PROPRIEDADES EMULSIONANTES E SOLUBILIDADE DA CASEÍNA BOVINA: 2. EFEITO DA ADIÇÃO DE NaCl

EMULSIFYING PROPERTIES AND SOLUBILITY OF CASEIN: 2. EFFECTS OF THE NaCl ADDITION

PROPRIEDADES EMULSIONANTES E SOLUBILIDADE DA CASEÍNA BOVINA:

2. Efeito da adição de NaCl¹

Ângela Jardim DUARTE², Raquel Linhares CARREIRA², Roberto Gonçalves JUNQUEIRA², José Virgílio COELHO², Marialice Pinto Coelho SILVESTRE²,^*

RESUMO

O efeito da adição de NaCl sobre algumas propriedades funcionais da caseína e de seus hidrolisados trípticos, foi estudado em dois valores de pH (4,0 e 5,0). Para tal, foi adicionado um teor de 0,02M do sal às soluções-tampão empregadas no preparo das amostras. Foram determinadas a solubilidade protéica, a capacidade emulsificante (EC), o índice de atividade emulsificante (EAI) e a estabilidade das emulsões (ES), e o raio médio dos glóbulos de gordura (R) foi calculado. Os resultados obtidos indicaram que, nos dois valores de pH estudados, a adição de NaCl levou a um aumento significativo da solubilidade e da EC da caseína e de todos os hidrolisados trípticos. Por outro lado, diminuiu os valores de EAI da caseína e elevou os dos hidrolisados, tendo sido observado o oposto para o tamanho dos glóbulos de gordura. Com relação à ES, a da caseína apresentou ligeiro aumento no pH 5,0, enquanto que apenas alguns hidrolisados trípticos tiveram a sua ES elevada em pH 4,0 ou 5,0.

Palavras-chave: caseína, solubilidade, prorpiedades emulsificantes, hidrólise tríptica, NaCl

SUMMARY

EMULSIFYING PROPERTIES AND SOLUBILITY OF CASEIN: 2. EFFECTS OF the NaCl ADDITION. The effect of the NaCl addition on the emulsifying properties of casein and tryptic casein hydrolysates was studied in two pH values (4,0 e 5,0). A 0.02 M concentration of salt was added to the buffer solutions used for preparing the samples. The protein solubility, the emulsifying capacity (EC), the emulsifying activity index (EAI) and the emulsion stability (ES) were determined. The mean radius (R) of fat droplets was also calculated. The results showed that the addition of NaCl increased the solubility and the EC of casein and casein hydrolysates, in both pH values. However, this salt addition reduced the EAI of casein and increased that of the hydrolysates.The opposite was observed relating to the R of fat droplets. Regarding the ES, that of casein presented little increase in pH 5.0, and the same result was obtained for only some hydrolysates in pH 5.0 or 4.0.

Keywords: casein, solibility, emulsifying properties, triptic hydrolysis, NaCl.

1 - INTRODUÇÃO

A crescente demanda do consumidor por produtos naturais e saudáveis, tem contribuído para aumentar o interesse pelo estudo dos ingredientes utilizados na fabricação de alimentos, tais como os agentes emulsificantes. Diversos trabalhos têm mostrado que as proteínas alimentares, bem como seus hidrolisados enzimáticos, auxiliam na formação e na estabilidade de emulsões [3, 9, 13, 18, 21, 22, 25, 29].

Por outro lado, uma vez que o NaCl tem sido empregado extensivamente pelas indústrias alimentícias, visando melhorar as propriedades funcionais através do aumento da absorção de água e da solubilidade protéica, além de contribuir para o sabor dos alimentos [29], torna-se importante verificar o efeito desse ingrediente nas propriedades emulsificantes das proteínas.

Segundo CHEFTEL et al. [6], a natureza e a concentração de íons exercem efeitos significativos sobre a absorção de água e a solubilidade das proteínas. Assim, concentrações salinas compreendidas entre 0,5 e 1M (para os sais neutros), podem elevar a solubilidade da proteína (efeito "salting in") devido ao aumento da solvatação. Essa ação benéfica do sal tem sido aproveitada pelas indústrias alimentícias, que utilizam o NaCl como ingrediente alimentar, visando aumentar a solubilidade e a estabilidade, melhorando, assim as propriedades emulsificantes de vários produtos [29]. Por outro lado, quando os níveis de sais são mais elevados, predominam as interações água-sal, em detrimento das interações água-proteína (efeito "salting out"), contribuindo para reduzir a solubilidade protéica [6].

