Susceptibilidade de larvas de Cerotoma arcuata Olivier (Coleoptera: Chrysomelidae) a Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin e Bacillus thuringiensis Berliner

Susceptibility of Cerotoma arcuata Olivier (Coleoptera: Chrysomelidae) larvae to Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin and Bacillus thuringiensis Berliner

ARTIGOS CIENTÍFICOS

DEFESA FITOSSANITÁRIA

Susceptibilidade de larvas de Cerotoma arcuata Olivier (Coleoptera: Chrysomelidae) a Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin e Bacillus thuringiensis Berliner

Susceptibility of Cerotoma arcuata Olivier (Coleoptera: Chrysomelidae) larvae to Beauveria bassiana (Bals.) Vuillemin, Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorokin and Bacillus thuringiensis Berliner

Maria Lucia França Teixeira^I; Avílio Antonio Franco^II

^ILaboratório de Fitossanidade, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Rua Jardim Botânico, 1008, 22460-170, Rio de Janeiro, RJ, Brasil. E-mail: [e-mail]

^IILaboratório de Leguminosas, Embrapa Agrobiologia, Seropédica, RJ, Brasil

RESUMO

Larvas de 2° instar de Cerotoma arcuata foram avaliadas em relação à susceptibilidade aos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e a bactéria Bacillus thuringiensis com as toxinas Cry3. Os insetos adultos foram mantidos em gaiolas e alimentados com plântulas de feijão (Phaseolus vulgaris L.) e as larvas em “gerbox” com cotilédones de plântulas de feijão recém-germinadas. Das oito estirpes de B. bassiana avaliadas, CG 156 e CG 213 causaram 100% de mortalidade das larvas, as duas estirpes de M. anisopliae CG 210 e CG 321 foram patogênicas, eliminando 80 e 100% das larvas de C. arcuata, e, das cinco estirpes de B. thuringiensis testadas, o isolado CG 940 causou 70% de mortalidade das larvas.

Palavras-chave: vaquinha, fungos entomopatogênicos, ä-endotoxina, controle biológico.

ABSTRACT

Second instar larvae of Cerotoma arcuata were evaluated concerning the susceptibility to fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae and Bacillus thuringiensis strains containing Cry3 toxin. Adults of C. arcuata were kept in large cages and fed on bean seedlings and the larvae were reared in ‘gearbox’ feeding on germinated Phaseolus bean cotyledons. Strains CG 156 and CG 213 of B. bassiana killed 100% of the insect larvae and strains CG 210 and CG 321 of M. anisopliae killed 80 and 100% of the insect larvae. Strain CG 940 of B. thuringiensis killed 70% of the insect larvae.

Key words: bean leaf beetle, entomopathogenic fungi, ä-endotoxin, biological control.

INTRODUÇÃO

Cerotoma arcuata Olivier é um crisomelídeo desfolhador de leguminosas comestíveis como soja (Glycine max (L.) Merril), feijão (Phaseolus vulgaris L.) e caupi (Vigna unguiculata (L.) Walp.). Devido à desfolha e à redução da capacidade fotossintética provocada pelos adultos, menos importância é dada aos danos causados por sua fase larval. Entretanto, as larvas do inseto alimentam-se de sementes em germinação, nódulos, raízes e da região do coleto (QUINTELA et al., 1991), podendo causar o tombamento e a morte de plântulas e, assim como os adultos, transmitir microorganismos fitopatogênicos, como o vírus do mosaico severo do caupi (SALAS et al., 1999). Quando a cultura obtém o nitrogênio através da simbiose com o rizóbio, comum em leguminosas, os danos se tornam mais graves. Larvas de C. arcuata, ao destruírem os nódulos onde a fixação biológica ocorre, acarretam perdas de até 25% na produção de grãos de feijoeiro no campo (TEIXEIRA, 1993) e de 45% em casa de vegetação (TEIXEIRA et al. ,1996). Em soja no campo, larvas de C. trifurcata (Förster) provocaram a redução de até 45% na fixação de N₂ (LAYTON, 1983). Em casa-de-vegetação, parâmetros relativos à fixação biológica de nitrogênio e ao crescimento foram reduzidos pela infestação de 30 larvas de C. arcuatus Olivier por planta (NAVA et al., 2003).

