Atividades biológicas e enzimáticas do extrato aquoso de sementes de Caesalpinia ferrea Mart., Leguminosae

Biological and enzymatic activities of aqueous extract of seeds from Caesalpinia ferrea Mart., Leguminosae

ARTIGO

Atividades biológicas e enzimáticas do extrato aquoso de sementes de Caesalpinia ferrea Mart., Leguminosae

Biological and enzymatic activities of aqueous extract of seeds from Caesalpinia ferrea Mart., Leguminosae

Mariana G. Cavalheiro^I; Davi F. Farias^III; Geórgia Sampaio Fernandes^III; Edson P. Nunes^I; Francisca S. Cavalcanti^II; Ilka M. Vasconcelos^III; Vânia M. M. Melo^I; Ana F. U. Carvalho^{I, *}

^IDepartamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará, Av. Humberto Monte, s/n, Pici, 60455-970 Fortaleza-CE, Brasil

^IIDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Universidade Federal do Ceará, Av. Humberto Monte, s/n, Pici, 60455-970 Fortaleza-CE, Brasil

^IIIDepartamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará, Av. Humberto Monte, s/n, Pici, 60455-970 Fortaleza-CE, Brasil

RESUMO

Caesalpinia ferrea Mart. (jucá ou pau-ferro) é uma espécie da família Leguminosae cuja ocorrência estende-se da região Nordeste ao Estado do Rio de Janeiro. Trata-se de uma espécie bastante utilizada na medicina popular pelas suas inúmeras propriedades terapêuticas tais como antiinflamatória, analgésica, antimicrobiana e antitérmica as quais indicam a presença de compostos de interesse farmacológico. Contudo, muitos estudos em plantas também investigam a presença de compostos de interesse industrial. Com base nas propriedades terapêuticas e atividades já descritas para essa espécie, esse trabalho objetivou pesquisar atividades biológicas no extrato de sementes de C. ferrea na busca por compostos de interesse industrial e farmacológico. Os resultados indicaram a presença das atividades celulásica, amilásica, anticoagulante e larvicida contra A. aegypti no extrato aquoso das sementes de C. ferrea, entretanto, não foram observadas as atividades tóxica aguda, hemolítica, heparinásica, antibacteriana e antifúngica.

Unitermos:Caesalpinia ferrea, Leguminosae, atividades biológicas, atividades enzimáticas, sementes.

ABSTRACT

Caesalpinia ferrea Mart. is a species belonging to Leguminosae family commonly known in Brazil as "jucá" or "pau-ferro". It occurs in Brazil from the Northeast Region to the State of Rio de Janeiro and it is widely utilized in folk medicine due to its several therapeutic properties such as anti-inflammatory, analgesic, antimicrobial and antithermic, which indicate the presence of compounds of pharmacological interest. Besides, many studies with plants look for the presence of compounds with industrial applications. Based upon the therapeutic and bioactive properties described for this species so far, this work aimed to investigate several biological activities in the water extract of C. ferrea seeds. The results indicated the presence of the following activities: cellulase, amylase, anticoagulant and larvicide against A. aegypti in the water extract of C. ferrea seeds. Nevertheless, the extract did not show the other activities assayed: acute toxic activity, hemolytic, heparinasic, antibacterial and antifungal activities.

Keywords:Caesalpinia ferrea, Leguminosae, biological activities, enzymatic activities, seeds.

INTRODUÇÃO

Caesalpinia ferrea Mart., popularmente conhecida como jucá ou pau-ferro, é uma espécie que está inserida na família das Leguminosae, uma das maiores famílias dentre as dicotiledôneas com cerca de 650 gêneros, que reúnem mais de dezoito mil espécies (Cronquist, 1981). A subfamília Caesalpinioideae consiste de aproximadamente 150 gêneros e 2200 espécies, distribuídas nas regiões tropicais e subtropicais (Cronquist, 1981). C. ferrea ocorre em toda a região Nordeste, estendendo-se até o Espírito Santo e o Rio de Janeiro, na Floresta Pluvial Atlântica (Braga, 1976). É encontrada em quase todo o Ceará, sendo, porém, mais freqüente na Serra do Araripe, Serra do Apodi, parte leste, oeste e sul do estado (Maia, 2004).

