fase dispersa das emulsões, q é a fração de óleo utilizado na emulsão = 0,25 e T é a turbidez calculada pela absorbância lida logo após a formação das emulsões.

2.9 – Efeito do pH

Para estudar a influência do pH na solubilidade e nas propriedades emulsificantes, o pH das soluções de caseína e de seus hidrolisados trípticos, preparadas como descrito anteriormente (2.2), foi ajustado para 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 e 8,0, antes de se proceder o aquecimento, centrifugação e filtração.

2.10 – Análise Estatística

As determinações de concentração protéica ótima, proteína solúvel, proteína bruta, EC, EAI, ES e raio médio dos glóbulos de gordura foram realizadas em triplicata.

Para a determinação da concentração protéica ótima, foi feita a análise de variância, em delineamento inteiramente casualisado, para verificar a presença de efeitos significativos (p < 0,05) e, nestes casos foi aplicado o teste de Duncan para determinar as diferenças entre as médias [12].

Para as determinações do efeito do pH e do tempo de hidrólise sobre a solubilidade, EC, EAI, ES e raio médio dos glóbulos de gordura, foi adotado o delineamento em parcelas subdivididas (no qual os tempos de hidrólise eram as parcelas e os diferentes valores de pH, as sub-parcelas) e análises de variância para determinar a existência de efeitos significativos ou interações entre os efeitos (p < 0,05). O teste de Duncan foi utilizado para determinar diferenças entre as médias, para os efeitos que se mostraram significativos pelo teste de F [12].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Concentração protéica ótima

Os resultados da capacidade emulsionante estão apresentados na Figura 1. Observa-se que a EC da caseína aumenta até uma concentração de 0,075g %, mantém-se praticamente inalterada até 2,00g %, decaindo a partir deste valor. Assim, 0,10g % foi escolhida como concentração protéica para as determinações neste trabalho. Na verdade, este valor, de acordo com PEARCE e KINSELLA [31], refere-se à concentração mínima necessária para se obter resultados reprodutíveis na determinação de propriedades emulsificantes.

FIGURA 1.
Variação da capacidade emulsificante em função da concentração de caseína.

Diversos estudos têm sido realizados a fim de se verificar o efeito da concentração protéica na capacidade emulsificante. Assim, VUILLEMARD et al. [36], afirmaram que a concentração protéica influi na quantidade de óleo emulsificado e que a EC máxima é obtida com uma concentração de 0,1g %, para o caseinato de sódio. Por outro lado, estes autores obtiveram uma curva na qual a EC aumentou, com a concentração protéica, até um valor máximo (0,1g %) a partir do qual, decaiu. FOLEY e O’CONNELL [10], estudando a EC do caseinato de sódio em concentrações protéicas variando entre 0,1 a 1,0 % (p/p), obtiveram resultados semelhantes aos de VUILLEMARD et al. [36]. MOHANTY et al. [26], trabalhando com caseinato de sódio, escolheram a concentração de 0,25% como o valor mais adequado para ser empregado na determinação da EC, uma vez que em concentrações inferiores foi difícil visualizar o ponto final.

A diferença entre os resultados obtidos poderia ser explicada pelo emprego da caseína em diferentes formas (livre ou salina), como também pelo fato da metodologia e a aparelhagem utilizadas não serem exatamente as mesmas nos diversos trabalhos [4, 5, 17, 19, 21, 25, 28, 29, 31].

3.2 – Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre a solubilidade

Observa-se na Figura 2, que na faixa de pH 3,0 a 5,0 a caseína apresentou solubilidade mínima. Quando o pH passou de 5,0 para 6,0, houve um aumento acentuado da solubilidade. A partir daí, nota-se apenas uma pequena variação nos valores obtidos, sendo que o valor máximo foi atingido entre pH 7,0 e 8.0.

FIGURA 2.
Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre a solubilidade da caseína. T1, T2, T3, T4, T5 -Hidrolisados de caseína obtidos aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação.

A hidrólise tríptica da caseína aumentou sua solubilidade em todos os valores de pH estudados, exceto em pH 6,0, quando foi semelhante ao hidrolisado T1 (5 min de hidrólise). Na faixa de pH correspondente ao ponto isoelétrico da caseína, o efeito da hidrólise tríptica foi ainda mais acentuado. Observa-se ainda, uma semelhança entre os resultados obtidos para a solubilidade após 5 e 10 minutos de hidrólise, o mesmo tendo acontecido com os tempos de 15, 30 e 60 minutos, cujos valores estão próximos entre si e bem superiores aos dois tempos iniciais. Nota-se ainda nesta figura, que o efeito do pH na solubilidade dos hidrolisados trípticos foi diferente e bem mais variado que o observado para a caseína.