O controle biológico de C. arcuata pela susceptibilidade a microorganismos ocorre naturalmente, quando os fatores ambientais são favoráveis. Nestas ocasiões, estirpes de fungos entomopatogênicos como B. bassiana (Bals.) Vuillemin podem ser isoladas de adultos de C. arcuata encontrados em plantações, como conduzido por YagInuma et al. (1994) em soja no Cerrrado.

Por meio de bioensaios com B. bassiana, LORD et al. (1987) verificaram que, apesar de o fungo ter sido letal ao adulto, o patógeno não contribuiu para a diminuição significativa da redução dos danos causados pelo inseto, assim como da oviposição e da viabilidade dos ovos. Por outro lado, devido à importância dos danos provocados pelas larvas do inseto, foi realizada tentativa de controle no solo e em sementes, utilizando-se conídios de B. bassiana e M. anisopliae (Metsch.) Sorokin (SÁ et al., 1989; QUINTELA et al., 1990), apresentando, nesse estágio, alta susceptibilidade aos patógenos.

A família Chrysomelidae possui várias espécies de coleópteros susceptíveis à bactéria B. thuringiensis Berliner, destacando-se: Leptinotarsa decemlineata (Say) (COOPER, et al., 2004) e Diabrotica virgifera virgifera Le conte. (MOELLENBECK et al., 2001). A associação do fungo B. bassiana e da bactéria B. thuringiensis tem sido testada contra vários insetos, geralmente sem interação significativa (KRIEG, 1971). Isoladamente, a bactéria B. thuringiensis foi utilizada com sucesso no controle da infestação por adultos e larvas de C. ruficornis Olivier na cultura de batata (Solanum tuberosum L.), com taxa de mortalidade de até 100% após 72 horas (AMBANG et al., 2002).

O presente trabalho teve como objetivo avaliar em laboratório a susceptibilidade de larvas de 2° instar de C. arcuata às estirpes de B. bassiana, M. anisopliae e B. thuringiensis isoladas de Cerotoma sp. e/ou de outros crisomelídeos.

MATERIAL E MÉTODOS

Adultos de C. arcuata coletados manualmente em lavoura de feijão localizada no Campo Experimental da Embrapa-Agrobiologia foram dispostos em gaiolas confeccionadas em madeira e tela de “nylon”, em ambiente sob temperatura de 26 + 1°C, fotofase de 14 horas e umidade relativa (UR) de 70 + 20%.

Os insetos foram alimentados com plantas de feijão P. vulgaris cv. “Carioca 80” crescidas em copos com vermiculita estéril por quinze dias e posteriormente transferidas para tubos de ensaio com água, onde foram fixadas com algodão na altura dos caules e trocadas semanalmente, evitando a reposição diária de folhas (CARDONA et al., 1982; RAJNAUTH et al., 1987; HEINECK & CORSEUIL, 1995).

Como substrato para postura dos insetos, utilizou-se vermiculita estéril em placas de Petri revestidas por tecido preto, fino, do tipo “nylon” (ABREU NETO, 1999), para impedir a passagem dos ovos para a vermiculita, que foi mantida úmida para evitar o ressecamento desses ovos. Os tubos foram inclinados sobre as placas, de modo que a parte aérea das plântulas recobrisse toda a região de postura.

Os ovos foram retirados diariamente com o auxílio de um pincel, individualizados e transferidos para placas de Petri contendo duas camadas de papel de filtro umedecido, que permaneceram em ambiente sob temperatura de 27 + 1°C, fotofase de 14 horas e UR de 70 + 20%.

Avaliou-se o número de dias decorridos para a eclosão das larvas. As larvas neonatas foram transferidas com o auxílio de um pincel para caixas do tipo “gerbox”, contendo papel de filtro úmido e feijão pré-germinado, sendo colocadas duas larvas por plântula, uma em cada cotilédone sem a casca.

As sementes de feijão foram previamente desinfestadas com uma solução de hipoclorito de sódio 1% e pré-germinadas durante seis dias em papel de germinação, em câmara incubadora. Os recipientes permaneceram tampados, em temperatura de 26 + 1°C e UR de 70 + 20% em ausência de luz, simulando o ambiente natural das larvas no interior do solo, junto ao sistema radicular.

