Painel molecular para detecção de microrganismos associados à sepse

Resumos

INTRODUCTION: Sepsis is a systemic inflammatory response related to high mortality rates in the hospital environment. Delayed etiological diagnosis and inadequate antimicrobial therapy are associated with treatment failures. Molecular tests based on polymerase chain reaction are regarded as faster and more accurate procedures than culture techniques for microbial identification, providing a higher rate of therapeutic success. OBJECTIVE: To develop a panel of primers for DNA fragments of sepsis-related microorganisms. METHODS: Primers for amplification of Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus and Candida spp. were designed and tested for sensitivity and specificity on the basis of their respective standard strains. RESULTS: The intended specificity was obtained for P. aeruginosa, S. aureus and Candida spp primers. Sensitivity tests showed a threshold for detection from 5 ng to 500 fg in blood samples contaminated with microbial DNA. CONCLUSIONS: The molecular panel presented offers the advantage of a flexible 'open' system when compared to other multiplex detection methods.

Molecular diagnostic techniques; Polymerase chain reaction; Sepsis; DNA primers; Nucleic acid amplification techniques

ARTIGO ORIGINAL

Painel molecular para detecção de microrganismos associados à sepse

Leslie Ecker Ferreira^I; Karilene Dalposso^III; Bruna Barbosa Hackbarth^III; Anderson R. Gonçalves^II; Glauco Adrieno Westphal^II; Paulo Henrique Condeixa de França^I; Mauro de Souza Leite Pinho^I

^IPrograma de Pós-graduação em Saúde e Meio Ambiente da Universidade da Região de Joinville – UNIVILLE - Joinville (SC), Brasil

^IIDepartamento de Medicina da Universidade da Região de Joinville– UNIVILLE - Joinville (SC), Brasil

^IIIDepartamento de Farmácia da Universidade da Região de Joinville– UNIVILLE - Joinville (SC), Brasil

^{Autor correspondente}

RESUMO

INTRODUÇÃO: A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica relacionada com altas taxas de mortalidade no meio hospitalar. O diagnóstico etiológico tardio e terapia antimicrobiana inadequada se associam a falhas do tratamento. Exames moleculares baseados na reação em cadeia da polimerase são considerados métodos mais rápidos e precisos do que técnicas de hemocultura para identificação microbiana, proporcionando uma taxa mais elevada de sucesso terapêutico.

OBJETIVO: Desenvolver um painel de seqüências iniciadoras (primers) para fragmentos de DNA de microrganismos associados à sepse.

MÉTODOS: Seqüências iniciadoras para amplificação de Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida spp. foram desenvolvidos e testados quanto a sensibilidade e especificidade com base em suas respectivas cepas padrão.

RESULTADOS: A especificidade pretendida foi obtida para os primers de P. aeruginosa, S. aureus e Candida spp. O teste de sensibilidade mostrou um limite de detecção de 5 ng a 500 fg em amostras de sangue contaminado com DNA microbiano.

CONCLUSÕES: O painel molecular apresentado oferece a vantagem de constituir um sistema flexível "aberto" em comparação a outros métodos de detecção múltipla.

Descritores: Técnicas de diagnóstico molecular; Reação em cadeia da polimerase; Sepse; Primers de DNA/diagnóstico; Técnicas de amplificação de ácido nucleico

INTRODUÇÃO

Estima-se que ocorram no Brasil 400.000 casos de sepse grave por ano, que demandam 17% dos leitos disponíveis em unidades de terapia intensiva.⁽¹⁾ A confirmação do diagnóstico depende de exames microbiológicos baseados em hemoculturas que, em geral, exigem 24 a 72 horas.⁽²⁾ Assim, na maioria dos casos, a terapia antibiótica é iniciada com base em critérios clínicos. Regimes terapêuticos antimicrobianos inadequados se associam com o surgimento de cepas resistentes, aumento dos custos do tratamento e das taxas de mortalidade, especialmente em pacientes em condições críticas.⁽³⁾ Apesar disto, recomenda-se que uma terapia antimicrobiana adequada deva ser iniciada o mais precocemente possível, pois cada hora de atraso resulta em um aumento de 7,6% na mortalidade.⁽⁴⁾

Ensaios moleculares com o uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) são importantes ferramentas para a detecção de microrganismos e podem contribuir para o diagnóstico precoce com alta sensibilidade, mesmo quando os alvos estão presentes em quantidades extremamente baixas (10 a 100 cópias de DNA).⁽⁵⁾ As investigações de microrganismos com uso da PCR tem sido exploradas com siste mas de detecção múltipla conhecidos como Multiplex-PCR. Esta técnica é baseada na amplificação de segmentos distintos de DNA empregando-se dois ou mais pares de primes em um único tubo de reação, o que, por sua vez, geralmente significa custos mais baixos e redução de tempo. A termodinâmica da Multiplex-PCR exige um equilíbrio complexo entre parâmetros como concentrações de sais, primers e DNA polimerase, temperaturas compatíveis para o annealing dos primers, resultando em um desenho experimental laborioso.^(6,7) Além dis-to, os sistemas Multiplex-PCR tem demonstrado uma menor sensibilidade quando comparados às reações individuais com os pares de primers correspondentes isolados.⁽⁸⁾