Sabe-se que o pH tem um efeito sobre a carga da proteína influenciando desta maneira a sua solubilidade, sendo que no pI esta propriedade atinge o seu valor mínimo [5].

Segundo DAS e KINSELLA [9], a hidrólise enzimática pode contribuir para aumentar a solubilidade de proteínas, uma vez que leva a uma maior exposição de grupos carregados, diminui o tamanho molecular, aumenta a hidrofilicidade, além de provocar alterações favoráveis na configuração molecular.

O efeito do pH na solubilidade da caseína, em diferentes formas, ou de suas frações, foi estudado por diversos autores e, em alguns casos, os resultados foram semelhantes aos obtidos no presente trabalho [2]. Por outro lado, os resultados apresentados por FOLEY e O’CONNELL [10], indicaram que, na faixa alcalina a solubilidade do caseinato de sódio se assemelhou ao obtido para a caseína no presente trabalho, mas no pH 3,0, encontrou-se elevada, em torno de 60%. LEE et al. [20] mostraram que, não houve um aumento acentuado da solubilidade do caseinato de potássio entre pH 6,0 e 7,0. CAYOT et al. [4] relataram que a solubilidade da a _s-1 - e da b -caseína, nativas e glicosiladas, foi maior em pH 8,0 e 2,0.

A influência da hidrólise enzimática sobre a solubilidade da caseína ou de suas frações, foi também avaliada por alguns autores, (6, 34). tendo sido observado um efeito positivo com o aumento do tempo de reação. Alguns estudos realizados com peptídeos, provenientes da hidrólise enzimática da caseína [21, 32], demonstraram uma certa semelhança com a a curva de solubilidade encontrada para os hidrolisados trípticos da caseína no presente trabalho. Por outro lado, os resultados obtidos com peptídeos foram diferentes dos apresentados pela caseína nativa no presente trabalho, o que poderia ser explicado, pelo menos em parte, pelo fato dos peptídeos apresentarem tamanhos moleculares inferiores e estruturas mais simples que as proteínas.

3.3 – Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre a capacidade emulsificante

Com relação ao efeito do pH na EC da caseína (Figura 3), observa-se que a curva obtida se assemelha à da solubilidade (Figura 2). Foi encontrada uma correlação positiva (r = 0,9647) e significativa (p < 0,01) entre estas duas propriedades funcionais, demonstrando que ambas são afetadas de maneira semelhante pela variação do pH. Esta mesma observação já havia sido relatada por outros trabalhos [2, 8, 22, 28, 35]. por outro lado, pode-se observar, ainda na Figura 3, que mesmo na faixa de pH 3,0 a 5,0 quando a sua solubilidade é praticamente nula, a caseína apresentou razoável capacidade emulsificante.

FIGURA 3.
Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre a capacidade emulsificante da caseína. T1, T2, T3, T4, T5 -Hidrolisados de caseína obtidos aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação.

Na hidrólise tríptica (Figura 3) obteve-se resultados que também são semelhantes aos obtidos para a solubilidade (Figura 2). Observa-se, também, que este tratamento enzimático da caseína produziu um aumento da EC em todos os valores de pH estudados, sendo que em pH 4,0, 5,0 e 8,0, esta melhora foi observada em todos os tempos de reação hidrolítica. Nos outros valores de pH, especialmente 6,0 e 7,0, foi necessária uma hidrólise mais prolongada para se obter o mesmo efeito. Ainda, como descrito para a solubilidade, o pH exerceu efeitos variados sobre a EC dos hidrolisados trípticos.

Segundo alguns autores [25, 28, 35], esta influência do pH na solubilidade pode interferir na quantidade da proteína adsorvida na interface óleo/água (O/A) e, dessa maneira modificar as propriedades emulsificantes da proteína.

Com relação ao efeito da hidrólise nas propriedades emulsificantes, alguns autores (6, 9, 11, 24) afirmaram que, além da ação enzimática melhorar a solubilidade protéica, pode contribuir, ainda, para aumentar o número de pontos de contato entre a proteína e a interface óleo/água. Isto acontece, provavelmente, porque a hidrólise rompe a conformação nativa da proteína, expondo os grupos hidrofóbicos, que se tornam mais disponíveis para interagir com os lípides durante a formação da emulsão. Uma melhora das propriedades emulsificantes das proteínas, geralmente é acompanhada pelo aumento do tempo de hidrólise. Por outro lado, uma forte ação enzimática pode ser prejudicial, devido à liberação de peptídeos não anfóteros, e à redução excessiva do tamanho da cadeia peptídica, tornando importante efetuar o controle do grau de hidrólise (GH) da proteína. A obtenção de boas propriedades funcionais é alcançada para peptídeos contendo mais de 20 resíduos de aminoácidos [6, 11, 13].