Para a medição do pH intestinal, importante para a ação das toxinas de B. thuringiensis, utilizaram-se larvas de C. arcuata de 10 dias de idade. As mesmas larvas foram colocadas sobre lâminas de vidro, e submetidas a choque elétrico de 10 volts, utilizando-se um potenciômetro (Powerstar). Os eletrodos foram colocados sobre as porções central e final das larvas e, após a regurgitação, o líquido foi diluído em uma gota de água deionizada, sendo o seu pH medido com o auxílio de fita indicadora da marca Merck (SILVA-WERNECK et al. ,1995).

Testes de patogenicidade

As estirpes de B. bassiana CG 218, CG 224 e as de M. anisopliae CG 210 e CG 321 foram isoladas de C. arcuata. As estirpes de B. bassiana CG 61, CG 79, CG 156, CG 213, CG 225 e CG 253 de outros coleópteros da família Chrysomelidae foram todas provenientes da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Os isolados estocados em tubos de ensaio em meio BDA (batata-dextrose-ágar) foram repicados, suspensos em 1ml de água estéril e inoculados separadamente em erlenmeyers de 250 ml, contendo 50g de arroz branco parboilizado e autoclavado com 30ml de água destilada por 30 minutos. Posteriormente, foram mantidos em câmara em temperatura de 26 + 1°C e fotofase de 12 horas por quatorze dias. Após o crescimento dos fungos, para separá-los do substrato, lavou-se o arroz com uma solução de água estéril de volume conhecido, contendo 0,1% de Tween 80^®, posteriormente filtrada em gaze estéril. Para calcular a concentração de conídios, uma amostra de cada suspensão foi diluída, seguindo-se a contagem direta em microscópio óptico com auxílio de uma câmara de Neubauer (ALVES & MORAES, 1998). Para a viabilidade de conídios, cada amostra de suspensão foi diluída até a concentração de 108 conídios ml^-1, utilizando-se dez microlitros para incubação em placas com meio BDA, a 27+1°C por 18 horas. A contagem de esporos germinados foi feita através de leitura em microscópio óptico (ALVES & MORAES, 1998), garantindo uma concentração mínima de 10¹⁰ conídios ml^-1 e viabilidade acima de 92%.

Cada copo do tipo “coletor universal”, com fundo revestido de papel de filtro e autoclavado, recebeu duas plântulas de feijão recém-germinado, com uma larva de 2° instar por planta, sobre os cotilédones. Sobre as plântulas e as larvas, aspergiu-se, por meio de uma pipeta Pasteur com pêra, 1ml da suspensão e, para a testemunha, utilizou-se água destilada. Os copos foram fechados e mantidos a 27+1°C, UR de 70% em ausência de luz, e avaliados após sete dias. Para cada tratamento com B. bassiana, foram realizadas cinco repetições e com M. anisopliae quatro repetições, sendo cada copo uma repetição.

Foram utilizadas quatro estirpes de B. thuringiensis CG 904, CG 940, CG 946 e CG 948 provenientes da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, selecionadas entre 50 estirpes através da técnica PCR (polymerase chain reaction), para identificação de duas subclasses de genes cry: cry3A e cry3B, ambas tóxicas para coleópteros (MARQUEZ, 1996). A estirpe CG 948 contém a proteína Cry3A, e as demais estirpes contém a proteína Cry3, mas não estão incluídas nas subclasses A ou B.

As estirpes foram repicadas de tubos de ensaio inclinados com meio Ágar Nutritivo para erlenmeyers de 250 ml contendo 50 ml de meio Caldo Nutritivo (ALVES, 1998). A seguir, os erlenmeyers foram incubados em “shaker” a 200 rpm / 30°C / 48 horas, quando foram feitas lâminas a fresco, e também lâminas coradas com Amido Black e/ou Coomassie Blue, para facilitar a visualização dos cristais. As lâminas foram observadas em microscópio óptico com e sem contraste de fase para verificar se as estirpes apresentavam grande quantidade de cristais e esporos e se havia contaminantes. Para o cálculo da concentração de esporos, uma amostra de cada suspensão foi diluída, seguindo-se a contagem direta em microscópio óptico com auxílio de uma câmara de Neubauer, assegurando o mínimo de 1010 esporos viáveis ml^-1.