Na medicina popular, são inúmeras as propriedades terapêuticas descritas para C. ferrea, que inclui o uso da entrecasca para o tratamento de feridas, contusões, combate à asma e à tosse crônica (Braga, 1976). Os frutos são antidiarréicos, anticatarrais e cicatrizantes e as raízes são antitérmicas (Maia, 2004). Bacchi & Sertie (1988) descreveram o efeito do extrato aquoso bruto contra úlceras gástricas, além das atividades antiinflamatória e analgésica relatadas por Thomas et al. (1988) e Carvalho et al. (1996). De C. ferrea foram ainda caracterizadas as atividades cardiotônica, antimicrobiana, analgésica e antiinflamatória (Carvalho et al., 1996), antihistamínica, antialérgica, anticoagulante e hepatotóxica (Di Stasi et al., 2002).

Os organismos pertencentes ao reino vegetal são os que têm contribuído de forma mais significativa para o fornecimento de compostos que possuem um largo espectro de propriedades biológicas. Dentre as muitas aplicações dos compostos produzidos pelas plantas, destacam-se as industriais e as farmacológicas. O interesse industrial por tecnologias enzimáticas vem aumentando gradativamente nos últimos anos, principalmente, nas áreas de engenharia de proteínas (Svendsen et al., 1997) e enzimologia (Léon et al., 1998), as quais ampliaram consideravelmente o potencial de aplicação das enzimas como catalisadores em processos industriais (Woolley & Petersen, 1994; Wiseman, 1995). Além disso, tem-se verificado um grande avanço científico envolvendo os estudos químicos e farmacológicos de plantas medicinais que visam obter novos compostos com propriedades terapêuticas (Cechinel Filho & Yunes, 1998).

O objetivo desse trabalho é pesquisar atividades biológicas e enzimáticas no extrato aquoso de sementes de C. ferrea na busca por compostos de interesse industrial e farmacológico.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal

Sementes de C. ferrea foram coletadas no município do Crato-CE, Brasil, em janeiro de 2005. A identificação foi realizada no Herbário Prisco Bezerra (EAC), onde foi incorporada exsicata sob o número 39616. As sementes foram trituradas em liquidificador e em moinho. Peneiras convencionais com malha aproximada de 1 mm² foram utilizadas para obtenção de uma farinha homogênea a qual foi acondicionada em potes plásticos para posterior utilização nos ensaios.

Preparação do extrato aquoso bruto

A farinha foi suspensa em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 com NaCl 0,15M, na proporção de 1:10 (p/v) e deixada sob agitação contínua por 4 h a 4 ºC. As suspensões foram filtradas em pano de trama fina e, em seguida, centrifugadas a 20000x g, por 20 min, a 4 ºC. O precipitado foi descartado e o sobrenadante obtido foi utilizado nos ensaios.

Toxicidade aguda

A avaliação da toxicidade aguda foi realizada através da injeção intraperitonial (0,3 mL.10g^-1 de peso corpóreo) do extrato de C. ferrea em camundongos machos Swiss (n=6), seguindo metodologia descrita por Vasconcelos et al. (1994). A atividade tóxica foi definida como a mortalidade observada 24 h após a injeção intraperitonial e expressa em termos de DL₅₀, que é definida como a quantidade de sólidos solúveis (g sólidos solúveis.kg^-1 de peso corpóreo) capaz de causar morte em 50% dos animais testados. O experimento foi conduzido de acordo com as normas de pesquisa científicas com animais e o protocolo experimental foi analisado e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade Federal do Ceará.