Outros autores também avaliaram a EC da caseína ou de suas frações, tendo sido observado uma elevação na faixa de pH entre 5,0 e 7,0, e uma queda no pH igual ou inferior a 5,0 [6, 19, 26].

A influência da hidrólise tríptica sobre a EC da caseína foi, também, estudada por CHOBERT et al. [6], que relataram uma elevação em pH 4,0 e 5,0. No entanto, ao contrário do observado no presente trabalho, em pH abaixo do pI, a EC dos hidrolisados foi menor que da caseína e, em pH de 5,5 a 8,0, a EC diminuiu com o aumento do tempo de hidrólise.

3.4 – Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre o índice de atividade emulsificante

A curva do EAI em função do pH para a caseína (Figura 4), também se assemelha à da solubilidade (Figura 2), existindo, também, uma correlação positiva (r = 0,9895) e significativa (p < 0,001) entre estas duas propriedades. Esta mesma semelhança entre as curvas foi, igualmente, descrita por diversos autores [2, 21, 22, 35].

FIGURA 4.
Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre o índice de atividade emulsificante da caseína T1, T2, T3, T4, T5 -Hidrolisados de caseína obtidos aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação.

A caseína apresentou um elevado valor de EAI, mesmo na faixa de pH de 3,0 a 5,0, quando sua solubilidade é praticamente nula. É importante ressaltar, ainda, que foi encontrada uma correlação positiva (r = 0,9513) e significativa (p < 0,05) entre o EC e o EAI da caseína.

Por outro lado, ao contrário do que foi observado para a solubilidade e a EC, a ação da tripsina não produziu melhoras significativas no EAI da caseína, na maioria dos valores de pH estudados. Foi sobretudo na faixa ácida, que a hidrólise tríptica teve efeitos mais importantes, principalmente a partir de 10 minutos de reação. O efeito do pH sobre o EAI dos hidrolisados foi também mais acentuado nesta faixa.

Diversos autores avaliaram o efeito do pH sobre o EAI da caseína, em diferentes formas, ou de suas frações. Em alguns casos, foi observada uma elevação a partir do pH 7,0 [20, 35], mas existem trabalhos mostrando este mesmo resultado também em pH abaixo de 4,0 [6, 34].

Estes mesmos autores estudaram a ação da hidrólise tríptica sobre o EAI da caseína, tendo sido observado um efeito positivo em pH 2,0, 6,0 e 10,0 [6] e em pH 3,0 e 6,5 [34]. Alguns estudos realizados com peptídeos [21, 32].provenientes da hidrólise enzimática da caseína, demonstraram uma certa semelhança com a a curva de EAI em função do pH encontrado para os hidrolisados trípticos da caseína, no presente trabalho, principalmente com os obtidos a partir de 15 min de reação.

3.5 – Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre a estabilidade das emulsões

Quanto ao efeito do pH sobre a ES da caseína, observa-se na Figura 5 um aumento acentuado a partir do pH 6,0. Portanto, ao contrário do que foi mencionado para a EC e o EAI, a curva da ES em função do pH se diferencia daquela da solubilidade. Isto indica que, se por um lado não foi observada uma correlação significativa entre estas duas propriedades em todos os valores de pH estudados, por outro pode-se verificar que a faixa neutra e ligeiramente alcalina (pH 6,0 a 8,0), em que a solubilidade da caseína atingiu o seu máximo, corresponde, também, à região de pH em que sua ES apresentou os melhores resultados.

FIGURA 5.
Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre a estabilidade da emulsão de caseína. ES = 1/D EAI% x 10^3. T1, T2, T3, T4, T5 -Hidrolisados de caseína obtidos aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação. Os valores representam a média de três repetições.

A figura 5 mostra, ainda, que a hidrólise tríptica não contribuiu para melhorar a ES da caseína nos valores de pH estudados, ao contrário do que foi observado para as outras propriedades funcionais. A ES dos hidrolisados trípticos manteve-se praticamente inalterada em toda a faixa de pH estudada.