Por outro lado, painéis moleculares são considerados uma alternativa menos complexa ao Multiplex-PCR. Nessa técnica utiliza-se dois ou mais pares de primers, planejados para distintos loci, e são realizados em tubos separados sob condições termodinâmicas iguais. Pares adicionais de primers tendo como alvo outros loci podem ser eventualmente incluídos, sem necessidade de redefinir os parâmetros da reação.⁽⁹⁾

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e padronizar um painel de primers para amplificação via PCR de fragmentos específicos de DNA de microrganismos associados à sepse, segundo um protocolo único, para um diagnóstico confirmatório mais rápido.

MÉTODOS

Todos os procedimentos adotados neste estudo foramaprovados pelo Comitê de Ética da Universidade da Região de Joinville – UNIVILLE.

Desenho dos primers

Um painel de primers para PCR foi desenvolvido para a detecção de cinco microrganismos associados à sepse, sendo: Enterobacter spp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Candida spp. Uma série de sequências nucleotídicas de cada microrganismo foi selecionada a partir da base de dados GenBank, relativas ao gene 23S rRNA para P. aeruginosa, Enterobacter spp. e S. aureus e ao gene 18S rRNA para Candida spp. Para cada conjunto específico, foi gerada uma sequência consensual por meio do programa ClustalW®.⁽¹⁰⁾ Estas foram submetidas ao programa Visual OMP® ⁽¹¹⁾ para simular um conjunto de primers para amplificação simultânea. Os múltiplos oligonucleotídeos foram então testados in silico com relação à especificidade com a ferramenta BLAST contra todas as sequências nucleotídicas disponíveis no GenBank.⁽¹²⁾ Semelhantemente, o gene LacZ foi definido para os primers pretendidos para identificação de Escherichia coli utilizando o programa PRIMER3^®.⁽¹³⁾

Microrganismos

Cepas de referência de Candida albicans (ATCC 10231), Candida krusei (ATCC 6258), Candida parapsilosis (ATCC 22019), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Staphylococcus aureus (ATCC 6538) foram adquiridas da Coleção de Cultura Tropical da Fundação André Tosello.

Extração de DNA

Foi aplicado o kit Qiamp DNA Mini Kit ^® (Qiagen, Hilden, Alemanha) para extração de DNA das cepas mantidas em meio sólido ou presentes em amostras de sangue humano. As extrações de DNA de cepas de Candida foram precedidas por ruptura celular com esferas de vidro. As avaliações qualitativas e quantitativas do DNA extraído foram realizadas via mensurações espectrofotométricas.

Reação em cadeia da polimerase

As reações foram realizadas em um volume definido de 50 μL e incluíram 50 - 500 ng de DNA, 1 U Taq DNA polimerase (LGC Biotecnologia, São Paulo, Brasil), 200 mM dNTP's (GE Healthcare, Little Chalfont, Reino Unido), 1 - 2 mM MgCl₂ (LGC Biotecnologia), 10X PCR Buffer (LGC Biotecnologia), e 20 pmol de cada primer (Invitrogen, São Paulo, Brasil). Para o estabelecimento de uma temperatura de annealing ótima e comum a todos os pares de primers, as reações individuais foram testadas em gradientes de temperatura variável entre 40ºC e 60ºC, segundo a disposição dos tubos no aparelho de termociclagem (LGC XP thermocycler - BIOER Technology Co., Tóquio, Japão). A desnaturação inicial foi realizada a 94ºC por 3 minutos, seguida por 40 ciclos incluindo três passos consecutivos de 45 segundos a 94ºC, 50ºC e 72ºC. Uma fase de extensão a 72ºC por 10 minutos finalizou o ciclo de amplificação. Os produtos obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1%, corados com brometo de etídio (0,5 μg/mL) para análise via exposição à luz UV e digitalizados em sistema de fotodocumentação (MiniBis-Pro photodocumentation system - DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Jerusalém, Israel).

Testes de sensibilidade

Testes de sensibilidade foram realizados empregando-se diluições seriadas do DNA genômico extraído de amostras de sangue humano contaminadas artificialmente pelas cepas microbianas acima mencionadas.

Testes de especificidade

Testes de especificidade foram realizados empregando-se DNA extraído de amostras de sangue (DNA humano) ou culturas puras (DNA de microrganismos incluídos ou não no painel (vide também extração de DNA).

RESULTADOS

A análise de múltiplas sequências de oligonucleotídeos sugeridas pelo programa Visual OMP^® resultou em um painel de quatro pares de primers compatíveis para amplificação dos respectivos microrganismos no mesmo protocolo de termociclagem. Como os primers para Enterobacter spp. mostraram amplificação cruzada com E. coli, foi desenvolvido um par adicional de primers baseados no gene LacZ de E. coli para diagnóstico diferencial em uma reação separada, quando necessário. Esses primers geraram produtos de 526 bp (Enterobacter spp.), 430 bp (Candida spp.), 407 bp (E. coli), 377 bp (P. aeruginosa), e 198 bp (S. aureus) (Tabela 1).