Atividade hemolítica

A atividade hemolítica foi investigada segundo a metodologia descrita por Merker & Levine (1986) e Bernheimer (1988), com algumas modificações. Foram utilizados eritrócitos de rato e de coelho, tratados com enzimas proteolíticas. Uma unidade hemolítica foi definida como a concentração do extrato capaz de produzir 50% de hemólise em suspensão de células a 1% durante 1 h.

Atividade celulásica

A atividade celulásica foi determinada de acordo com a metodologia descrita por Ruegger & Tauk-Tornisielo (2004), com modificações, na qual o extrato bruto de C. ferrea, liofilizado e ressuspenso em 30 µL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 contendo NaCl 0,15M, foi inoculado em placas de Petri contendo ágar (20 g.L^-1) e celulose (10 g.L^-1). Como controle positivo foi utilizado celulase de Aspergillus sp. (EC 3.2.1.4., Sigma-Aldrich Co. USA). Foi utilizada uma solução corante vermelho congo (2,5 g.L^-1 em tampão Tris HCl 0,1 M, pH 8,0) por 30 min, seguida por lavagem com 5 mL de solução de NaCl 0,5 M neste mesmo tampão para revelação da placa. Posteriormente, foi observada a formação de halos claros ao redor dos poços indicativos da degradação da celulose.

Atividade amilásica

A pesquisa de atividade amilásica foi realizada segundo a metodologia descrita por Hankin & Anagnostakis (1975), com modificações. O extrato bruto de C. ferrea foi inoculado em poços nas placas de Petri contendo ágar (20 g.L^-1) e amido (10 g.L^-1). Após incubação a 37 °C por 24 h, as placas foram tratadas com solução de lugol a qual permitiu a visualização de halos claros ao redor dos poços. O controle positivo utilizado foi α-amilase de Aspergillus oryzae (EC 3.2.1.1, Sigma-Aldrich Co. USA) na concentração de 60 UI.mL^-1 em tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 6,9 contendo NaCl 6 mM.

Atividade heparinásica

A pesquisa de atividade heparinásica no extrato bruto de C. ferrea foi realizada segundo a metodologia descrita por Rajaganapathi & Kathiresan (2002), com algumas modificações. Após a prévia incubação do extrato com heparina sódica (500 UI.mL^-1), na proporção 1:1, em temperatura ambiente durante 1 h, a reação foi interrompida por aquecimento a 60 °C por 10 min. Sangue total de rato, 500 µL, foi adicionado e determinado o tempo de coagulação imediatamente após a sua coleta, feita por punção com cânula de vidro no plexo retro-orbital. Solução salina 0,9 % foi utilizada como controle negativo.

Atividade anticoagulante

O ensaio de pesquisa de atividade anticoagulante foi realizado de acordo com a descrição de Rajaganapathi & Kathiresan (2002), com algumas modificações. Sangue total recém-coletado de ratos foi adicionado ao extrato bruto de C. ferrea e a ocorrência ou não de coagulação foi verificada e cronometrada. Solução salina 0,15M foi utilizada como controle negativo e heparina como controle positivo.

Atividade larvicida contra Aedes aegypti L.

Larvas de A. aegypti foram coletadas de uma colônia de mosquitos mantidas no NUVET (Núcleo Controle de Vetores, Secretaria de Saúde do Estado do Ceará). O ensaio foi realizado de acordo com a metodologia descrita pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 2005), com modificações. Vinte larvas de A. aegypti, em terceiro estágio, foram transferidas para copos plásticos descartáveis de 150 mL contendo 25 mL do extrato bruto de C. ferrea (para este ensaio feito em água destilada). O ensaio foi conduzido à temperatura ambiente e fotoperíodo de 12 h. Após 24 h foram registradas as taxas de mortalidade e sobrevivência. Os testes foram realizados em triplicata e água destilada foi usada como controle negativo.