O efeito do pH na estabilidade das emulsões apresenta uma certa complexidade. Assim, de acordo com MANGINO [25], em valores próximos ao pI, as proteínas são capazes de formar filmes interfaciais mais coesos e mais viscosos, o que é benéfico para a estabilidade da emulsão. Entretanto, em alguns casos, como foi observado para a caseína no presente trabalho, a ES pode ser mais elevada em uma faixa de pH distante do ponto isoelétrico. De acordo com o mesmo autor, isto depende do equipamento utilizado para formar a emulsão, uma vez que um maior fornecimento de energia pode levar à adsorção de moléculas mais carregadas, aumentando-se, assim, a repulsão de cargas, e portanto, a estabilidade da emulsão.

Na verdade, DAS e KINSELLA [9] já haviam relatado que os resultados obtidos por diferentes autores, sobre o efeito do pH na estabilidade de emulsões, são contraditórios. Assim, existem autores que obtiveram o valor máximo de ES no pI, enquanto outros descreveram exatamente o oposto [6, 20]. Além da falta de padronização da metodologia empregada, sabe-se que a utilização de concentrações diferentes de proteínas nestes estudos, pode dar origem a filmes protéicos interfaciais possuindo propriedades e forças diversas.

A ação da hidrólise enzimática de proteínas na melhoria da estabilidade de emulsões está associada ao aumento da solubilidade e do GH [9, 11]. A hidrólise tríptica, nas condições que aqui foram empregadas, apesar de ter aumentado a solubilidade da caseína, não exerceu qualquer efeito benéfico sobre a estabilidade das emulsões, na faixa de pH estudada. Na verdade, uma solubilidade excessiva não é desejável, quando a emulsão já está formada, pois poderia provocar uma "desorção" e uma perda do filme protéico interfacial, diminuindo a estabilidade das emulsões [9]. Isto poderia provavelmente explicar os resultados obtidos para a estabilidade dos hidrolisados T3, T4 e T5, que apresentaram uma solubilidade próxima a 100 %, em toda a faixa de pH estudada. Outros fatores, além da solubilidade, são capazes de afetar a estabilidade de emulsões, e poderiam estar interferindo nestes resultados, tais como, a relação entre os volumes da fase aquosa e oleosa, as propriedades do filme protéico, o tamanho e a conformação da molécula protéica [9].

Alguns autores estudaram o efeito do pH sobre a estabilidade de emulsões formadas pela caseína, ou suas frações, tendo sido obtidos, de maneira geral, valores mais elevados em pH 7,0 e 8,0 do que em pH 4,0 [2, 6, 20, 34]. CAYOT et al. [4], trabalhando com frações da caseína, verificaram que, em pH 2,0 a b - caseína teve maior ES que a a - caseína, mas em pH 8,0, este efeito se inverteu.

A ação da hidrólise da hidrólise tríptica sobre a ES da caseína ou de suas frações, também foi avaliada por estes autores, obtendo resultados que contradizem os encontrados no presente trabalho. Assim, este tratamento enzimático influenciou negativa ou positivamente a ES da caseína, dependendo das condições hidrolíticas empregadas, em todos os valores de pH testados [6, 34].

3.6 – Efeito do pH e do tempo de hidrólise tríptica sobre o tamanho dos glóbulos de gordura

Pode-se verificar na Tabela 1, que um aumento de pH levou a uma diminuição do tamanho dos glóbulos de gordura nas emulsões formadas com a caseína. A hidrólise tríptica contribuiu, também, para reduzir o tamanho dos glóbulos de gordura, apenas na faixa ácida de pH 3,0 a 5,0, sendo que no pH 3,0, foi a partir de 10 min; no pH 4,0, a partir de 15 min e no pH 5,0, a partir de 5 min de reação. Nos outros valores de pH estudados, a hidrólise tríptica não exerceu qualquer influência no tamanho dos glóbulos de gordura. Os resultados obtidos para os hidrolisados trípticos foram bastante variados, sendo que apenas o T1 apresentou alterações semelhantes às da caseína.