A caseína e seus hidrolisados enzimáticos apresentam boas propriedades emulsificantes podendo, portanto, serem utilizados pelas indústrias de alimentos, como agente funcional [5, 9, 11, 14, 20, 26, 27, 28]. Entretanto, não são muitos os trabalhos relatando a ação do sal sobre as propriedades emulsificantes de proteínas e, nada foi encontrado na literatura que mencionasse a influência desse ingrediente sobre essas propriedades de hidrolisados protéicos.

Assim sendo, esse trabalho teve como objetivo estudar o efeito da adição de NaCl sobre as propriedades emulsificantes da caseína e de seus hidrolisados trípticos, em pH 4,0 e 5,0.

2 — MATERIAL E MÉTODOS

2.1 – Preparo dos hidrolisados de caseína

Para o preparo dos hidrolisados trípticos de caseína, foi utilizada a metodologia descrita por DUARTE et al. [9]. Resumidamente, empregou-se como substrato a caseína (caseína bovina, Sigma Chemical Co.), que foi misturada com a tripsina (de pâncreas bovino, tipo XIII, tratada com TPCK, Sigma Chemical Co); ambas solubilizadas em tampão fosfato dissódico (0,2 M)-ácido cítrico (0,1M), pH 8,0, de maneira a se obter uma relação enzima:substrato de 0,1%. Após incubação em banho-maria a 37º C sob agitação, por intervalos de tempo variando entre 5, 10, 15, 30 e 60 minutos, obteve-se os hidrolisados T1, T2, T3, T4 e T5, respectivamente. A reação enzimática foi interrompida, abaixando-se o pH para 2,0 com ácido clorídrico. Os hidrolisados foram, então, liofilizados (liofilizador, modelo L4KR, Edwards do Brasil) e mantidos em freezer a uma temperatura de -18º C, até o momento de utilização.

2.2 – Preparo das amostras

Seguiu-se o procedimento descrito por DUARTE et al. [9]. Assim, a caseína e seus hidrolisados trípticos foram solubilizados em solução tampão fosfato dissódico (0,2 M)- ácido cítrico (0,1 M), em pH 4,0 e 5,0, na concentração de 0,1g %. Após 30 min, em banho-maria a 35º C, estas soluções foram centrifugadas (centrífuga de alta rotação, modelo T-23, Janetzki) a 6.500g por 10 minutos e filtradas em papel de filtro (quantitativo faixa azul, Framex). Os filtrados assim obtidos foram utilizados, imediatamente, para as análises, ou então armazenados no freezer, a uma temperatura de -18º C até o momento de uso.

2.3 – Determinação da solubilidade

A solubilidade foi determinada como descrito por DUARTE et al. [9], tendo o teor de proteína solúvel, sido estimado de acordo com o método de Lowry et al. [17], modificado por Hartree [12], utilizando-se a albumina (albumina sérica bovina, Sigma Chemical Co.) como padrão. O teor total de proteína (N x 6,38) foi determinado pelo método de Kjëldhal [1] A solubilidade foi expressa em porcentagem de proteína solúvel (g %)

2.4 – Determinação da Capacidade Emulsificante (EC)

Para a determinação da capacidade emulsificante, foi utilizada a adaptação do método de VUILLEMARD et al. [30], descrita por DUARTE et al. [9]. Resumidamente, após ajuste da temperatura para 10º C, uma alíquota do filtrado das amostras foi homogeneizada com óleo de milho (Mazola), em liquidificador de alta rotação (Fisher, mod.14057-5, 18000rpm), até ocorrer a inversão da emulsão, detectada pela súbita queda da corrente elétrica, empregando-se uma lâmpada de 120 V. A EC foi, então, calculada pela fórmula (1).

na qual OE e OB correspondem à quantidade (g) de óleo emulsificada, respectivamente, pelas amostras e pelo branco (solução tampão sem caseína ou hidrolisado).

2.5 – Determinação do índice de atividade emulsificante (EAI)

Na determinação do EAI, foi utilizada a adaptação da metodologia de PEARCE e KINSELLA [23], descrita por DUARTE et al. [9]. Resumidamente, após ajuste da temperatura para 20º C, volumes de 30 mL do filtrado das amostras e de 10 mL de óleo de milho, foram homogeneizados, em liquidificador, durante um minuto na velocidade máxima. Posteriormente, a absorbância de alíquotas dessa emulsão foi lida a 500nm, em espectrofotômetro (modelo 160-A, Shimadzu), após diluição com uma soluçãode dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% e NaCl 0,1 M. O EAI foi calculado pela fórmula (2), proposta por CAMERON et al. [4],

na qual T é a turbidez = 2,303 . A . fator de diluição / L (A= absorbância a 500 nm; fator de diluição = 100 e L = caminho óptico das cubetas = 0,01m); q é a fração de óleo gasto para formar a emulsão = 0,25 e C é a concentração inicial de proteína ou hidrolisado = 0,1 g%.