Atividade antibacteriana em meio sólido

A atividade antibacteriana do extrato C. ferrea foi determinada de acordo com o método descrito por Bauer et al. (1966). As bactérias Gram-positivas, Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Bacillus subtilis (ATCC 6633), e Gram-negativas, Enterobacter aerogens (ATCC 13048), Salmonella choleraensis (ATCC 10708), Klebsiella pneumoniae (ATCC 10031) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25619) foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). Discos de papel de filtro com 15 µL do extrato bruto estéril foram colocados sobre placas de ágar Mueller-Hinton.contendo culturas das bactérias na concentração de 10⁷ UFC.mL^-1. As placas foram incubadas a 37 °C por 24 h. Tetraciclina foi utilizada como controle positivo e o tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0 com NaCl 15 0,15M como controle negativo. A inibição do crescimento microbiano foi avaliada pela formação de halos de inibição ao redor dos discos.

Atividade antifúngica em meio sólido

O ensaio de atividade antifúngica foi realizado de acordo com o método descrito por Roberts & e Selitrennikoff (1990), com modificações. Os fungos Aspergillus niger, Colletotrichium lindemuthianum, C. truncatum, Fusarium oxysporum, F. Solani, F. pallidoroseum, Mucor sp., Neurospora sp., Penicillium herguei, Phomopsis sp., Phytium oligandrum, Rhizoctonia solani e Thricoderma viridae foram obtidos no Laboratório de Microbiologia e Imunologia da Universidade Federal do Ceará. Discos de papel de filtro (2 cm de diâmetro) com 300 µL do extrato estéril de C. ferrea foram colocados sobre placas de Petri contendo ágar-batata e o micélio dos fungos recentemente repicados. As placas foram incubadas em câmaras de crescimento com fotoperíodo de 12 h até o crescimento restante dos fungos em presença do extrato. A formação de halos ao redor dos discos indicou inibição do crescimento fúngico. Nistatina (100000 UI.mL^-1, EMS, São Paulo) foi utilizada como controle positivo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados obtidos para as atividades biológicas e enzimáticas do extrato aquoso de sementes de C. ferrea estão sumarizados na Tabela 1.

O extrato bruto das sementes C. ferrea não apresentou toxicidade aguda em camundongos mesmo quando administrada a dose máxima (0,3 mL.10g^-1 de peso corpóreo). Também não foram observados perda de peso, mudanças de comportamento, diarréia ou quaisquer outras alterações. O extrato também não causou hemólise em eritrócitos de rato e coelho embora tenha sido relatada, para essa espécie, a presença de compostos conhecidos por serem responsáveis pela atividade hemolítica, tais como compostos fenólicos e saponinas. De acordo com Almeida et al. (2005), o extrato etanólico de frutos de C. ferrea contém taninos e fenóis, os quais são capazes de promover hemólise por meio da oxidação da hemoglobina (Eyer et al., 1975; Bukowska & Kowalska, 2004). As saponinas são também conhecidas por apresentarem propriedade hemolítica in vitro (Cheeke, 1998; Pizarroet al., 1999; Lee et al., 2001) e, segundo Carvalho (1993), as saponinas estão presentes no extrato aquoso bruto dos frutos de C ferrea. Apesar de relatada a presença de compostos fenólicos e saponinas no extrato de frutos, a concentração desses compostos nas sementes não foi suficiente para causar hemólise dos eritrócitos.

A atividade celulásica foi detectada para o extrato de C. ferrea. A capacidade do extrato de jucá de degradar a celulose sugere a presença de microorganismos endofíticos na semente, onde normalmente essas enzimas são encontradas. Segundo Carrim et al. (2006), poucos trabalhos existem enfocando o isolamento de microorganismos endofíticos. Dessa forma, eles podem representar um novo recurso na obtenção de mais enzimas com diferentes potencialidades. Assim, se estudos mais aprofundados com o objetivo de comprovar e isolar microorganismos do interior da semente de C. ferrea forem realizados, bem como o isolamento do princípio ativo capaz de degradar a celulose pode-se propor, então, um novo material para aplicação na indústria biotecnológica, uma vez que a enzima celulase é largamente utilizada nas indústrias têxteis, de detergentes e indústrias alimentícias, dentre outras (Nielsen & Oxenbøll 1998).