A análise das reações com o emprego de gradientes de temperatura para todos os pares de primers forneceu uma temperatura de annealing consensual de 50ºC (Figura 1). Para a reação de diferenciação adicional entre Enterobacter spp. e E. coli foi empregada a temperatura de annealing a 60ºC.

Os testes de sensibilidade demostraram um limite mínimo para detecção de DNA microbiano de 5 ng (Enterobacter spp.), 5 pg (Candida spp., E. coli, P. aeruginosa) e 500 fg (S. aureus) (Figura 2). Resultados satisfatórios de especifidade foram obtidos com todos os pares de primers quando comparados a DNA microbiano divergente e DNA humano (Figura 3), exceto pela reação cruzada Enterobacter spp. – E. coli mencionada acima.

DISCUSSÃO

Como os procedimentos diagnósticos confirmatórios atuais para sepse exigem um período de 24 a 72 horas para confirmação da etiologia de uma infecção e identificação do patógeno, a terapia antibiótica é, em geral, iniciada com uma base empírica.⁽²⁾

Entretanto, estudos comparando hemoculturas e testes moleculares para a detecção de microrganismos associados à sepse tem destacado um diagnóstico significativamente mais rápido quando empregando técnicas baseadas na PCR.^(14-16)

O tempo necessário para diagnóstico microbiológico específico utilizando o painel molecular desenvolvido no presente estudo é de cerca de 6 horas, exceto no caso de positividade para Enterobacter spp., quando é necessário um procedimento adicional de 2 horas para diferenciar de E. coli. Também deve ser considerado que o painel desenvolvido inclui a detecção de Candida spp., tendo em vista a dificuldade de romper as células fúngicas para extração de DNA genômico.⁽¹⁷⁾

Considerando a alta sensibilidade dos métodos de detecção baseados em PCR, devem ser adicionadas certas medidas para impedir resultados falsos positivos. Estas medidas incluem controles internos utilizando primers não específicos baseados em sequências conservadas de nucleotídeos de diferentes espécies e protocolos estritamente seguros para extração e amplificação de DNA.⁽¹⁸⁾

Outros estudos propuseram métodos diferentes de procedimentos diagnósticos baseados em PCR.^(19-21) Por exemplo, foi proposta uma estratégia molecular para detectar 62 patógenos por meio de PCR seguido de hibridização,⁽²²⁾ entretanto, esta abordagem não envolve a diferenciação dos microrganismos. Neste contexto, sistemas de detecção em larga escala, utilizando microarrays altamente sensíveis e métodos de PCR foram utilizados para identificar 800 genes de microrganismos relacionados à sepse;⁽²³⁾ porém, o valor clínico da técnica é comprometido pela complexidade intrínseca e altos custos.

Em um estudo recente,⁽⁹⁾ um conjunto de primers foi apresentado para detecção dos cinco microrganismos mais prevalentes em culturas de sangue, sugerindo que painéis moleculares demonstram uma maior sensibilidade e são mais rápidos do que as hemoculturas. Mais ainda, métodos rápidos e sensíveis baseados em painéis moleculares para a identificação de patógenos bacterianos e fúngicos causadores de sepse diretamente a partir das amostras de sangue parecem promissores para um refinamento antecipado da terapia antibiótica empírica.⁽¹⁵⁾

CONCLUSÃO

Em comparação a sistemas convencionais de detecção múltipla, onde todos os primers são incluídos em um único kit de reação "fechado", o painel molecular oferece a vantagem adicional de um sistema "aberto", onde primers objetivando outros microrganismos podem ser adicionados a um único protocolo de reação de PCR, sem interferir no tempo de diagnóstico.

Concluímos que o painel molecular desenvolvido é um método confiável para a detecção de microrganismos relacionados à sepse e mais estudos devem ser feitos para avaliar seu papel em condições clínicas.

AGRADECIMENTOS

Este estudo foi apoiado por verbas da FAPESC (Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Santa Catarina) e FAP-UNIVILLE (Fundo Apoio à Pesquisa da Universidade da Região de Joinville). Agradecemos também a Carmen Diamantina Teixeira Heyder e Roseneide Campos Deglmann por seu apoio técnico.

Submetido em 1 de dezembro de 2010

Aceito em 10 de março de 2011

Conflitos de interesse: Nenhum.

Apoio financeiro: Universidade da Região de Joinville e Fundação para Apoio à Pesquisa Científica e Tecnológica do Estado de Santa Catarina.

Trabalho realizado na Universidade da Região de Joinville – UNIVILLE - Joinville (SC), Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Maio 2011
• Data do Fascículo
  Mar 2011

Histórico

• Recebido
  01 Dez 2010
• Aceito
  10 Fev 2011