2.6 – Determinação da estabilidade da emulsão (ES)

A ES foi determinada empregando-se a adaptação da metodologia de CHOBERT et al. [7], descrita por DUARTE et al. [9]. Assim, as absorbâncias das emulsões formadas para a determinação do EAI e diluídas com SDS a 0,1%, foram lidas a 500nm, logo após a sua formação. Depois de um período de 24 horas de armazenamento sob refrigeração, foram lidas novamente, como também, após aquecimento a 80 o C por 30 min. Calculou-se, então, o D EAI %, pela fórmula (3).

(3)

na qual o EAI max é o maior valor obtido para as emulsões diluídas logo após sua formação, e EAI min é o menor valor de EAI, obtido pelas alíquotas após o armazenamento por 24 horas ou pelas alíquotas após o aquecimento a 80º C. Os valores de ES foram calculados pela fórmula (4).

2.7 Cálculo do tamanho dos glóbulos de gordura

O tamanho dos glóbulos de gordura da fase dispersa das emulsões foi estimado, de acordo com PEARCE e KINSELLA [23], pela fórmula (5).

(5)

na qual R é o raio médio dos glóbulos de gordura da fase dispersa das emulsões, q é a fração de óleo utilizado na emulsão = 0,25 e T é a turbidez calculada pela absorbância lida logo após a formação das emulsões.

2.8 – Efeito da adição de NaCl

Para estudar a influência da adição de NaCl na solubilidade e nas propriedades emulsificantes, foi adicionado à solução tampão (pH 4,0 e 5,0) um volume de uma solução de NaCl a 0,2M, de maneira a se obter uma concentração final de sal de 0,02M. Posteriormente, as soluções de caseína e de seus hidrolisados trípticos foram aquecidas, centrifugadas, filtradas e armazenadas como descrito anteriormente. Procedeu-se, então, às determinações da solubilidade e das propriedades emulsificantes, como também, ao cálculo do tamanho dos glóbulos de gordura.

2.9 – Análise Estatística

As determinações de proteína solúvel, proteína bruta, EC, EAI, ES e raio médio dos glóbulos de gordura foram realizadas em triplicata.

Para verificar o efeito da adição de NaCl sobre as propriedades funcionais e o raio médio dos glóbulos de gordura, nos dois valores de pH, e para os 5 hidrolisados de caseína, foram feitos delineamentos em parcelas sub-subdivididas (nos quais os tempos de hidrólise eram as parcelas, os valores de pH as sub-parcelas e a presença ou ausência de NaCl as sub-sub-parcelas), com análise de variância, para cada propriedade (p < 0,05) e, em seguida, utilizado o teste T de Student (DMS) para a comparação das médias [16].

3 — RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 – Efeito da adição de NaCl sobre a solubilidade

Observa-se na Figura 1 que a adição de NaCl levou a um aumento significativo da solubilidade da caseína e de todos os hidrolisados trípticos, nos dois valores de pH estudados. Para a proteína, este efeito foi mais pronunciado em pH 5,0, enquanto que para a maioria dos hidrolisados foi no pH 4,0.

FIGURA 1.
Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre a solubilidade da caseína e de seus hidrolisados trípticos: T1, T2, T3, T4, T5 - Hidrolisados de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação, respectivamente.

No presente estudo, a adição de 0,02M de NaCl, corresponde a uma concentração final de sal em torno de 0,44M (NaCl e tampão). Observa-se, portanto, que apesar desse valor situar-se abaixo da faixa de 0,5 a 1M, ocorreu o efeito de "salting in" para a caseína, uma vez que a sua solubilidade aumentou em ambos os valores de pH estudados.

Alguns autores estudaram a influência da adição de sal sobre a solubilidade da caseína e/ou de suas frações. Assim, CAYOT et al. [5] estudaram a solubilidade da b -caseína na ausência e na presença de 0,1M de NaCl e verificaram que o efeito do sal foi positivo apenas em pH 5,0, pois em pH 2,0 e 8,0 este procedimento diminuiu sua solubilidade. VAN HEKKEN e STRANGE [29], trabalharam com a caseína nativa e defosforilada, em soluções contendo 0,15M de NaCl, em uma faixa de pH entre 3,0 e 8,0 e verificaram que a solubilidade de ambas as caseínas foi bem maior no pH 5,0 que no pH 4,0. No entanto, FOLEY e O’CONNELL [10] obtiveram resultados diferentes, quando mostraram que a presença de sal (7,59 g/L) não influenciou a solubilidade do caseinato de sódio, em pH 4,0 e 5,0.