A atividade amilásica foi detectada no extrato da semente de C. ferrea. Duas hipóteses poderiam explicar sua capacidade de degradação do amido. A primeira seria a de que a semente possui, em seu interior, enzimas amilolíticas que estejam relacionadas ao processo de mobilização de nutrientes para germinação da semente. Essa hipótese pode ser apoiada por muitos estudos que reportam a presença de alfa-amilase em algumas sementes de leguminosas (Kohno & Nanmori, 1991; Yamamoto, 1995; Mar et al., 2003). Chen et al. (1998) analisaram o acúmulo de carboidratos em sementes de soja avaliando a atividade da alfa-amilase dessas sementes. Minamikawa (1979) também relatou a atividade amilolítica em cotilédones de uma leguminosa do gênero Vigna, em processo de germinação, além de obter uma preparação pura de alfa-amilase (Koshiba e Minamikawa, 1981). A outra hipótese seria a presença de microorganismos endofíticos no interior da semente de C. ferrea que sejam capazes de degradar o amido. Assim, o jucá pode ser uma nova alternativa na busca por princípios ativos de interesse da indústria biotecnológica, como citado anteriormente.

O extrato de C. ferrea não apresentou atividade heparinásica. Durante um período de aproximadamente 30 min, o extrato apresentou atividade anticoagulante, embora não tenha persistido. Di Stasi et al. (2002) relataram a presença de atividade anticoagulante para a espécie C. ferrea, porém, não foi descrita a parte da planta utilizada para a detecção de tal atividade. Um estudo mais profundo sobre qual substância conferiu a capacidade desse extrato de não permitir a coagulação do sangue por breve tempo pode revelar algum composto de interesse farmacológico relacionado aos estudos de coagulação sangüínea.

Em menos de 24 h, o extrato das sementes de C. ferrea apresentou atividade larvicida contra A. aegypti com 85% de mortalidade, bem superior à taxa de 10% encontrada com extrato etanólico das folhas de C. ferrea (Luna et al., 2005). Assim, o extrato aquoso das sementes desta planta apresenta potencial de utilização no combate ao desenvolvimento do mosquito transmissor da dengue e febre amarela.

Os resultados dos ensaios de atividade antibacteriana em meio sólido mostraram que o extrato de C. ferrea não inibiu o crescimento de nenhuma das cepas bacterianas analisadas. Embora tenha sido comprovada a atividade antibacteriana (Saeed & Sabir, 2002; Aqil & Ahmad, 2003; Woldemichael et al., 2003) e antifúngica (Saeed & Sabir, 2002; Aqil & Ahmad, 2003) de sementes de algumas espécies do gênero Caesalpinia, para a espécie C. ferrea, até o presente momento, só foram relatadas atividade antimicrobiana do extrato e de frações obtidas a partir do caule (Frasson, 2002) e dos frutos (Carvalho et al., 1996). Em relação à atividade antifúngica, o extrato de C. ferrea não inibiu o crescimento de nenhum dos fungos estudados. Muitos autores descreveram atividade antifúngica de extratos de várias partes de espécies do gênero Caesalpinia (Aqil & Ahmad, 2003; Sudhakar et al., 2006; Cruz et al., 2007), entretanto, até o presente momento, nenhum estudo relata a atividade antifúngica de extratos de sementes de C. ferrea.

Os resultados obtidos demonstram que o extrato de sementes de C. ferrea não apresenta atividade tóxica aguda, hemolítica, heparinásica, antibacteriana e antifúngica, entretanto, apresenta atividades celulásica, amilásica, anticoagulante e larvicida contra A. aegypti, atividades essas indicativas da presença de compostos bioativos de interesse farmacológico e/ou industrial. Estudos posteriores fazem-se necessários para identificação e purificação de tais compostos.

Received 2 June 2008; Accepted 20 May 2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Nov 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Recebido
  02 Jun 2008
• Aceito
  20 Maio 2009