Cada copo do tipo “coletor universal”, com fundo revestido de papel de filtro e autoclavado, recebeu duas plântulas de feijão recém-germinado. As plântulas foram previamente imersas nas suspensões por uma hora e a testemunha em caldo nutritivo puro e receberam uma larva de 2° instar por planta, sobre os cotilédones. Os copos foram fechados e estocados a 27+1°C, UR de 70% e ausência de luz, e avaliados após sete dias. Para cada tratamento, utilizaram-se cinco repetições com dois indivíduos.

Os insetos mortos durante os experimentos por M. anisopliae e B. bassiana foram colocados em frascos individuais, mantidos em estufa a 27+1°C e examinados diariamente para avaliar a presença de micélio e a esporulação. Os insetos mortos no experimento com B. thuringiensis foram lavados em água estéril antes da retirada de uma porção da hemolinfa, que foi diluída em 1 ml de água estéril para verificação de esporos e cristais em microscópio (ALVES, 1998).

Os dados de porcentagem de mortalidade foram transformados para antes da análise estatística. A análise estatística constou de análise de variância seguida de comparação de médias pelo Teste de Tukey (p = 0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O sistema de criação de C. arcuata foi eficiente para produzir larvas de 2° instar em quantidade suficiente para serem utilizadas nos bioensaios. O período de incubação de ovos foi de cinco a nove dias, em que maior porcentagem de eclosão de larvas tendeu a ser no sétimo dia, com uma média de 64,5%, na mesma faixa observada por HEINECK & CORSEUIL (1995) e RAJNAUTH et al. (1987).

Foram obtidos nos bioensaios altos níveis de mortalidade pela inoculação com estirpes dos fungos, confirmada pelo crescimento de micélio e esporulação após a morte dos insetos (Figuras 1 e 2). Dentre os oito isolados de B. bassiana avaliados, as estirpes CG 156, CG 213 foram eficientes no controle de larvas de C. arcuata, eliminando 100% das larvas. As estirpes CG 79, CG 61, CG 224, CG 218, CG 225 e CG 253, apesar de eliminarem de 50 até 87,5% das larvas, não diferiram significativamente da testemunha (Figura 1). As duas estirpes de M. anisopliae CG 210 e CG 321 eliminaram 80 e 100% das larvas de C. arcuata, respectivamente, sendo a fase larval do inseto susceptível a ambas (Figura 2). A aplicação no solo e em sementes do conjunto de estirpes de B. bassiana e M. anisopliae avaliado neste experimento reduziu os danos provocados pelas larvas de C. arcuata e beneficiou o rendimento de grãos de feijoeiro no campo (TEIXEIRA, 1998). Resultados semelhantes foram obtidos em casa-de-vegetação através da pulverização de quatro isolados de B. bassiana e quatro isolados de M. anisopliae no solo em doses equivalentes a 500 e 1.000 g de conídios / ha ou de sua aplicação nas sementes em doses equivalentes a 250 e 500 g de conídios / 60 kg de sementes, tendo sido os isolados eficientes no controle de larvas de 1° instar de C. arcuata (QUINTELA et al. 1990). A patogenicidade das estirpes CP 1 e CP 7 de B. bassiana e E 6 e Phil 7 de M. anisopliae para larvas de C. arcuata também foi confirmada pela aplicação dos isolados na superfície do solo, junto ao colo de plantas de caupi (SÁ et al., 1989). A estirpe de B. bassiana FHD 13 destacou-se em bioensaio entre dezesseis isolados de fungos, causando a mortalidade de até 70% das larvas de 3° instar de D. speciosa Germar (CONSOLO et al. 2003). A aplicação de B. bassiana e M. anisopliae no solo reduziu a emergência de adultos e os danos causados por larvas de D. undecimpunctata Howardi às raízes de milho (Zea mays L.), sendo que a concentração estável de 2,7 x 105 UFC (unidades formadoras de colônia) de M. anisopliae / cm3 de solo preveniu os danos provocados pelas larvas aos coletos e raízes e evitou a emergência de adultos, comparando-se à testemunha sem inseto (KRUEGER & ROBERTS, 1997).