3.2 – Efeito da adição de NaCl sobre a capacidade emulsificante

Pode-se notar na Figura 2 que, como descrito para a solubilidade, a adição de sal, aumentou a EC da caseína e dos hidrolisados trípticos, em ambos os valores de pH. Nesse caso, porém, para todas as amostras analisadas, o efeito foi mais acentuado em pH 5,0.

FIGURA 2.
Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre a capacidade emulsificante da caseína e de seus hidrolisados trípticos.T1, T2, T3, T4, T5: Hidrolisados de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação, respectivamente.

Alguns autores verificaram a influência da adição de sal na EC da caseína em diferentes formas. Assim, Pearson et al. [24] verificaram que, para o caseinato de potássio, em pH ácido e próximo à neutralidade (pH=6,9), a EC elevou-se quando a força iônica passou de 0,05 para 0,3 com adição de KCl. MOHANTY et al. [19] estudaram o efeito da adição de NaCl na EC da caseína ácida (pH 2,5) e caseinato de sódio (pH 7,0) e mostraram que, com a adição de 100 mM de NaCl, a EC do caseinato aumentou bruscamente e continuou a crescer, embora em menor proporção, até a concentração de NaCl atingir 1000mM. Quanto à caseína, a adição de NaCl até 5mM aumentou sua EC, enquanto que acima desta concentração, a EC decresceu, e a partir de aproximadamente 10mM, a EC atingiu níveis inferiores ao apresentado pela mesma proteína, na ausência de sal. Por outro lado, Klemaszewsk1 et al. [15] trabalharam com o caseinato de sódio e verificaram que, em pH 7,0 (tampão fosfato), sua EC diminuiu quando a força iônica da solução aumentou de 0,1 para 0,2.

3.3 – Efeito da adição de NaCl sobre o índice de atividade emulsificante

Na Figura 3, observa-se que a adição de sal, ao contrário do obtido para a solubilidade e a EC, diminuiu os valores de EAI da caseína em pH 4,0 e 5,0. Por outro lado, da mesma maneira como observado para a solubilidade e a EC, esse procedimento contribuiu para melhorar o EAI de todos os hidrolisados trípticos, nos dois valores de pH estudados.

FIGURA 3.
Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre o índice de atividade emulsificante da caseína e de seus hidrolisados trípticos. T1, T2, T3, T4, T5: Hidrolisados de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação, respectivamente.

Alguns autores verificaram o efeito da adição de sal sobre o EAI da caseína em diferentes formas. Desta maneira, PEARCE e KINSELLA [23] relataram que a adição de uma concentração equivalente a 1M de NaCl em soluções de caseína (pH 6,5 e 8,0), elevou ligeiramente seu EAI. Entretanto, BARRACHIO e VAN DE VOORT [2] trabalharam com caseína ácida extrusada, caseína extraída de leite em pó desnatado e com caseinato de sódio, e relataram que os valores de EAI diminuíram quando a força iônica passou de 0,05 para 0,3, não tendo sido indicado o pH das soluções.

3.4 –Efeito da adição de NaCl sobre a estabilidade das emulsões

Pelos dados apresentados na Figura 4, observa-se que na presença de NaCl, a ES da caseína não sofreu alterações no pH 4,0, enquanto que no pH 5,0, houve um pequeno aumento. Com relação aos hidrolisados trípticos, no pH 4,0 a adição de NaCl elevou a ES de T3 e T4, não tendo influenciado os resultados obtidos para as outras amostras. No pH 5,0, o efeito benéfico da adição de sal sobre a ES somente foi observado para T2, uma vez que a ES de T1 diminuiu e a dos demais hidrolisados manteve-se inalterada.

FIGURA 4.
Efeito da adição de 0,02 M de NaCl sobre a estabilidade das emulsões de caseína e de seus hidrolisados trípticos. ES = 1/DEAI%x10^3.T1, T2, T3, T4, T5: Hidrolisados de caseína obtido aos 5, 10, 15, 30 e 60 min de reação, respectivamente.

De acordo com DAS e KINSELLA [8], a adição de sal pode levar a uma redução da estabilidade de emulsões óleo/água, nas quais o agente emulsionante é uma proteína. Nessas emulsões, as gotículas de gordura possuem carga elétrica resultante dos grupamentos protéicos ionizados, como também dos íons provenientes da água. Dessa maneira, os íons oriundos do sal se depositam em uma dupla camada, uma vez que o sistema necessita estar eletricamente neutro. Como a densidade de cargas decresce exponencialmente com a distância do centro desse sistema, a adição de quantidade crescente de sal provoca uma redução das forças de repulsão entre as gotículas de gordura que, então, tendem a se aproximar levando à floculação e à perda da estabilidade [8]. Assim, a quantidade de sal adicionada no presente estudo, provavelmente não foi suficiente para produzir esse efeito negativo na ES da caseína.