TABELA 1.
Raio médio dos glóbulos de gordura (volume/área) de emulsões formadas pela caseína e seus hidrolisados trípticos

pH	caseína	T1	T2	T3	T4	T5
3.0	1.99 1-a	1.88 1-a	1.33 2-b	0.99 3-c	0.92 2-c	0.89 3-c
4.0	1.91 2-a	1.91 1-a	1.78 1-a	1.49 1-b	1.29 1-c	1.27 2-c
5.0	1.71 3-a	1.33 2-c	1.31 2-c	1.29 2-c	1.29 1-c	1.54 1-b
6.0	0.95 4-a	0.92 3-a	0.84 3-a	0.92 4-a	0.92 2-a	0.91 3-a
7.0	0.92 4-a	0.89 3-a	0.84 3-a	0.84 5-a	0.79 3-a	0.89 3-a
8.0	0.80 5-a	0.79 4-a	0.79 3-a	0.84 5-a	0.89 2-a	0.89 3-a

T1, T2, T3, T4, T5 -Hidrolisados de caseína obtidos aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação. Os valores representam a média de três repetições. Médias indicadas por números iguais não diferem significativamente entre si (mesma amostra em todos os pH). Médias indicadas por letras minúsculas não diferem significativamente entre si (todas as amostras, em cada pH).

No presente trabalho, o tamanho dos glóbulos de gordura não foi medido, tendo sido estimado pela equação proposta por PEARCE e KINSELLA [31], visando estabelecer apenas uma correlação aproximada com a estabilidade das emulsões. Entretanto, para a obtenção de resultados mais precisos, seria necessário proceder-se à medida do raio médio destes glóbulos, de acordo com as técnicas descritas na literatura [14, 15, 18, 22, 31, 33].

De acordo com DAS e KINSELLA [9], a estabilidade de emulsões está relacionada com o tamanho dos glóbulos de gordura. Neste caso, porém, os argumentos termodinâmicos nem sempre são adequados para explicar os fenômenos envolvidos, uma vez que gotículas pequenas apresentam maior área superficial, o que produziria um sistema com maior energia livre, levando também a uma maior estabilidade. Além disso, segundo estes mesmos autores, um aumento do tamanho das gotículas de gordura provoca uma aceleração na velocidade de coalescência das emulsões, diminuindo a sua estabilidade.

Os resultados, obtidos no presente trabalho, indicaram que um aumento do pH levou a uma diminuição tanto de R quanto da ES, para as emulsões formadas com a caseína. Com a hidrólise tríptica, a correlação citada por DAS e KINSELLA [9] foi obtida somente com 5 e 15 min de reação, tendo sido observado uma redução de R com o aumento da ES.

Alguns autores avaliaram o tamanho do raio dos glóbulos de gordura em emulsões formadas pela caseína, em diferentes formas. Assim, PEARCE e KINSELLA [31] mostraram que os menores glóbulos em emulsões formadas pelo caseinato de sódio apresentaram diâmetros inferiores a 0,2mm, por medida em microscópio. HAQUE e KINSELLA [15] verificaram, por meio de diferentes técnicas, que quando o fornecimento de energia foi elevado de 7,6 para 182,6 10⁶ J m^-3, os tamanhos médios dos glóbulos de gordura de emulsões formadas pela caseína em pH 7,0, passaram de 4,9 para 5,9m , de 4,6 para 5,5m e de 5,6 para 6,1 d _vs (d _{vs =} "volume surface diameter") para as leituras em microscopia eletrônica, microscopia óptica computadorizada e turbidimetria, respectivamente.

4 — CONCLUSÕES

A caseína apresentou melhores propriedades emulsificantes (EC, EAI e ES) na faixa de pH distante de seu pI, em que ela é mais solúvel. A hidrólise tríptica, nas condições empregadas, contribuiu para melhorar a solubilidade e a EC da caseína em praticamente todos os valores de pH e tempos de reação estudados, ao contrário do observado para a ES. No caso do EAI, essa modificação da estrutura protéica foi benéfica apenas na faixa ácida (pH 3,0 a 5,0). A correlação entre o tamanho dos glóbulos de gordura (R) e a ES, citada por alguns autores, somente foi observada com 5 e 10 min de hidrólise, tendo sido obtida uma redução de R com o aumento da ES.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES e ao CNPq, pelo oferecimento de recursos sob a forma de bolsas e à FAPEMIG, pelo apoio financeiro.

² Departamento de Alimentos-Faculdade de Farmácia - UFMG - Av. Olegário Maciel, 2360 - CEP 30180-112 - Belo Horizonte - MG - Tel.: [phone] - Fax: [phone]. E-mail: [e-mail]

^* A quem correspondência deve ser endereçada.

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¹

Recebido para publicação em 26/01/98. Aceito para publicação em 19/08/98. Esse trabalho é parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Maio 1999
• Data do Fascículo
  Ago 1998

Histórico

• Aceito
  19 Ago 1998
• Recebido
  26 Jan 1998