A utilização de estirpes de fungos isoladas de Cerotoma sp. ou de outros crisomelídeos pode ter favorecido a susceptibilidade das larvas aos isolados testados. GARCIA et al. (1999) avaliaram a toxidade de dez estirpes de B. bassiana para larvas de Epilachna varivestis (Mulsant) (Coleoptera: Coccinellidae) e constataram que as estirpes provenientes de coleópteros foram mais tóxicas do que as isoladas de insetos de outras ordens.

As estirpes de B. thuringiensis CG 904, CG 946 e CG 948 reduziram em até 30% o número de larvas de C. arcuata, sem diferir da testemunha (Figura 3). A variação natural verificada por SIEGFRIED et al. (2005) na susceptibilidade de larvas provenientes de gerações e populações distintas de D. virgifera virgifera LeConte à toxina de B. thuringiensis, provavelmente, foi limitada pela utilização de larvas de C. arcuata provenientes de mesmas população e geração.

A estirpe de B. thuringiensis CG 940 foi patogênica para 70% das larvas de C. arcuata (Figura 3), cujo pH intestinal está na faixa de seis a sete, sendo considerada eficiente para o seu controle. Apesar de o pH intestinal alcalino ter sido considerado por alguns autores como determinante para a susceptibilidade das larvas de insetos ao B. thuringiensis (WILSON & BENOIT, 1993), estudos posteriores da interação entre a delta-endotoxina Cry 1C e as vesículas fosfolipídicas revelaram que a capacidade da toxina de aumentar a permeabilidade da membrana foi incrementada quando o pH do meio era menor do que cinco (BUTKO et al., 1994). Cristais de B. thuringiensis var. san diego dissolveram em pH maior que 10 e menor que 4, sendo que a solubilização em pH ácido foi mais lenta, porém com a mesma eficiência. Além disso, a toxidade das soluções ácida e alcalina para a larva de 3° instar de Crysomela scripta Fabricius foi igual (KOLLER et al., 1992), indicando que um valor de pH não-alcalino do intestino do inseto não impede que o inseto seja susceptível ao B. thuringiensis. D. speciosa apresenta pH intestinal considerado baixo para a expressão da delta-endotoxina, estando este na faixa entre cinco e seis (SILVA-WERNECK et al. 1995). Entretanto, a susceptibilidade de Diabrotica spp. às toxinas de B. thuringiensis é amplamente estudada. Experimentos avaliam a expressão de novas delta-endotoxinas em milho transgênico (MOELLENBECK et al., 2001; AL-DEEB & WILDE, 2005), variações mais letais das toxinas (VAUGHN et al., 2005), mecanismos responsáveis pela seletividade da toxina para D. undecimpunctata (GALITSKY et al., 2001), assim como os efeitos em insetos não-alvos (AL-DEEB & WILDE, 2003). Esses exemplos indicam que a faixa neutra de pH do intestino das larvas de C. arcuata não impede que o inseto seja controlado com o patógeno B. thuringiensis, como verificado neste experimento pela mortalidade causada pela estirpe CG 940. A eficácia de B. thuringiensis no controle de C. ruficornis em batata no campo foi confirmada pela paralização de larvas e adultos ocorrida uma hora após a aplicação de uma suspensão de 1,4 g de esporos / L, resultando em ganhos de 32% no rendimento da cultura (AMBANG et al., 2002)

CONCLUSÕES

Os isolados CG 156 e CG 213 de B. bassiana e CG 321 de M. anisopliae causaram maior mortalidade de larvas de C. arcuata, sendo mais eficientes no controle deste inseto do que todos os isolados de B. thuringiensis testados.

A susceptibilidade de larvas de C. arcuata a isolados de B. bassiana, M. anisopliae e B. thuringiensis selecionados em bioensaios mostra perspectivas promissoras para seu uso no solo, em condições de campo.

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro durante a execução do trabalho. A Bruno Rezende Silva, pela revisão do abstract.

Recebido para publicação 13.02.05

Aprovado em 28.06.06

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  15 Jan 2007
• Data do Fascículo
  Fev 2007

Histórico

• Aceito
  28 Jun 2006
• Recebido
  13 Fev 2005