A influência do sal na ES da caséina, em diferentes formas, foi igualmente estudada por outros autores. Segundo Pearson et al. [24], emulsões formadas pelo caseinato de potássio foram mais estáveis após a adição de KCl (m = 0,3) às soluções, que na ausência de sal. PEARCE e KINSELLA [23] relataram que, em pH 6,5, a adição de NaCl em concentrações acima de 0,1M, aumentou a estabilidade das emulsões formadas pela caseína. Da mesma forma, BARRACHIO e VAN DE Voort [2] verificaram que, quando a força iônica passou de 0,05 para 0,3, houve um aumento na estabilidade de emulsões formadas pela caseína ácida extrusada, pela caseína extraída de leite em pó desnatado e pelo caseinato de sódio, não tendo sido indicado o pH e nem o sal adicionado.

3.5 – Efeito da adição de NaCl sobre o tamanho dos glóbulos de gordura

Observa-se na Tabela 1 que a adição de sal, em pH 4,0 e 5,0, aumentou o tamanho dos glóbulos de gordura das emulsões formadas pela caseína, tendo provocado o efeito contrário, quando os hidrolisados trípticos foram utilizados como agentes emulsificantes.

TABELA 1.
Raio médio dos glóbulos de gordura (R) de emulsões formadas pela caseína e seus hidrolisados trípticos na presença de 0,02 M de NaCl.

pH	Caseína	T1	T2	T3	T4	T5
4,0	2.21 a	1.33 b	0.93 c	0.89 c	1.09 b	0.81 c
5,0	1.83 c	1.18 c	0.89 d	0.88 c	0.99 c	0.82 c

Médias indicadas por letras iguais não diferem significativamente entre si a 5%.

De acordo com DUARTE et al. [9], o tamanho dos glóbulos de gordura (R) se relaciona inversamente com a estabilidade das emulsões. Entretanto, este parâmetro não foi medido, tendo sido feito apenas um cálculo pela equação proposta por PEARCE e KINSELLA [23], visando estabelecer uma correlação aproximada com a estabilidade das emulsões.

Assim sendo, pode-se verificar que, em relação à caseína, essa relação inversa não foi observada, uma vez que a adição de sal levou a um aumento do tamanho dos glóbulos de gordura em ambos os valores de pH, mas não ocorreu a diminuição da ES. Quanto aos hidrolisados trípticos, essa relação inversa foi obtida para T3 e T4, no pH 4,0 e para T2 no pH 5,0.

Finalmente, é importante ressaltar que com relação aos hidrolisados protéicos, não foram encontrados relatos na literatura abordando o efeito da adição de sal sobre a solubilidade, as propriedades emulsificantes e o tamanho dos glóbulos de gordura.

4 — CONCLUSÕES

A adição de NaCl exerceu efeitos variados sobre as propriedades funcionais das amostras analisadas. Assim, no caso da caseína, tanto em pH 4.0 como em pH 5.0, esse procedimento foi vantajoso para a solubilidade, a EC e o tamanho dos glóbulos de gordura, tendo, por outro lado, reduzido o EAI. A presença do sal aumentou ligeiramente a sua ES, apenas no pH 5.0. Quanto aos hidrolisados trípticos, obteve-se efeitos semelhantes ao da caseína no que se refere à solubilidade e à EC, e resultados opostos com relação ao EAI e ao tamanho dos glóbulos de gordura. Em cada pH estudado, o NaCl afetou positivamente a ES de apenas alguns hidrolisados.

5 — REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 — AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à CAPES e ao CNPq, pelo oferecimento de recursos sob a forma de bolsas e à FAPEMIG, pelo apoio financeiro.

² Departamento de Alimentos - Faculdade de Farmácia - UFMG - Av. Olegário Maciel, 2360 - CEP 30180-112 - Belo Horizonte-MG - Tel.: [phone] - Fax: [phone]. E-mail: [e-mail]

^* A quem a correspondência deve ser endereçada

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Recebido para publicação em 26/01/98. Aceito para publicação em 19/08/98. Esse trabalho é parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Maio 1999
• Data do Fascículo
  Ago 1998

Histórico

• Recebido
  26 Jan 1998
• Aceito
  19 Ago 1998